1.本技术涉及化学领域，具体涉及一种氨基甾体化合物及其制备方法和应用。
背景技术：2.kras(kirsten rat sarcoma viral oncogene)是一种鼠类肉瘤病毒癌基因，ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种，即h-ras、k-ras和n-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。k-ras因编码21kd的ras蛋白又名p21基因，在ras基因中，k-ras与人类癌症关系最大，它有如分子开关：当正常时能控制和调控细胞生长的路径；一旦发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我凋亡。它参与细胞内的信号传递，当k-ras基因发生突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，而使细胞内信号传导紊乱，导致细胞增殖失控而产生癌变。
3.k-ras基因突变在癌症中十分常见，大约有30％的癌症患者都存在k-ras突变，其中包括90％的胰腺癌，50％的结肠癌和25％的肺癌。在非小细胞肺癌中，k-ras基因突变占20～30％，多存在于肺腺癌中，肺鳞癌中比较罕见。
4.然而在k-ras突变类型中，g12c突变最常见，约占所有k-ras突变的44％，最常见的癌种是非小细胞肺癌。其中，kras g12c突变发生在大约13％的非小细胞肺癌(nsclc)和3％的结直肠癌中。
5.目前，k-ras蛋白抑制剂sotorasib(索托拉西布，代号为amg 510)获美国fda突破性疗法认定，用于治疗局部晚期或转移性携带kras突变的非小细胞肺癌(nsclc)患者，这些患者先前至少接受过一次全身化学治疗。
6.虽然k-ras g12c突变有药可医了，但是在实际治疗中患者和医生还不得不面临另一个难题：癌细胞会产生耐药性。而最主要的耐药机制则是，k-ras蛋白变构，小分子药物不能结合在蛋白的口袋区域，丧失对k-ras蛋白的抑制作用。
7.对此，有必要开发针对k-ras基因的小分子抑制剂，避免癌细胞对于常规蛋白药物的耐药性。
技术实现要素：8.根据本技术的一方面，提供了一种氨基甾体化合物，所述化合物包括如式i或式ii所示的化学式中的至少一种，
[0009][0010]
其中，r1、r2、r3、r4、r5独立地选自h、含卤素基团、c1～c
10
的烷基、c2～c
10
的烯基、c2～c
10
的炔基、c3～c
10
的环烷基、c6～c
10
芳基、c5～c
10
杂芳基或如下式iii所示的基团；
[0011][0012]
其中，所述r6选自h、c1～c6的烷基、c2～c6的烯基、c2～c6的炔基、c3～c6的环烷基、c6～c
10
芳基或c5～c
10
杂芳基；
[0013]
并且r1、r2中至少一个为含卤素基团；r3、r4、r5中至少一个为含卤素基团。
[0014]
可选地，式i和式ii中卤素的数量为1至10个，具体地，卤素的数量可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。
[0015]
在本技术中，在式i的化合物中的卤素的数量为2个时，该化合物具有良好的抗癌效果；在式ii的化合物中卤素的数量为3个时，本技术的化合物具有良好的抗癌效果。
[0016]
此外，申请人出乎意料地发现，在本技术的化合物的特定位置处引入卤素时，即在本技术的化合物的r1、r2、r3、r4、r5所在的位置处引入卤素基团时，使得所得化合物与g-四连体靶点的结合位点与方式都发生了显著的变化，进而能够更加有利于所得化合物与g-四连体靶点的结合，使得所得化合物与g-四连体靶点的结合更加紧密，结合后的构象更加稳定，药理效果更好。
[0017]
进一步地，申请人还出乎意料地发现，在本技术的化合物的r1、r2、r3、r4、r5所在的位置处引入的卤素基团的种类更加多样化时，能够具有良好的抗癌的效果。具体来说，在本技术的式i的化合物中，在r1和r2均为含卤素基团并且r1的卤素和r2的卤素的种类不同时，能够具有良好的抗癌效果；在本技术的式ii的化合物中，在r3、r4和r5均为含卤素基团并且r3、r4和r5的卤素的种类不同时，能够具有良好的抗癌效果。
[0018]
可选地，所述含卤素基团选自卤素、被卤素取代的c1～c
10
的烷基、被卤素取代的c2～c
10
的烯基、被卤素取代的c2～c
10
的炔基、被卤素取代的c3～c
10
的环烷基、被卤素取代的c6～c
10
芳基、被卤素取代的c5～c
10
杂芳基或r7c(o)，其中r7选自卤素、被卤素取代的c1～c6的烷基、被卤素取代的c2～c6的烯基、被卤素取代的c2～c6的炔基、被卤素取代的c3～c6的环烷基、被卤素取代的c6～c
10
芳基或被卤素取代的c5～c
10
杂芳基。
[0019]
可选地，r2、r5独立地选自h、卤代乙酰基或卤代苯甲酰基；r1、r3、r4选自h或卤素。
[0020]
可选地，所述卤素选自f、cl、br或i。
[0021]
可选地，当式i或式ii中至少存在两个含卤素基团时，含卤素基团中的卤素可相同或不同，优选地，含卤素基团中的卤素不同；例如，当存在两个含卤素基团时，两个卤素可各自选自：f和cl；f和br；f和i；cl和br；cl和i；或br和i。
[0022]
可选地，当式i或式ii中存在至少三个含卤素基团时，优选地，含卤素基团中的卤素不同；即含卤素基团中的卤素不完全相同或完全不同。例如当存在三个含卤素基团时，三个卤素基团中的三个卤素可以完全不同，可选自：f、cl和br；f、cl和i；f、br和i；cl、br和i；三个卤素基团中的卤素也可以不完全相同，也就是说，三个卤素基团中的卤素可部分相同，例如，当存在三个含卤素基团时，其中的卤素可选自：f、f和cl；f、f和br；f、f和i；cl、cl和f；cl、cl和br；cl、cl和i；br、br和f；br、br和cl；br、br和i；cl、cl和f；cl、cl和br；cl、cl和i；i、i和f；i、i和cl；i、i和br等。
[0023]
可选地，所述r6选自被卤素取代的c1～c6的烷基、被卤素取代的c2～c6的烯基、被卤素取代的c2～c6的炔基、被卤素取代的c3～c6的环烷基、被卤素取代的c6～c
10
芳基或被卤素取代的c5～c
10
杂芳基。
[0024]
可选地，所述r2、r5独立地选自其中x选自f、cl、br或i。
[0025]
可选地，所述氨基甾体化合物包括
[0026][0027][0028]
根据本技术的另一方面，提供了以上任一所述的氨基甾体化合物的制备方法。
[0029]
可选地，所述制备方法包括：
[0030]
(a)将如下式所示的化合物与含卤素化合物反应，得到所述式i化合物或
[0031]
(b)将如下式所示的化合物与含卤素化合物反应，得到所述式ii化合物
[0032][0033]
可选地，所述制备方法包括：(1)将2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮与卤化试剂反应，得到中间体；(2)将中间体与1-(喹啉-2-酸酯基)-l-脯氨酸进行反应，得到所述氨基甾体化合物；所述卤化试剂包括被卤素取代的含卤素基团、c1～c
10
的烷基、c2～c
10
的烯基、c2～c
10
的炔基、c3～c
10
的环烷基、c6～c
10
芳基或c5～c
10
杂芳基中的至少一种；
[0034]
所述中间体的结构如下所示，
[0035][0036]
其中，r1、r2、r3、r4、r5独立地选自h、含卤素基团、c1～c
10
的烷基、c2～c
10
的烯基、c2～c
10
的炔基、c3～c
10
的环烷基、c6～c
10
芳基或c5～c
10
杂芳基；并且r1、r2中至少一个为含卤素基团；r3、r4、r5中至少一个为含卤素基团。
[0037]
可选地，上述制备方法中步骤(1)和步骤(2)可以交换顺序，例如可以先生成具有含卤素基团的式ix或式x的化合物，再生成式i或式ii的化合物；也可以先生成如下结构的化合物，
[0038][0039]
随后再进行卤代以生成式i或式ii的化合物。
[0040]
可选地，所述2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮与卤化试剂的摩尔比为1：(3～6)。
[0041]
可选地，步骤(1)中反应的条件为：温度为-5℃～100℃，时间为5～24h。
[0042]
可选地，所述卤化试剂选自氯乙酰氯、氯化铜、三甲硅基卤素乙炔、溴乙酰氯、溴化铜中的至少一种。
[0043]
可选地，所述三甲硅基卤素乙炔包括三甲硅基氟乙炔、三甲硅基氯乙炔、三甲硅基溴乙炔、三甲硅基碘乙炔。
[0044]
可选地，所述中间体与1-(喹啉-2-酸酯基)-l-脯氨酸的摩尔比为1：(1～3)。
[0045]
可选地，步骤(2)中反应的条件为：温度为-5℃～30℃，时间为8h～18h。
[0046]
可选地，在步骤(2)中还可以加入偶联试剂；所述偶联试剂包括6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯。
[0047]
根据本技术的另一方面，提供了以上任一所述的氨基甾体化合物在制备k-ras癌症基因启动子靶向抑制剂中的应用。
[0048]
根据本技术的又一方面，提供了一种基因抑制剂，所述基因抑制剂与癌症基因启动子靶向并进行特异性结合，所述基因抑制剂包括以上任一所述氨基甾体化合物。
[0049]
本技术的卤代化合物与k-ras基因的启动子结合，具体是与启动子结构中的g四连体结构结合，从而阻止启动子的启动，抑制k-ras蛋白的合成，达到抑制癌细胞生长的作用。
[0050]
根据本技术的再一方面，提供了以上任一所述的氨基甾体化合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
[0051]
根据本技术的再一方面，提供了一种制剂，包括以上任一所述的氨基甾体化合物和药学上可接受的辅料。
[0052]
可选地，所述制剂可以选用药学可接受的常用辅料，按常规用量，采用常规的制剂方法制备。
[0053]
本技术中所述的辅料可以根据不同的制剂有所不同，如口服液等液体制剂形式中
常用的表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂、助流剂等；在片剂、胶囊剂、颗粒剂等固体制剂中常用的稀释剂、崩解剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂等。
[0054]
可选地，所述辅料选自淀粉、乳糖、蔗糖、糊精、麦芽糊精、微晶纤维素、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、碳酸钙、改良淀粉、山梨醇、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲淀粉钠、羟丙基纤维素、聚维酮k30、预胶化淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、甜叶菊苷、甜菜碱、阿斯巴甜、柠檬酸、绿茶甜素、糖精钠、冰糖、蜂蜜、枸橼酸、碳酸氢钠、碳酸钠、卡拉胶、琼脂、明胶、海藻酸钠、黄原胶、瓜耳豆胶、西黄耆胶、阿拉伯胶、槐豆胶、硬脂酸、交联型聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、卡波姆、山梨酸、山梨酸钾、羟苯乙酯、苯甲醇、甘油、丙二醇中的至少一种。
[0055]
可选地，所述制剂的剂型为汤剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、咀嚼片、口服液、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。
[0056]
可选地，所述癌症包括肺癌、胰腺癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、脑癌、食管癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌中的一种或多种。
[0057]
可选地，所述癌症为胰腺癌。
[0058]
本技术的氨基甾体化合物，通过卤素的引入，能够与k-ras基因的启动子中g四连体进行良好的结合，与g四连体具有更大的结合口袋，使得结合更加紧密，从而增强了对k-ras基因启动子g四连体结构的抑制作用，进一步抑制了癌基因k-ras蛋白的表达，促使癌细胞死亡，达到治疗癌症的目的。本发明针对k-ras基因启动子g四连体结构的抑制作用，从本质上来说，其不是用于抑制k-ras蛋白，而是阻止k-ras基因的启动子的启动，进而抑制kras蛋白的合成，故而不会产生蛋白变构的耐药性，所以其抑制优于k-ras蛋白抑制剂。
附图说明
[0059]
图1是本技术卤代化合物抑制k-ras基因的机理图。
[0060]
图2是本技术中2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(索托拉西布，amg510)对a549细胞增殖活性及k-ras基因表达的影响结果图；
[0061]
a、b、c：不同浓度的2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(索托拉西布，amg510)与a549细胞共培养24h、48h或96h后的影响结果图；横坐标为对照组、amg510和ck1002；纵坐标为细胞活性，单位为％；
[0062]
d：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)对于a549细胞的抑制曲线图；横坐标为ck1002浓度对数，无单位；纵坐标为od值，无单位；
[0063]
e：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(amg510)与a549细胞共培养24h后对k-ras基因水平的影响结果图；横坐标为对照组、amg510(50μm)和ck1002(100μm)；纵坐标为k-ras基因表达水平，以对照组为标准；
[0064]
f：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(amg510)与a549细胞共培养48h后对k-ras基因水平的影响结果图；横坐标为对照组、amg510(50μm)和ck1002(50μm)；纵坐标为k-ras基因表达水平，以对照组为标准；
[0065]
g：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(amg510)与a549细胞共培养96h后对k-ras基因水平的影响结果图；横坐标为对照组、amg510(50μm)和ck1002(50μm)；纵坐标为k-ras基因表达水平，以对照组为标准。
[0066]
图3是本技术中2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮和k-ras蛋白抑制剂sotorasib对panc-1细胞增殖活性及k-ras基因表达的影响结果图；
[0067]
a、b、c：不同浓度的2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(amg510)与panc-1细胞共培养24h、48h或96h后的影响结果图；横坐标为对照组、amg510和ck1002；纵坐标为细胞活性，单位为％；
[0068]
d：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)对于panc-1细胞的抑制曲线图；横坐标为ck1002浓度对数，无单位；纵坐标为od值，无单位；
[0069]
e：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(amg510)与panc-1细胞共培养24h后对k-ras基因水平的影响结果图；横坐标为对照组、amg510(50μm)和ck1002(100μm)；纵坐标为k-ras基因表达水平，以对照组为标准；
[0070]
f：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(amg510)与panc-1细胞共培养48h后对k-ras基因水平的影响结果图；横坐标为对照组、amg510(50μm)和ck1002(50μm)；纵坐标为k-ras基因表达水平，以对照组为标准；
[0071]
g：2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(ck1002)和k-ras蛋白抑制剂sotorasib(amg510)与panc-1细胞共培养96h后对k-ras基因水平的影响结果图；横坐标为对照组、amg510(50μm)和ck1002(50μm)；纵坐标为k-ras基因表达水平，以对照组为标准。
[0072]
图4为本技术中2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮和k-ras蛋白抑制剂sotorasib对a549肺癌荷瘤小鼠的肿瘤体积的影响结果图；横坐标为天数，单位为天；纵坐标为肿瘤体积，单位为mm3。
[0073]
图5是本技术对比例2的化合物与k-ras基因g四连体的对接结果图；a：全貌图；b：图a中白色圆圈内的局部放大图。
[0074]
图6是本技术实施例5的化合物与k-ras基因g四连体的对接结果图；a：全貌图；b：图a中白色圆圈内的局部放大图。
具体实施方式
[0075]
现将参考附图中对实施方式进行详细的描述。尽管结合附图和相关描述来对实施方式进行了描述，但是并不旨在将范围限制于本文公开的实施方式。相反，其目的是涵盖所有替代、改动和等同形式，而不必将范围限制于本文公开的具体实施方式。
[0076]
如图1所示，在本技术中，通过利用本发明的化合物作为小分子抑制剂，可以与kras基因的启动子序列dna结构中易于形成的g四连体结合(k-ras基因的启动子结构是富含g碱基的序列，在启动时容易形成g四连体(g-quatruplex)结构)，从而阻止启动子的启动，抑制k-ras蛋白的合成，达到抑制癌细胞生长的作用。
[0077]
与常规的由于k-ras蛋白变构导致小分子药物不能结合在蛋白的口袋区域进而丧失对k-ras蛋白的抑制作用导致产生耐药性所不同，本技术涉及的是k-ras基因的小分子抑制剂，如果抑制发生在基因dna水平，那不管k-ras蛋白怎么变构，照样可以抑制该基因。换言之，本技术的基因抑制剂就是抑制在靶基因的根本上，理论上，不会产生蛋白抑制剂的耐药性问题。
[0078]
以下结合实施例对本技术给出进一步的说明。
[0079]
实施例1
[0080]
可通过如下两条工艺路线来制备本技术实施例1的具有下述结构iv的化合物。
[0081][0082]
工艺路线一：
[0083]
(1.1)将喹啉酸(10g，57.7mmol)溶于200ml无水dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中，加入pybop(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphate，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，36g，69.2mmol)和hobt(n-hydroxybenzotriazole，1-羟基苯并三唑，9.43g，69.2mmol)，搅拌5min后加入脯氨酸特丁酸酯，再加入dipea(n,n-二异丙基乙胺，40ml，0.22mol)。将上述溶液在室温下搅拌反应过夜12h，之后反应液倒入1l水中，用乙酸乙酯提取三次，硫酸钠干燥，蒸发后得n-(喹啉酸-2-甲酸酯)-l-脯氨酸特丁酸酯(化合物9)13.1g。
[0084]
(1.2)在150ml tfa/dcm(三氟乙酸/二氯甲烷，95:5)溶液中加入n-(喹啉酸-2-甲酸酯)-l-脯氨酸特丁酸酯(化合物9，13.0g,35.8mmol)，室温搅拌3h，蒸发干燥后得1-(喹啉-2-酸酯基)-l-脯氨酸(化合物10)13.2g。
[0085]
(1.3)将表雄酮4g(14mmol)溶于无水吡啶20ml中，加入对甲苯磺酰氯4.6g(24mmol)，搅拌反应3h后回流4h，回收吡啶后得半固体物。加入水溶液析出固体，滤集后重结晶得白色结晶，即5α-甾体-2-烯-17-酮(化合物1)，收率60％左右。
[0086]
(1.4)将8％过氧乙酸17ml，水14ml和醋酸钠1.7g混合，滴加5α-甾体-2-烯-17-酮(化合物1)的氯仿溶液(1.7g溶于13ml氯仿中)。搅拌反应17h，分离有机层，洗至中性，浓缩后的固体，重结晶后得白色结晶，即2α,3α-环氧-5α-甾体-17-酮(化合物2)，收率约70％。
[0087]
(1.5)将2α,3α-环氧-5α-甾体-17-酮(化合物2)1.0g(3.5mmol)在哌嗪5ml和水2ml中回流50h，回收哌嗪，加水溶液析出固体，滤集，重结晶后得到2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(化合物3)，收率约40％。
[0088]
(1.6)在200ml无水二乙醚中，加入三甲硅基乙炔6ml(42.3mmol)，在0度下滴入meli(1.6m in thf)，混合物在室温再搅拌1h，在0度下加入化合物2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(化合物3)(4g,10.6mmol in thf 200ml)，混合物在室温下搅拌7h，加入冰水终止反应，用乙酸乙酯提取，硫酸钠干燥，蒸发得10.3g(2β,3α,5α,17α)-2-(哌嗪-1-基)雄甾-20-乙炔-3,17-二醇(化合物6)，结构如下；
[0089]
[0090]
(1.7)在430ml无水dmf中加入1-(喹啉-2-酸酯基)-l-脯氨酸(化合物10)(11.4g，30.7mmol)和hctu(2-(6-chloro-1h-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetra methylaminium hexa-fluorophosphate，2-(6-氯-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸酯，12.7g，30.7mmol)，溶液搅拌5min，然后加入(2β,3α,5α,17α)-2-(哌嗪-1-基)雄甾-20-乙炔-3,17-二醇(化合物6)(10.3g，25.6mmol)和dipea(26.7ml,153.4mmol)，室温搅拌反应过夜，混合物倒入2l水中，用乙酸乙酯提取三次，硫酸钠干燥，有机相减压蒸发得到5.75g(35％)的{4-[(2β,3α,5α,17α)-3,17-二羟基雄甾-20-炔-2-基]哌嗪-1-基}[(2s)-1-(喹啉-2-甲酸酯)脯氨酸-2-基]甲酸酯(化合物11)，结构如下。
[0091][0092]
(1.8)向反应瓶中投入196mg化合物11、10ml二氯甲烷和0.38ml三乙胺，搅拌溶解。然后缓慢加入190mg氯乙酰氯。室温搅拌反应过夜。反应完全后，浓缩干，残余物加二氯甲烷稀释，依次用水，饱和氯化铵水溶液，碳酸钾水溶液和饱和食盐水洗涤，减压浓缩至干。残余物通过柱层析纯化(dcm/meoh＝150/1)，得实施例1的化合物iv，其为黄色粉末，收率41％。
[0093]
经检测，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.22(t,j＝9.0hz,1h),8.15
–
7.93(m,2h),7.84(d,j＝8.1hz,1h),7.77
–
7.68(m,1h),7.62
–
7.52(m,1h),5.75and5.33(m,1h),5.18
–
5.08(m,1h),4.33
–
4.18(m,1h),4.06(d,j＝17.9hz,2h),4.02
–
3.85(m,1h),3.77
–
3.68(m,1h),3.62(s,1h),3.22(d,j＝70.9hz,2h),2.81(d,j＝41.8hz,1h),2.58(d,j＝3.1hz,1h),2.54
–
2.12(m,5h),1.99(ddd,j＝20.9,15.4,6.5hz,8h),1.76
–
1.41(m,13h),1.03(s,1h),0.92(s,2h),0.89
–
0.86(m,3h),0.85
–
0.83(m,3h)。
[0094]
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ170.45,170.28,166.92,166.78,154.50,149.34,149.30,146.09,145.60,139.09,139.07,136.97,136.87,130.04,129.92,129.74,129.63,129.44,128.46,128.43,128.07,127.78,127.75,127.65,127.59,124.51,123.62,121.92,119.18,119.00,87.78,62.48,59.24,54.55,50.60,47.01,41.39,41.31,39.07,36.09,35.98,35.73,35.12,34.58,32.83,32.07,31.65,31.58,30.34,30.29,29.84,29.50,29.15,23.20,22.83,22.63,20.93,14.26,13.36,12.97,1.29,1.16.
[0095]
质谱(ms，ei)，c
42h53
cln4o5，728.8。
[0096]
工艺路线二：
[0097]
除了对工艺步骤的次序进行如下调整之外，以与工艺路线一相同的方法制备实施例1的化合物iv：从化合物(3)(2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮)开始，在工艺路线一中，首先引入乙炔以获得化合物(6)((2β,3α,5α,17α)-2-(哌嗪-1-基)雄甾-20-乙炔-3,17-二醇)，随后引入含有喹啉和脯氨酸的部分以获得化合物11({4-[(2β,3α,5α,17α)-3,17-二羟基雄甾-20-炔-2-基]哌嗪-1-基}[(2s)-1-(喹啉-2-甲酸酯)脯氨酸-2-基]甲酸酯)，最后进行卤代以获得实施例1的化合物iv；在工艺路线二中，在化合物(3)中首先引入含卤素基
团以获得具有如下结构的化合物(12)，随后引入乙炔以获得化合物(13)，最后引入含有喹啉和脯氨酸的部分以获得实施例1的化合物iv：
[0098][0099]
实施例2
[0100]
可通过如下两种工艺路线来制备本技术实施例2的具有下述结构v的化合物。
[0101][0102]
工艺路线一：
[0103]
(2.1)
[0104]
从化合物(3)(2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮)开始，通过酰化反应，将该化合物(3)与1-(喹啉-2-酸酯基)-l-脯氨酸(化合物10)反应，在该化合物中引入1-(喹啉-2-基-羰基)-l-脯氨酸部分，以产生如下具有如下结构式的化合物d
[0105][0106]
(2.2)向反应瓶中投入313mg的化合物d、447mg溴化铜和20ml甲醇，升温至80℃回流反应15小时。将反应液冷却至室温，加水和二氯甲烷，搅拌十分钟，分液。有机相用饱和食盐水洗涤一次，减压浓缩至干。残余物通过柱层析纯化(dcm/meoh/nh4oh＝100/1/0.1)，得157mg实施例2的化合物，其为黄色粉末，收率44％。
[0107]
经检测，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.22(dd,j＝12.6,8.5hz,1h),8.14
–
7.91(m,2h),7.87
–
7.80(m,1h),7.77
–
7.67(m,1h),7.63
–
7.51(m,1h),5.85 and 5.34(m,1h),5.10 and 4.52(m,1h),4.30
–
3.29(m,7h),3.08(s,1h),2.80
–
1.39(m,24h),1.08(d,j＝13.3hz,2h),0.92(s,1h),0.88(dd,j＝5.1,2.5hz,3h),0.86
–
0.81(m,3h)。
[0108]
质谱(ms，ei)，c
38h49
brn4o4，704.7。
[0109]
工艺路线二：
[0110]
除了对工艺步骤的次序进行如下调整之外，以与工艺路线一相同的方法制备实施例2的化合物v：从化合物(3)(2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮)开始，在工艺路线一中，首先引入含有喹啉和脯氨酸的部分以获得化合物d，随后进行卤代以获得实施例2的化合物v；在工艺路线二中，在化合物(3)中首先引入含卤素基团以获得具有如下结构的化合物(14)，随后引入含有喹啉和脯氨酸的部分以获得实施例2的化合物v：
[0111][0112]
实施例3
[0113]
可通过下述步骤制备本技术实施例3的具有下述结构vi的化合物。
[0114][0115]
以与实施例1中工艺路线一相同的方法制备上述结构vi的化合物，不同之处在于：在步骤(1.6)中，用三甲硅基氯乙炔替代其中的三甲硅基乙炔，并且由于卤素已经连接到乙炔上，所以此处省略其中步骤(1.8)的卤化过程。对由此获得的化合物vi进行表征如下。
[0116]
经检测，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(dd,j＝12.3,8.6hz,1h),8.13
–
7.92(m,2h),7.85
–
7.79(m,1h),7.72(m,1h),7.62
–
7.52(m,1h),5.86 and 5.11(m,1h),4.23
–
3.11(m,8h),2.77
–
2.58(m,2h),2.51
–
2.04(m,5h),2.01
–
0.98(m,22h),0.86(2s,3h),0.82(2s,3h),0.76
–
0.64(m,1h)。
[0117]
质谱(ms，ei)，c
40h51
cln4o4，687.1。
[0118]
实施例4
[0119]
可通过如下两条工艺路线来制备本技术实施例4的具有下述结构vii的化合物。
[0120][0121]
工艺路线一：
[0122]
(4.1)以与(1.6)中相同的方法，从化合物3(2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮)出发，在其中引入乙炔，以得到如下结构的(2β,3α,5α,17α)-2-(哌嗪-1-基)雄甾-20-乙炔-3,17-二醇(化合物6)
[0123][0124]
(4.2)以与(1.7)中相同的方法，在化合物6中引入含有喹啉和脯氨酸的部分以获得化合物(15)
[0125][0126]
(4.3)以与(2.2)中相同的方法，在化合物15中引入卤素溴原子，以得到实施例4的具有结构式vii的化合物。
[0127]
经检测，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(dd,j＝12.3,8.6hz,1h),8.14
–
7.91(m,2h),7.86
–
7.78(m,1h),7.73(m,1h),7.61
–
7.51(m,1h),5.84 and 5.08(m,1h),4.22
–
3.10(m,9h),2.76
–
2.57(m,2h),2.56(2s,1h),2.51
–
2.04(m,5h),2.01
–
0.98(m,20h),0.87(2s,3h),0.81(2s,3h),0.77
–
0.63(m,1h)。
[0128]
质谱(ms，ei)，c
40h51
brn4o4，731.0。
[0129]
工艺路线二
[0130]
除了对工艺步骤的次序进行如下调整之外，以与工艺路线一相同的方法制备实施例4的化合物vii：从化合物(3)(2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮)开始，在工艺路线一
中，首先引入乙炔以获得化合物(6)((2β,3α,5α,17α)-2-(哌嗪-1-基)雄甾-20-乙炔-3,17-二醇)，随后引入含有喹啉和脯氨酸的部分以获得化合物15，最后进行卤代以获得实施例4的化合物vii；在工艺路线二中，在化合物(3)中首先引入含卤素基团以获得具有如下结构的化合物(16)，随后引入乙炔以获得化合物(17)，最后引入含有喹啉和脯氨酸的部分以获得实施例4的化合物vii：
[0131][0132]
实施例5
[0133]
可通过如下两种工艺路线来制备本技术实施例5的具有下述结构viii的化合物。
[0134][0135]
工艺路线一：
[0136]
(5.1)以与(1.6)中相同的方法制备具有下述结构(17)的化合物，不同之处在于：用三甲硅基氟乙炔替代其中的三甲硅基乙炔
[0137][0138]
(5.2)以与(1.7)中相同的方法，在化合物(17)中引入含有喹啉和脯氨酸的部分，以获得具有下述结构(18)的化合物
[0139][0140]
(5.3)以与(1.8)中相同的方法，在化合物(18)中引入含有卤素即含有氯的部分，以获得具有下述结构(19)的化合物
[0141][0142]
(5.4)以与(2.2)中相同的方法，在化合物(19)中引入卤素溴原子，以获得实施例5的具有结构式viii的化合物。
[0143]
经检测，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.22(t,j＝9.0hz,1h),8.16
–
7.93(m,2h),7.84(d,j＝8.1hz,1h),7.76
–
7.68(m,1h),7.62
–
7.51(m,1h),5.74 and 5.33(m,1h),5.17
–
5.08(m,1h),4.33
–
4.20(m,1h),4.06(d,j＝17.9hz,2h),4.02
–
3.89(m,1h),3.75
–
3.69(m,1h),3.22(d,j＝70.9hz,2h),2.81(d,j＝41.8hz,1h),2.59(d,j＝3.1hz,1h),2.53
–
2.12(m,4h),1.99(ddd,j＝20.9,15.4,6.5hz,8h),1.77
–
1.41(m,13h),1.02(s,1h),0.93(s,2h),0.89
–
0.86(m,3h),0.85
–
0.82(m,3h)。
[0144]
质谱(ms，ei)，c
42h51
brclfn4o5，824.9。
[0145]
其他工艺路线：
[0146]
在进行工艺步骤(5.1)以获得结构(17)的化合物之后，对上述工艺步骤(5.2)至(5.4)的次序可以进行调整，即，可以先进行卤代以引入卤素，随后引入含有喹啉和脯氨酸的部分，以获得实施例5的具有结构式viii的化合物。
[0147]
实施例6 本发明化合物口服片剂的制备
[0148]
每片含该实施例1化合物40mg，片剂组成如下：
[0149][0150]
将以上成份混匀(除硬脂酸镁外)，过120目筛，加入温热蒸馏水搅拌，然后制粒，干燥，加入硬脂酸镁混匀，压片即得。
[0151]
对比例1
[0152]
对比例1的化合物为即，化合物3。
[0153]
采用实施例1中的工艺路线一中的步骤(1.3)至(1.5)，制得上述化合物3。
[0154]
对比例2
[0155]
对比例2的化合物为
[0156]
即，化合物11。
[0157]
采用实施例1中的工艺路线一中的步骤(1.3)至(1.7)，制得上述化合物11。
[0158]
对比例3
[0159]
对比例3的化合物为
[0160]
即，化合物d。
[0161]
采用实施例2中的工艺路线一中的步骤(2.1)，制得上述化合物d。
[0162]
对比例4
[0163]
对比例4的化合物为kras蛋白抑制剂sotorasib(索托拉西布)(amg-510)。
[0164]
性能测试
[0165]
1、本技术的化合物和对比例的化合物对于体外抗a549(人非小细胞肺癌细胞)和panc-1(人胰腺癌细胞)增殖活性及其对k-ras基因表达的影响
[0166]
主要试剂：dmem高糖培养基(普诺赛，who1122012xp01)、rpmi1640培养基(普诺赛，who1122007xp)、胎牛血清(bioexplorer，2041296)、0.25％胰蛋白酶溶液(普诺赛，eho1122012sp01)、青霉素-链霉素溶液(普诺赛，who1122009xp)、磷酸盐缓冲液(普诺赛，who1132101sp01)、cell counting kit-8试剂(biosharp，pb180327)、总rna急速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司，220010)、cdna synthesis supermix(novoprotein，0516971)、sybr qpcr supermix plus(novoprotein，0519371)、amg510(mce，2296729-00-3)。
[0167]
主要仪器：显微镜，co2培养箱，超净工作台，多功能酶标仪，nanodrop浓度测量仪，bio-rad荧光定量pcr仪，高速低温离心机，高温压力灭菌锅，无酶tip头及移液器等。
[0168]
细胞培养：a549细胞培养于含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液中，panc-1细胞培养于含10％fbs的rpmi1640培养基中；置于37℃、5％co2培养箱中培养，当培养瓶内细胞生长到80％-90％时，采用胰酶消化细胞进行传代，取对数生长期细胞进行实验。
[0169]
cck8法检测细胞活性：将a549细胞(约5000个/孔)或panc-1细胞(约6000个/孔)接种至96孔板中，次日贴壁后，按照实验设计加入10μl不同浓度(0.01μm、0.1μm、1μm、10μm、100μm，溶剂为dmso)的cki002(即，化合物3)或amg510(即，kras蛋白抑制剂sotorasib)处理，同时设对照组(不加药，换成相应体积的dmso)，每组设5个复孔，培养24h、48h或96h后，每孔加入cck8溶液10μl，37℃避光孵育1～4h，在450nm波长处测定吸光度值，并计算半数抑制浓度值(ic
50
值)。
[0170]
rt-pcr法检测k-ras基因表达
[0171]
细胞总rna提取：使用6孔板培养并加药处理细胞24h、48h、96h后(以10-6
mol/l的剂量加药，与细胞共同培养)，采用总rna抽提试剂盒按照说明书提取总rna，采用nanodrop浓度测量仪测定总rna浓度，调整浓度至500-1000ng/μl，保存于-80℃冰箱中。
[0172]
rna逆转录(使用20μl体系)：取1μg总rna并加入depc水(用焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的超纯水)调至12μl，65℃变性5min；在前一步混合液中加入4μl 4*reagent(即，4倍x的dna分解酶试剂)，37℃孵育5min去gdna；在前一步混合液中加入4μl 5*reagent，37℃15min、50℃5min、98℃5min逆转录；取逆转录产物pcr，于-20℃保存。
[0173]
qpcr(使用20μl体系)：取逆转录后的cdna，稀释5倍备用；kras基因引物工作液浓
度10μm；准备qpcr mix+primer(其中，qpcr mix是指试剂中的cdna synthesis supermix(novoprotein，0516971)，primer指前后引物序列)混合液，每孔按mix 10μl、primer f/r各1μl统一配置；合理布板，冰上操作，每孔加入12μl上述混合液；分别加入不同处理组模板cdna 2μl，depc水补足20μl；设置扩增参数：预热95℃3min，扩增(循环*40)95℃15s、60℃30s；计算各基因的相对表达水平。结果见图2和图3。
[0174]
如图2所示，2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(化合物3，也称为cki002)与amg-510相比，相同浓度时，2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮具有更好的抑制细胞增殖的效果，并且能够下调k-ras基因表达，与对照组和amg-510具有更加显著的差异。如图3所示，在针对panc-1细胞增殖方面，2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(化合物3，也称为cki002)具有较好的抑制效果，但是在抑制k-ras基因表达方面并没有较好的优势。panc-1(胰腺癌)细胞中通常会发生k-ras基因的突变，因此，可以推测，2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(化合物3，本文中又称为cki002)与amg-510对于胰腺癌的治疗机理类似，均是针对k-ras蛋白进行抑制，并非是针对k-ras基因抑制。
[0175]
2、本技术的化合物和对比例的化合物对于a549肺癌荷瘤小鼠的影响
[0176]
spf级balb/c-nu裸鼠70只，雌雄各半，体重：12.0～15.0g，选取10只小鼠作为空白组，其余小鼠用于制备肺癌荷瘤小鼠。取对数生长期a549肺癌细胞1
×
107/ml0.2ml接种于60只balb/c-nu裸鼠右侧腋下，待肿瘤体积达到100mm3以上，选取50只小鼠按肿瘤体积随机分为9组，分别为：模型对照组、amg510对照组(30mg/kg)和对比例1化合物3的低、中、高剂量组(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，每组10只，各组小鼠分别腹腔注射给予相应药液，给药体积为20ml/kg，每天1次，连续给药14天，正常对照组和模型对照组腹腔注射同体积溶媒。每周称重1次，并统计小鼠每周摄食量和饮水量；给药后每3天用游标卡尺检测肿瘤的长和宽，并计算肿瘤体积和相对肿瘤增殖率；末次给药后，处死小鼠，取脾脏和肿瘤组织，计算脏器系数。结果如图4所示，下表1也示出了化合物3对a549肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积的影响。
[0177]
表1：化合物3对a549肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积的影响
[0178][0179]
结果表明：
[0180]
(1)动物生存质量及存活时间评价：化合物3低、中、高剂量组小鼠死亡率分别为10％、20％、20％。
[0181]
(2)化合物3对a549肺癌荷瘤小鼠体重、摄食量和摄水量的影响：化合物3低、中、高剂量对小鼠体重、摄食量和摄水量无明显影响。
[0182]
(3)化合物3对a549肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积的影响：化合物3低剂量能明显减少小
鼠在给药d7、d13、d14肿瘤体积，化合物3中、高剂量能明显减少小鼠在给药d4-14肿瘤体积；化合物3低、中、高剂量给药第14天时相对肿瘤增值率为61.57％、58.58％、50.75％，表明化合物3在给药13天后，低、中、高剂量组也均呈现上升的趋势，表明也在小鼠体内产生了抗药性；相比之下，amg510在给药10天后，就对肿瘤的抑制效果大大降低，肿瘤体积急剧增加。
[0183]
(4)化合物3对a549肺癌荷瘤小鼠肿瘤重量、脾脏脏器系数的影响：化合物3高剂量能小鼠明显降低肿瘤重量和瘤体比，化合物3低、中剂量对小鼠肿瘤重量、瘤体比均呈下降趋势，但无统计学差异。化合物3低、中、高剂量对小鼠脾脏脏器系数无明显影响。
[0184]
上述结果表明：化合物3对a549肺癌荷瘤小鼠有明显抑瘤作用，减少小鼠的死亡率，但是后期均出现了耐药性的问题。
[0185]
针对上述问题，本技术在2β-哌嗪基-3α-羟基-5α-甾体-17-酮即化合物3的基础上进行了改进，如前所述，制备得到了本技术实施例1～5的化合物，下面对实施例化合物和对比例化合物的性能进行检测。
[0186]
3、分子模拟
[0187]
moe(molecular operating environment，分子操作环境)是由加拿大化学计算集团公司chemical computing group ulc.开发的针对制药和生命科学的综合软件系统。它是一个综合的应用环境和技术开发平台，集可视化、模拟和应用开发于一体。该系统根据分子与靶点之间的静电参数、氢键结合、分子吸引、分子轨道等等参数计算得到分子与靶点之间结合的分数，该分数越负，表明其结合后的自由能越低、构象越稳定、结合越好，该系统同时还可以示出分子与靶点之间的具体结合构象。
[0188]
以下通过moe，进行实施例1～5和对比例1～3的化合物与g-四连体的对接模拟并对该对接结果打分。其中，k-ras基因启动子dna g-四连体的pdb文件从rcsb网站下载获得，氨基甾体卤素化合物的pdb结构文件由chembiodraw软件产生。对接结果如表2所示，图5和图6进一步示出了进行卤素取代后的化合物与g-四连体结合的构象。
[0189]
表2：各化合物与g四连体的对接打分
[0190][0191][0192]
由表2可知，各实施例1～5的化合物与g四连体对接的打分小于对比例，如前所述，
该打分是根据分子与靶点之间的静电参数、氢键结合、分子吸引、分子轨道等等参数计算得到；该分数越负，表明其结合后的自由能越低、构象越稳定、结合越好，因此本技术的化合物与g四连体的结合优于对比例化合物。
[0193]
进一步地，如图5和图6所示，实施例5中的化合物由于引进了卤素，从而使得该分子与g-四连体靶点的结合位点和方式均与对比例2不同，更有利于与靶点的紧密结合、自由能更低。本技术的化合物中含有卤素等强吸电子基团，遇上富含电子的g-四连体时，可形成强的静电作用。通过图6可以看出，实施例5化合物中的卤素与g-四连体进行了较好的结合，相对于图5的对接，使得与靶点结合的口袋更大，增加了结合位点，从而进一步增强对于g-四连体的抑制。
[0194]
4、实施例1化合物针对a549细胞中k-ras蛋白的下调作用
[0195]
采用人鼠类肉瘤病毒基因的蛋白(kras)酶联免疫分析(elisa)试剂盒测定。其原理为，应用双抗体夹心法测定标本中kras蛋白水平。用纯化的kras蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗体，在微孔中加入含kras蛋白的样品蛋白，再与hrp标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，然后用tmb显色，用酶标仪在450nm波长下检测od值，颜色与含量正相关，通过标准曲线计算kras蛋白含量。
[0196]
将10μl实施例1化合物处理细胞5d后，同时设置对照组(仅加入相同体积的dmso)；收集细胞，加入细胞裂解液破碎细胞，提取细胞总蛋白，测定时校正每孔的蛋白含量，制作标准曲线，计算k-ras蛋白含量，以ng/mg比较每组的差异。
[0197]
表3：实施例1的化合物针对a549细胞中k-ras蛋白的下调作用
[0198]
ꢀꢀ
实验条件k-ras蛋白含量空白对照04.3787ng/mg实施例1化合物0.6μm处理5天2.6797ng/mg
[0199]
如表3所示，实施例1的化合物能够明显抑制k-ras蛋白含量，从4.3787ng/mg降低至2.6797ng/mg，降低了38.8％；另外，尽管a549细胞中k-ras基因较易突变，但是本技术实施例1化合物仍能够以较低浓度产生较大的降低效果，说明本技术的化合物能够突破常规药物的耐药性，具有更好的发展前景。
[0200]
5、本技术的化合物和对比例的化合物针对胰腺癌(panc-1)细胞的抑制作用
[0201]
将panc-1细胞培养于含10％fbs的rpmi1640培养基中，将上述培养基置于37℃、5％co2培养箱中培养；当培养瓶内细胞生长到80％-90％时，采用胰酶消化细胞进行传代，取对数生长期细胞进行实验。
[0202]
将上述处于对数生长期的panc-1细胞(约6000个/孔)接种至96孔板中，次日贴壁后按照实验设计加入10μl不同浓度的实施例1化合物、对比例1化合物和对比例2化合物处理，同时设对照组(仅加入相同体积的dmso)，每组设5-6个复孔，培养72h后，每孔加入cck8溶液10μl，37℃避光孵育1～4h，在450nm波长处测定吸光度值，并计算半数抑制浓度值(ic
50
值)。
[0203]
不同浓度的化合物制备方法：将各实施例和对比例的化合物均采用dmso进行配制，母液浓度均配制为100mm，采用旋涡振荡器震荡20min助溶。配制浓度分别为：100μm、30μm、10μm、3μm、1μm、0.3μm、0μm。
[0204]
通过上述方法，可以得到：针对panc-1，本技术实施例1的化合物的ic50值为1.532
μm，实施例2的化合物的ic50值为7.628μm，对比例1的化合物的ic
50
值为58.06μm，对比例2化合物的ic
50
值为2.575μm；由上述对比可知，实施例1的化合物对于panc-1的抑制效果远远高于对比例1化合物，且高与对比例2化合物，并且如前所述，由于本技术的化合物是直接与k-ras基因中的g四连体结合，所以其不仅具有良好的抑制胰腺癌细胞的作用，而且还克服了对比例1化合物产生耐药性的问题。
[0205]
6、本技术实施例化合物针对其他肿瘤细胞的抑制作用
[0206]
将癌细胞(du145、a549和hct-116)培养于含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液中，将上述培养液置于37℃、5％co2培养箱中培养；当培养瓶内细胞生长到80％-90％时，采用胰酶消化细胞进行传代，取对数生长期细胞进行实验。
[0207]
将癌细胞(约5000个/孔)接种至96孔板中，次日贴壁后按照实验设计加入10μl不同浓度(100μm、30μm、10μm、3μm、1μm、0.3μm、0μm)的实施例化合物处理，同时设对照组(仅加入相同体积的dmso)，每组设5-6个复孔，培养72h后，每孔加入cck8溶液10μl，37℃避光孵育1～4h，在450nm波长处测定吸光度值，并计算半数抑制浓度值(ic
50
值)。计算结果如表4所示。
[0208]
表4：各实施例化合物对各个癌细胞的ic
50
值
[0209][0210]
du145为前列腺癌细胞，a549为肺癌细胞，hct-116为结肠癌细胞。
[0211]
如表4所示，本技术的氨基甾体化合物针对前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞都显示出了很好的抑制作用，部分ic
50
甚至达到10μm以下，并且能够对多种癌症均具有良好的抑制作用，在治疗和预防癌症具有良好的前景。
[0212]
7、本技术的化合物对kras基因表达的抑制作用
[0213]
对本技术实施例1的化合物对kras基因表达的抑制作用进行试验如下。
[0214]
7.1.细胞接种：
[0215]
取常规培养的处于对数生长期的人非小细胞肺癌细胞a549，用0.25％的胰酶消化，收集细胞，调整细胞密度至2
×
104个/ml，以2.5ml/孔接种至6孔板；
[0216]
7.2.细胞处理：
[0217]
待细胞贴壁后，用各细胞对应的完全培养基将实施例1的化合物配制成3μm的工作液，弃去细胞原培养液后，换用配制好的实施例1的化合物的工作液，2.5ml/孔，并设置溶媒对照孔；
[0218]
7.3.细胞收获：
[0219]
分别于实施例1的化合物工作液处理细胞后的24h、48h、96h，用胰酶消化并收集细胞；
[0220]
7.4.细胞总rna提取：
[0221]
采用动物组织总rna提取试剂盒提取细胞的总rna，并测定rna浓度；
[0222]
7.5.kras基因扩增：
[0223]
7.5.1试剂准备：合成特异性引物，并用ddh2o配制成100μm。完全融化特异性引物、模板rna，以及一步法rt-pcr试剂盒中的相应试剂，置于冰浴上；
[0224]
引物信息如下表5所示。
[0225]
表5：引物信息
[0226][0227]
7.5.2反应体系配制如下表6所示。
[0228]
表6：反应体系
[0229]
组成成分反应体系2
×
fastking one step rt-pcr mastermix(一步法荧光定量rt-pcr)12.5μl25
×
rt-pcr enzyme mix(酶混合物)2μl上游特异性引物(10μm)0.625μl下游特异性引物(10μm)0.625μlrna模板100ngrnase free ddh2o(无rnase核糖核酸酶的二次蒸馏水)补至50μl总体系25μl
[0230]
7.5.3 pcr反应条件如下表7所示。
[0231]
表7：pcr反应条件
[0232][0233][0234]
7.5.4电泳分析：配制1.5％的琼脂糖溶液，按0.01％的比例加入gel-red(凝胶
红)，待温度降至60℃左右，制备成琼脂糖凝胶。将pcr反应完成的产物，以10μl/孔加入至梳子孔中，在tbe缓冲液中电泳，电泳电压设置为90v，待蓝色条带电泳至离凝胶底部约1cm处结束电泳，置于凝胶成像系统下检测kras基因和gapdh基因表达情况。
[0235]
7.5.5 pcr条带分析：采用image j软件对凝胶条带进行分析，测量积分光密度值，计算kras的相对灰度值。
[0236]
7.6.试验结果如下表8所示。
[0237]
表8：试验结果
[0238][0239]
由上述可见，本技术实施例1的化合物iv对人非小细胞肺癌细胞a549分别作用24,48,96小时，可以使kras癌基因明显下调，这与该类化合物抑制kras基因启动子g-四连体的作用机理有关。此外，如前所述，申请人出乎意料地发现，本技术的进行卤代后的氨基甾体化合物对于肿瘤细胞的抑制发生在基因dna水平，其实质上是k-ras基因的小分子抑制剂，在这种情况下，不管k-ras蛋白怎么变构，都可以抑制该基因，故而不会产生蛋白抑制剂的耐药性问题。
技术特征：1.一种氨基甾体化合物，其特征在于，所述氨基甾体化合物的结构式如式i或式ii所示，其中，r1、r2、r3、r4、r5独立地选自h、含卤素基团、c1～c
10
的烷基、c2～c
10
的烯基、c2～c
10
的炔基、c3～c
10
的环烷基、c6～c
10
芳基、c5～c
10
杂芳基或如式iii所示的基团；其中，所述r6选自h、c1～c6的烷基、c2～c6的烯基、c2～c6的炔基、c3～c6的环烷基、c6～c
10
芳基或c5～c
10
杂芳基；并且r1、r2中至少一个为含卤素基团；r3、r4、r5中至少一个为含卤素基团。2.根据权利要求1所述的氨基甾体化合物，其特征在于，所述r1、r2、r3、r4、r5独立地选自h或含卤素基团。3.根据权利要求1或2所述的氨基甾体化合物，其特征在于，所述含卤素基团选自卤素、被卤素取代的c1～c
10
的烷基、被卤素取代的c2～c
10
的烯基、被卤素取代的c2～c
10
的炔基、被卤素取代的c3～c
10
的环烷基、被卤素取代的c6～c
10
芳基、被卤素取代的c5～c
10
杂芳基或r7c(o)-；其中，所述r7选自卤素、被卤素取代的c1～c6的烷基、被卤素取代的c2～c6的烯基、被卤素取代的c2～c6的炔基、被卤素取代的c3～c6的环烷基、被卤素取代的c6～c
10
芳基或被卤素取代的c5～c
10
杂芳基。4.根据权利要求1所述的氨基甾体化合物，其特征在于，r1、r3、r4独立地选自h或卤素；
r2、r5独立地选自h、卤代乙酰基或卤代苯甲酰基。5.根据权利要求1所述的氨基甾体化合物，其特征在于，所述卤素选自f、cl、br或i。6.根据权利要求1所述的氨基甾体化合物，其特征在于，所述氨基甾体化合物包括
7.一种制备权利要求1～6中任一项所述的氨基甾体化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)将如下式所示的化合物与含卤素化合物反应，得到所述式i化合物或(b)将如下式所示的化合物与含卤素化合物反应，得到所述式ii化合物8.权利要求1～6中任一项所述的氨基甾体化合物在制备k-ras癌症基因启动子靶向抑制剂中的应用。9.权利要求1～6中任一项所述的氨基甾体化合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中
的应用。10.一种k-ras癌症基因启动子靶向基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂包括权利要求1～6中任一项所述的氨基甾体化合物。
技术总结本申请提供了一种氨基甾体化合物及其制备方法和应用，所述氨基甾体化合物包括如式I或式II所示的化学式中的至少一种，其中，R1、R2、R3、R4、R5独立地选自H、含卤素基团、C1～C
技术研发人员：何群 刘喜荣 吴四清 唐杰 李龙 袁飞鹏 罗桂芳
受保护的技术使用者：湖南醇健制药科技有限公司
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/7/5
