猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒。
背景技术：2.口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)引起的,发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。fmdv属于小核糖核酸病毒科，口疮病毒属。根据病毒的血清学特性，目前已知全世界有7个主型：a、o、c、南非1、南非2、南非3和亚洲i型。同一血清型内又有若干个不同的亚型，各血清型之间几乎没有交叉免疫性，同一血清型内各亚型之间仅有部分交叉免疫性。
3.口蹄疫是亚洲、非洲和南美洲许多发展中地区偶蹄类动物最具传染性和经济破坏性的疾病之一，我国流行的口蹄疫以a型和o型为主，预防监测和免疫扑杀是我国目前防控口蹄疫的主要手段。我国动物免疫使用的主要为口蹄疫病毒o型-a型二价疫苗。oie推荐的检测口蹄疫抗体的标准方法为中和试验，但中和试验需要使用活病毒，需在特殊实验室完成，且操作费时，酶联免疫吸附分析法具有操作试验操作简便、检测速度快的优点，因此得到广泛应用。市场上已经有许多检测单一抗体类型的商品化elisa试剂盒，但这些elisa方法常常不能满足临床检测的需求，无法判定抗体类型，不利于确认可疑动物、无感染动物和免疫效力的评价。vp1抗体的产生时间和应答水平存在个体差异，有时在免疫或感染的猪机体内并不能检测到vp1抗体或vp1抗体产生的时间延迟，所以，其结果会出现假阴性，准确性不高。对于那些已经免疫后又感染的动物，由于具有中和抗体使得病毒的复制很慢，导致体内具有很低浓度的特异性蛋白，但商品化的elisa试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，导致部分感染动物漏检。因此，需要一种更敏感性、高效的检测方法，对预防和控制口蹄疫的发生和流行将具有重要意义。
4.微孔板式化学发光免疫分析技术(clia)是在放射性免疫和酶联免疫分析的基础上逐渐发展建立的，具有试验材料易获取，对试验环境、设备及人员的要求较低、试验操作简便、检测速度快等优点。但是化学发光不需要不需要额外的光源或背景荧光，所有的能量都来自于样本本身的化学反应，消除了背景影响，避免了外来因素(光源稳定性、光散射、光波选择器)的干扰，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。同时光信号强度和待测物质的浓度呈线性关系，可以根据仪器的标定曲线，精确算出待测物的浓度。因此敏感性、特异性、稳定性和安全性上明显优于放射性免疫和酶联免疫分析方法。
5.目前市面上同时检测和区分猪口蹄疫o型和a型抗体检测的基于化学发光免疫分析方法制备的微孔板式试剂盒还没有。本试剂盒为口蹄疫的诊断提供了更加灵敏、便捷、有效、快速的检测方法，而且更适用于低浓度样本的检测以及疾病的早期诊断，对应预防和控制口蹄疫的发生和流行具有十分重要的意义。
技术实现要素：6.针对猪口蹄疫病毒检测所面临的问题，本发明拟提供一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，该试剂盒相对于市场上常用的试剂盒产品，敏感性更高，特异性更强，可以区分猪口蹄疫o型和a型抗体类型，诊断能力亦优于其他市售产品。
7.一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包括化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、o型阳性对照血清、a型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物a、发光底物b和10倍浓缩洗涤液；
8.所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，奇数列包被猪口蹄疫病毒o型vp1纳米抗体蛋白，偶数列包被猪口蹄疫病毒a型vp1蛋白；
9.所述包被过程为：将o型vp1纳米抗体蛋白加入到ph＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/ml，以100ul/孔的加样量将蛋白包被液加入到奇数列化学发光板中。将a型vp1纳米抗体蛋白加入到ph＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/ml，以100ul/孔的加样量将蛋白包被液加入到偶数列化学发光板中，2-8℃孵育16-18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150ul/孔的5％bsa-pbst进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2-8℃保存；
10.所述o型vp1纳米抗体蛋白为重组蛋白，其氨基酸序列为：lqewgaglyswalkptselsltpgkgdqwgqgtlvtvlewiygswirqpgeiwnhdgfnpvaslksqfslkslsvtataadvyycaegrwedslrvtisvdtsnnsknnssastkg(seq id no.1)；
11.所述a型vp1纳米抗体蛋白为重组蛋白，其氨基酸序列为：lqerravtldglqesggtpggavckalslsgfifssydmawvrqapskgyvleasissggsftyygaavkggrtiisrdgtngqstvrlqlnraedagtfycakaadsdnlyawsadnidawghevivssldkg(seq id no.2)；
12.所述血清稀释液为含5％(v/v)酪蛋白和0.5％(v/v)tween-20的磷酸盐缓冲液，ph＝7.4。
13.所述发光底物a为含有0.1mmol/l的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/l、ph＝8.0的tris缓冲液；
14.所述发光底物b为含有0.07mmol/l的维生素c和3mmol/l氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/l、ph＝5.2的醋酸铵溶液。
15.所述10倍浓缩洗涤液为0.02mol/l的磷酸二氢钠、0.08mol/l的磷酸氢二钠、1.37mol/l的氯化钠和0.5％(v/v)tween-20，ph＝7.4。
16.所述的一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液1：50倍稀释，取100ul分别加入到化学发光包被板奇数列和偶数列中，同时在奇数列设置o型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，在偶数列设置a型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％bsa-pbst稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪igg抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物a和发光底物b，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
17.所述的一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其优势在于：利用该试剂盒可以检测口蹄疫病毒感染或接种疫苗后产生的结构蛋白vp1抗原，判断被检动物是否感染口蹄疫病毒或接种疫苗，与口蹄疫病毒非结构蛋白试剂盒联用，不仅能区
分病毒感染及疫苗免疫动物，同时能区分出vp1抗原类型。其敏感性、特异性、稳定性好，尤其适用于低浓度样本的检测以及疫病的早期诊断。
附图说明
18.上述仅是本发明技术的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
19.图1是本发明的化学发光试剂盒样品加样记录表，其中，p(o)为o型阳性对照孔；p(a)为a型阳性对照孔；n为阴性对照孔；s1，s2，s3，s4
……
等为待检样品孔，依次类推。
20.图2是本发明的化学发光试剂盒敏感性、特异性结果
21.图3是本发明的化学发光试剂盒重复性结果
22.图4是本发明的化学发光试剂盒与普通o型vp1抗体或a型vp1抗体elisa试剂盒对已知抗体阳性样本的检测结果
23.图5是本发明的化学发光试剂盒与普通elisa试剂盒对o型或a型阳性血清敏感性比对结果。
具体实施方式
24.除非特别指明，以下实施例中所用敏感性、特异性血清均可从正规渠道商购获得。
25.除非特别指明，以下实施例中所用血清样品由北京亿森宝生物科技有限公司保存。
26.实施例1一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒方法的建立
27.通过棋盘滴定的方法，确定最佳包被浓度及血清稀释倍数。其中，o型vp1纳米抗体蛋白和a型vp1纳米抗体蛋白分别做了2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml和0.1ug/ml的梯度，o型阳性对照血清、a型阳性对照和阴性对照血清分别做了1：10、1：20、1：50、1：100倍稀释。通过综合考虑光指数和信噪比，包被条件确定为o型vp1纳米抗体蛋白1ug/ml包被，a型vp1蛋白1ug/ml包被。血清稀释倍数为1：50。
28.实施例2一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒临界值的确定
29.应用本发明所述试剂盒，对已知背景的血清进行检测。利用试剂盒对100份o型阳性样品、100份a型阳性样品和150份阴性样品进行检测，计算每份样品的s/p值，采用spss 16.0软件对所有血清样本的s/p值进行分析。使用非参数法构建roc曲线，并以youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点。同时确定该试剂盒的敏感性和特异性。最终将本试剂盒的判定标准定为：s/p值＜0.45，样品判定为抗体阴性；s/p值≥0.45，样品判定为o型或a型抗体阳性。在此判定标准下，临界值对应的o型抗体检测敏感性为92.22％，特异性为93.16％；a型抗体检测敏感性为93.11％，特异性为92.54％。证明本诊断方法的准确率高，该试剂盒具有很高的诊断价值。
30.实施例3一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒灵敏度和特异性检测
31.将猪口蹄疫病毒o型和a型阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为
1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品按1：50倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，同时分别设置o型和a型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将稀释好的样品分别加入化学发光包被板的奇数列和偶数列，于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％bsa-pbst稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪igg抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物a和发光底物b，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。检测结果用s/p值来评价，s/p公式如下：s/p＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)。结果本发明的猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的敏感性，检测猪口蹄疫病毒o型和a型的灵敏度均能达到1:1024。本发明的猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的特异性，与上述猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品均无交叉反应。因此，本发明的化学发光试剂盒灵敏度高，特异性强，亲和力高，不会与其它猪常见病毒发生血清交叉学反应。具体结果见图2。
32.实施例4一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒重复性检测
33.将10个背景清楚的血清在同一个化学发光包被板上各做5个重复，计算其批内变异系数(cv)。同时将这10个背景清楚的血清在不同的3个批次化学发光包被板上做重复，计算其批间变异系数(cv)。结果批内与批间cv均小于10％，具有良好的重复性。具体结果见图3。
34.实施例5一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒稳定性检测
35.将化学发光包被板置于37℃，10天后，检测敏感性和特异性，将猪口蹄疫病毒o型和a型阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将猪瘟、猪蓝耳、猪细小、猪圆环2型、猪乙脑阳性血清样品按1：50倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，同时设置分别设置o型和a型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。结果表明，37℃保存10天，化学发光包被板的敏感性和特异性不变。因此，化学发光包被板具有良好的稳定性。
36.实施例6猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与普通o型vp1抗体elisa试剂盒和a型vp1抗体elisa试剂盒对已知o型和a型抗体均为阳性样本的检测结果
37.分别用猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与普通o型vp1抗体elisa试剂盒和a型vp1抗体elisa试剂盒检测收集的21份已知抗体阳性样本，结果化学发光试剂盒全部检出，普通o型vp1抗体elisa试剂盒检出o型抗体阳性17份，普通a型vp1抗体elisa试剂盒检出a型抗体阳性18份，化学发光试剂盒对阳性样本的检出率高于普通o型或a型vp1抗体elisa试剂盒。具体结果见图4。
38.实施例7猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与普通elisa试剂盒对o型和a型阳性血清敏感性比对结果
39.将猪口蹄疫病毒o型和a型阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048。分别用猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔
板式化学发光检测试剂盒、普通o型vp1抗体elisa试剂盒和a型vp1抗体elisa试剂盒检测各个稀释度的样本。结果化学发光试剂盒检测猪口蹄疫病毒o型和a型的灵敏度均能达到1:1024，普通o型vp1抗体试剂盒检测猪口蹄疫病毒o型的灵敏度能达到1:512，普通a型vp1抗体试剂盒检测猪口蹄疫病毒a型的灵敏度能达到1:512。化学发光试剂盒灵敏度更高。具体结果见图5。
40.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
41.
技术特征：1.一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、o型阳性对照血清、a型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物a、发光底物b和10倍浓缩洗涤液，其特征在于：所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，奇数列包被猪口蹄疫病毒o型vp1纳米抗体蛋白，偶数列包被猪口蹄疫病毒a型vp1纳米抗体蛋白；所述包被过程为：将o型vp1纳米抗体蛋白加入到ph＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/ml，以100ul/孔的加样量将蛋白包被液加入到奇数列化学发光板中；将a型vp1纳米抗体蛋白加入到ph＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/ml，以100ul/孔的加样量将蛋白包被液加入到偶数列化学发光板中，2-8℃孵育16-18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150ul/孔的5％bsa-pbst进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2-8℃保存；所述o型阳性对照血清是经疫苗免疫健康猪获得的猪血清；所述a型阳性对照血清是经疫苗免疫健康猪获得的猪血清；所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪igg抗体。2.根据权利要求1所述血清稀释液为含5％(v/v)酪蛋白和0.5％(v/v)tween-20的磷酸盐缓冲液，ph＝7.4。3.根据权利要求1所述发光底物a为含有0.1mmol/l的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/l、ph＝8.0的tris缓冲液。4.根据权利要求1所述发光底物b为含有0.07mmol/l的维生素c和3mmol/l氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/l、ph＝5.2的醋酸铵溶液。5.根据权利要求1所述10倍浓缩洗涤液为0.02mol/l的磷酸二氢钠、0.08mol/l的磷酸氢二钠、1.37mol/l的氯化钠和0.5％(v/v)tween-20，ph＝7.4。6.根据权利要求1所述的一种猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液1：50倍稀释，取100ul分别加入到化学发光包被板奇数列和偶数列中，同时在奇数列设置o型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，在偶数列设置a型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％bsa-pbst稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪igg抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物a和发光底物b，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
技术总结本发明公开了一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、O型阳性对照血清、A型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。本发明所述试剂盒，能同时检测并区分O型和A型猪口蹄疫病毒，具有良好的敏感性、特异性和诊断能力，重复性与稳定性也良好。重复性与稳定性也良好。重复性与稳定性也良好。
技术研发人员：王新杰 曾政 董春霞 骆璐 陈峰 白雪冬 孙晓明 费磊 陈汇鑫 张远亮
受保护的技术使用者：重庆市动物疫病预防控制中心
技术研发日：2022.05.16
技术公布日：2022/7/5
