1.本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株具有广谱抗菌活性的食窦魏斯氏菌。
背景技术：2.现有技术中为了延缓食品变质速度，提高产品货架期，通常采用的方式是添加化学防腐剂。但是该方式首先不符合国家倡导的绿色、环保、可持续发展的主题，再者长期食用含有化学防腐剂的食品，很有可能造成消费者肠道菌群紊乱，进而影响其健康。
3.乳酸菌是公认的食品级安全微生物，碳水化合物进行发酵的过程中，代谢产物包括蛋白质，多肽类物质，有机酸及其他具有抑菌活性的物质。这些抑菌物质能够抑制食物中腐败菌及食源性致病菌的生长繁殖，并且其自身不会对人体造成损害。因此研究乳酸菌类微生物防腐剂成为当前热门课题。
4.魏斯氏菌(weissella)属于乳酸菌(lactic acid bacteria)，其在微生物学、医药学、发酵、工业及食品加工等方面的作用近年来开始受到研究者的关注。现有研究中发现绿色魏斯氏菌对多种细菌具有抑制作用，如：肉毒杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌，这一特性将有助于提高食品的保质期及微生物安全；bake等发现在大米生面团的发酵过程中，融合魏斯氏菌能抑制三种真菌的生长，分别为枝孢菌、脉孢菌、皮壳青霉。但是，目前关于既能抑制真菌又能抑制细菌的具有广谱抗菌活性的魏斯氏菌属的研究甚少见报道。
技术实现要素：5.本发明的目的是提供一株具有广谱抗菌活性的食窦魏斯氏菌，以解决上述现有技术存在的问题，该菌株能在体外抑制产黄青霉、杂色曲霉和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌的生长繁殖，具有广谱抗真菌和细菌活性。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一株具有广谱抗菌活性的食窦魏斯氏菌(weissella cibaria)byl4.2，其已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no：m 20211696，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2021年12月29日。
8.本发明还提供一种上述食窦魏斯氏菌byl4.2在制备抑菌产品中的应用。
9.进一步地，所述抑菌包括抑制真菌和/或细菌活性。
10.进一步地，所述真菌包括产黄青霉和/或杂色曲霉，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和/或铜绿假单胞菌。
11.进一步地，所述抑菌产品的活性成分为所述食窦魏斯氏菌byl4.2。
12.本发明还提供一种抑菌产品的制备方法，包括将上述食窦魏斯氏菌byl4.2进行液体发酵，收集发酵液的步骤。
13.进一步地，所述液体发酵条件为：发酵温度为37℃，发酵时间为24h，发酵培养基为mrs液体培养基。
14.进一步地，还包括如下步骤：将所述发酵液以4℃，8000
×
g离心15min，过滤收集发酵上清液，即得抑菌产品。
15.进一步地，所述抑菌产品包括抑制产黄青霉、杂色曲霉、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和/或铜绿假单胞菌的产品。
16.本发明还提供一种上述食窦魏斯氏菌byl4.2在制备改善肠道环境和/或食品保鲜防腐产品中的应用。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.本发明公开的食窦魏斯氏菌byl4.2是从泡菜中分离得到的，实验证明，该食窦魏斯氏菌byl4.2能在体外抑制产黄青霉、杂色曲霉和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌的生长繁殖，具有广谱抗真菌和细菌活性；且对红霉素、利福平等抗生素敏感，安全性较高，在胃酸和肠道高胆盐环境中生存率高。由此可见本发明公开的食窦魏斯氏菌byl4.2可制备成抑菌产品，并在改善肠道环境及食品的防腐保鲜领域具有潜在的应用前景。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为本发明的食窦魏斯氏菌byl4.2分离纯化后的菌落形态图；
21.图2为本发明的食窦魏斯氏菌byl4.2的镜检菌体形态图；
22.图3为本发明的食窦魏斯氏菌byl4.2构建的系统发育树结果图；
23.图4为本发明的食窦魏斯氏菌byl4.2生长曲线和ph变化曲线结果图；
24.图5为本发明的食窦魏斯氏菌byl4.2产黄青霉和杂色曲霉的抑菌效果图；
25.图6为本发明的食窦魏斯氏菌byl4.2在不同处理条件下的抗真菌稳定性结果，其中a为热处理，b为酶处理，c为酸处理；
26.图7为本发明的食窦魏斯氏菌byl4.2对不同抗生素的敏感性实验结果，其中a为红霉素，b为利福平。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.实施例1菌株的分离、鉴定和保藏
33.1.菌株的分离纯化
34.以不同种类泡菜作为分离源，取样品用生理盐水进行10倍系列稀释，吸取100μl稀释液涂布到mrs琼脂培养基上，37℃培养48h，取单个产酸菌落分区划线进行纯化，连续纯化单菌落三代以上(见图1)。
35.2.菌株byl4.2的鉴定
36.挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色和镜检，在光学显微镜下观察菌体形态。菌株byl4.2为杆状、革兰氏阳性(见图2)，然后基于16s rdna测序对其进行分子鉴定。使用ezup柱式细菌基因组dna抽提式试剂盒从菌体培养物中提取dna。扩增16s rdna基因引物为细菌通用引物27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’。反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。使用sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物进行纯化。纯化产物送至长春库美生物科技有限公司进行测序。测序结果如下(seq id no.1)：
37.gctcagatatgacgatggacattgcaaagagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggaaacctacctcttagcaggggataacatttggaaacagatgctaataccgtataacaatagcaaccgcatggttgctacttaaaagatggttctgctatcactaagagatggtcccgcggtgcattagttagttggtgaggtaatggctcaccaagacgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaagggtttcggctcgtaaaacactgttgtaagagaagaatgacattgagagtaactgttcaatgtgtgacggtatcttaccagaaaggaacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgttccaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggttatttagtctgaagtgaaaagccctcactcaactgacgaattgctttggaaactggatgacttgagtgcagtagaggaaagtggaactccctgtgtagcggtgaaatgcgaagatatttggaaaaaacaccaatgggcgaagcgggtttctggcgcaacccttatttttagttaccaccattcagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggcgtatacaacgagttgccaacccgcgagggtgagctaatctcttaaagtacgtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaaca。
38.将测序结果使用blast进行序列比对分析。利用neighbor-joining方法构建系统发育树(图3)，明确菌株byl4.2为食窦魏斯氏菌(weissella cibaria)。
39.3.菌株byl4.2的保藏
40.菌株byl4.2的分类命名为食窦魏斯氏菌(weissella cibaria)，已于2021年12月
29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号：cctcc no：m 20211696。
41.实施例2食窦魏斯氏菌byl4.2的性能验证
42.1.食窦魏斯氏菌byl4.2的生长曲线和ph变化曲线
43.以1％接种量将菌株byl4.2接种于mrs肉汤中，37℃静置培养24h，每2h取样测定od
600nm
及ph值，检测菌株byl4.2在24h内的生长变化和ph变化情况，结果如图4。可见菌株byl4.2的延滞期较短，2h即进入对数生长期，12h左右进入稳定期。ph值在对数生长期变化较大，12h进入稳定期后ph值下降到4.5左右。
44.2.食窦魏斯氏菌byl4.2的抗真菌活性
45.将产黄青霉、杂色曲霉接种在pda固体培养基上，置于28℃培养3d至培养基上长出大量孢子。加入少量无菌水，用无菌涂布棒刮取培养基上的孢子，然后用无菌纱布过滤去除菌丝，利用血球计数板进行计数，然后用无菌水调整孢子悬液的浓度至107个/ml备用。
46.以产黄青霉和杂色曲霉为指示菌，采用琼脂覆盖法测定菌株的抗真菌活性。将mrs固体培养基倒入培养皿制作下层平板，将菌株byl4.2接种在下层平板上划两条3cm长的直线，置于37℃恒温培养箱中培养24h，将含105个霉菌孢子/ml的pda固体培养基倒在下层平板上，轻轻摇晃使上层培养基均匀分布于整个平板，将平板水平放置20min左右，待其彻底凝固时置于28℃恒温培养箱培养72h。观察菌株byl4.2周围的霉菌生长情况，根据抑菌范围大小，与霉菌生长情况进行比较，判定食窦魏斯氏菌byl4.2对真菌的抑制效果，由图5可以得知，与对照组相比，实验组byl4.2菌线周围出现占平板总面积50％以上的抑菌圈，说明菌株byl4.2对产黄青霉和杂色曲霉均具有极显著的抑菌效果，可以有效地抑制两种霉菌的生长。
47.3.食窦魏斯氏菌byl4.2无细胞上清液(cfs)的抗真菌作用
48.将食窦魏斯氏菌byl4.2稳定期的发酵液以4℃，8000
×
g离心15min，经0.22μm滤膜过滤制得无细胞上清液(cell free supernatant,cfs)，4℃保存备用。
49.将食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs分别稀释到50μl/ml、25μl/ml、12.5μl/ml、6.25μl/ml、3.12μl/ml、1.56μl/ml，无菌培养皿中分别加入上述不同浓度的cfs和10μl霉菌孢子悬液，然后倒入20ml pda培养基充分混合均匀，每组3皿，待培养基凝固后，倒置于28℃培养48h，观察霉菌的生长情况，以完全无菌生长的最低浓度作为食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs抗真菌的最低抑菌浓度(mic)。食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs拮抗产黄青霉的mic为12.5μl/ml，拮抗杂色曲霉的mic为3.12μl/ml。
50.4.食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs抗真菌的稳定性
51.以食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs作为对照，同时进行cfs不同条件的热处理、酸处理和蛋白酶作用，利用96孔微量滴定板比较byl4.2-cfs抗真菌的稳定性。
52.(1)热处理
53.将byl4.2-cfs于60℃、80℃、100℃、121℃处理20min。在96孔板孔中分别取10μl浓度为107个/ml的霉菌孢子悬液加入到140μbyl4.2-cfs或等量的mrs液体中，分别在孔中加入150μl mrs液体培养基使其总体系为300μl，28℃培养48h，测定od
600nm
。结果显示，与byl4.2-cfs相比，60℃处理后抑菌效果无显著变化；80℃处理后对产黄青霉的抑菌效果显著下降，对杂色曲霉的抑菌效果无显著变化；100℃和120℃处理后对两种霉菌抑菌效果均
有显著影响。综上，热处理后byl4.2-cf的抑制霉菌活力并没有因为热处理而丧失，说明byl4.2-cfs具有热稳定性(见图6a)。
54.(2)蛋白酶作用
55.将byl4.2-cfs调至胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶k的最适ph，将三种蛋白酶以2mg/ml的终浓度分别加入到适宜ph的byl4.2-cfs中，于37℃温育2h，再将体系放置于100℃沸水中5min使酶失活，待温度降到室温之后，调整到最初的ph。在96孔板孔中分别加入100μl浓度为107个/ml的霉菌孢子悬液和100μl蛋白酶处理的byl4.2-cfs或等量的mrs液体，28℃培养48h，测定od
600nm
。结果显示除了蛋白酶k对byl4.2-cfs有一定作用外，其他蛋白酶不影响byl4.2-cf的抑制霉菌活力(见图6b)。
56.(3)过氧化氢处理排除
57.将byl4.2-cfs调至过氧化氢酶的最适ph，将过氧化氢酶以2mg/ml的终浓度加入到调过ph的byl4.2-cfs中，于37℃温育2h，放置于100℃沸水中5min使酶失活，待温度降到室温之后，调整到最初的ph。在96孔板孔中分别加入10μl浓度为107个/ml的霉菌孢子悬液和140μl过氧化氢酶处理的byl4.2-cfs或等量的mrs液体，28℃培养48h，测定od
600nm
。结果显示过氧化氢酶对byl4.2-cfs有一定作用，推测byl4.2-cfs的抑菌效果中可能有少量过氧化氢起作用(见图6b)。
58.(4)酸处理
59.调整byl4.2-cfs的ph至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在96孔板孔中分别取10μl浓度为107个/ml的霉菌孢子悬液加入到140μl调整好ph的byl4.2-cfs或等量的mrs液体中，分别在孔中加入150μlmrs液体培养基使其总体系为300μl，28℃培养48h，测定od
600nm
。结果显示与byl4.2-cfs相比，ph值为5、6、7时的byl4.2-cfs抑菌效果具有极显著差异，当ph值升高时抑菌效果明显降低(见图6c)。
60.综上所述，推测食窦魏斯氏菌byl4.2的主要抑菌物质为酸类物质，而非蛋白质或肽类物质。
61.5.食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs的有机酸含量分析
62.取食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs 5ml，加入25％(v/v)偏磷酸溶液1ml，充分混匀后置-20℃冷冻过夜，解冻后样品以12000r/min离心10min；取上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液上机进行hplc分析。以标准品保留时间定性，峰面积外标法定量。色谱柱：sepax carbomix h-np:7.8mm*300mm，5μm粒径；柱温：60℃；流动相：2.5mm硫酸水溶液，含5％乙腈(v/v)；流速：0.50ml/min；检测器：示差折光检测器。检测结果如表1所示：
63.表1食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs的有机酸含量
64.[0065][0066]
根据表1可知食窦魏斯氏菌byl4.2-cfs中乳酸、柠檬酸和乙酸含量较高，其中乳酸含量最多；其次为酒石酸、甲酸、丙酸和异丁酸；苹果酸、琥珀酸和丁酸含量较少。说明乳酸等有机酸对霉菌的抑制活性贡献较大。
[0067]
6.食窦魏斯氏菌byl4.2的抗致病性细菌活性
[0068]
以大肠杆菌、金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌作为指示菌，采用双层琼脂扩散法测定菌株byl4.2对致病菌的抑制作用。首先，以0.5％的无菌琼脂水溶液在培养皿底层打底，待琼脂凝固后在上面均匀摆放牛津杯，再倒入20ml含有指示菌的lb固体培养基，待培养基凝固后取出牛津杯，在其形成的孔内加入0.2ml的byl4.2-cfs，37℃下培养24h后测量其抑菌圈直径。结果如表2所示：
[0069]
表2食窦魏斯氏菌byl4.2对四种致病菌的抑菌作用
[0070][0071]
根据表2可知，食窦魏斯氏菌byl4.2对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌等多种致病性细菌均有明显的抑制作用。
[0072]
7.食窦魏斯氏菌byl4.2的抗生素抗性实验
[0073]
将食窦魏斯氏菌byl4.2以1％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h后，吸取100μl菌悬液涂布于mrs固体培养基上，干燥后分别镊取多种抗生素测试纸片贴于培养基表面，在37℃条件下培养24h后测其抑菌圈直径。图7a-b结果显示菌株byl4.2对红霉素、利福平等抗生素敏感。
[0074]
8.食窦魏斯氏菌byl4.2的乳酸菌耐酸耐胆盐能力
[0075]
(1)耐酸能力
[0076]
取100μl活化后的菌液接种至10ml mrs液体培养基中，37℃静置培养24h，取1ml菌液8000r/min离心10min弃上清，收集菌体。将菌体重新悬浮于等体积、ph分别为3、4、5的mrs液体培养基中，37℃培养3h，分别在0h、1h和3h取样，采用mrs固体培养基涂布法，37℃静置培养48h后，采用平板菌落计数法计算菌落数(见表3)。
[0077]
表3食窦魏斯氏菌byl4.2在不同ph条件下的菌落数
[0078][0079]
根据表3可知菌株byl4.2对酸性环境具有一定的耐受性。
[0080]
(2)耐胆盐能力
[0081]
取100μl活化后的菌液接种至10ml mrs液体培养基中，37℃静置培养24h，取1ml菌液8000r/min离心10min弃上清，收集菌体。将菌体重新悬浮于等体积、胆盐浓度分别为0.1％、0.2％的mrs液体培养基中，37℃培养3h，分别在0h、1h和3h取样，采用mrs固体培养基涂布法，37℃静置培养48h后，采用平板菌落计数法计算菌落数(见表4)。
[0082]
表4食窦魏斯氏菌byl4.2在不同浓度胆盐条件下的菌落数
[0083][0084]
根据表4可知菌株byl4.2对胆盐具有一定的耐受性。
[0085]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术特征：1.一株具有广谱抗菌活性的食窦魏斯氏菌(weissella cibaria)byl4.2，其特征在于，其已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no：m 20211696，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2021年12月29日。2.一种权利要求1所述食窦魏斯氏菌byl4.2在制备抑菌产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑菌包括抑制真菌和/或细菌活性。4.根据权利要求3所述的的应用，其特征在于，所述真菌包括产黄青霉和/或杂色曲霉，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和/或铜绿假单胞菌。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑菌产品的活性成分为所述食窦魏斯氏菌byl4.2。6.一种抑菌产品的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1所述食窦魏斯氏菌byl4.2进行液体发酵，收集发酵液的步骤。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述液体发酵条件为：发酵温度为37℃，发酵时间为24h，发酵培养基为mrs液体培养基。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：将所述发酵液以4℃，8000
×
g离心15min，过滤收集发酵上清液，即得抑菌产品。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述抑菌产品包括抑制产黄青霉、杂色曲霉、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和/或铜绿假单胞菌的产品。10.一种权利要求1所述食窦魏斯氏菌byl4.2在制备改善肠道环境和/或食品保鲜防腐产品中的应用。
技术总结本发明公开了一株具有广谱抗菌活性的食窦魏斯氏菌，属于微生物领域。该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20211696，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2021年12月29日。本发明公开的食窦魏斯氏菌BYL4.2是从泡菜中分离得到的，实验证明，该食窦魏斯氏菌BYL4.2能在体外抑制产黄青霉、杂色曲霉和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌的生长繁殖，具有广谱抗真菌和细菌活性；且对红霉素、利福平等抗生素敏感，安全性较高，在胃酸和肠道高胆盐环境中生存率高，在改善肠道环境及食品的防腐保鲜领域具有潜在的应用前景。保鲜领域具有潜在的应用前景。保鲜领域具有潜在的应用前景。
技术研发人员：姚笛 王晓宇 张丽媛
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2022/7/5
