1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种裂殖壶菌高产二十二碳六烯酸发酵方法及其应用。
背景技术：2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，简称dha)是一种无毒副作用、食用安全的ω-3型多不饱和脂肪酸，俗称脑黄金，在促进人体视觉器官、大脑发育以及治疗心脏疾病、炎症、癌症、焦虑症等方面具有独特的生理功能，尤其对处于生长发育阶段的婴幼儿健康至关重要。但由于人体内部缺乏
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9以上脂肪酸脱氢酶，无法自行合成dha，只能通过外部摄取。目前，dha产品主要来源于深海鱼油，但产品质量会随鱼种类、捕捞季节、地点的差异而不同，且易受环境污染。研究表明鱼类体内的dha成分是通过食物链蓄积获得，主要来源于海洋微生物。能够合成dha的海洋微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壶菌(thraustochytrium)、裂殖壶菌(schizochytrium)和隐甲藻(crypthecodinium)等。以微生物发酵法制备dha，具有生长周期短，易于大规模培养，不饱和脂肪酸成分单一，分离纯化简便等优点，有望替代鱼油成为dha主要来源。
4.裂殖壶菌是一种异养型海洋真菌，可以在细胞内大量积累油脂，油脂中脂肪酸组成简单，dha含量较高，是具有较大商业开发潜力的dha发酵生产菌株。裂殖壶菌可利用多种碳源，葡萄糖因价格低廉，常被用作裂殖壶菌生产dha的底物。然而，为了进一步提高dha的产量并降低生产成本，许多研究已经开始探索使用甘油作为底物对裂殖壶菌生产dha的影响。在一些研究中，裂殖壶菌利用甘油可以获得更高的dha产量；也有一些研究也表明，甘油和葡萄糖的混合碳源可以促进dha的积累。
技术实现要素：5.本发明提供了一种裂殖壶菌高产二十二碳六烯酸发酵方法及其应用。本发明采用葡萄糖、甘油两种碳源进行裂殖壶菌发酵生产dha，初始培养基中葡萄糖浓度为20-60g/l，当料液中葡萄糖浓度降至10-5g/l时，一次补加或分次补加60-120g/l的甘油，比单独葡萄糖发酵可提高细胞油脂脂肪酸中dha的比例，比单独甘油发酵发酵周期短，显著提高了裂殖壶菌生产dha的生产效率，具有良好的实际应用之价值。
6.裂殖壶菌能够利用葡萄糖、甘油等碳源在细胞胞内积累dha油脂。发明人研究发现裂殖壶菌以葡萄糖为碳源，底物消耗速率快，发酵周期短，但油脂脂肪酸中的dha等多不饱和脂肪酸含量偏低，而以甘油为碳源油脂脂肪酸中的dha等多不饱和脂肪酸含量较高，但底物消耗速率相对较慢，发酵周期长。本发明系统研究了葡萄糖和甘油两种碳源对裂殖壶菌发酵生产dha油脂的影响。研究发现葡萄糖和甘油按比例混合作为发酵原料，两种碳源消耗
会相互抑制，发酵周期比单独甘油原料还长；如果先用葡萄糖培养菌体，当葡萄糖耗尽后再补加甘油，发酵周期也比单独使用甘油原料长。对甘油补加时机的研究发现当发酵液中的葡萄糖浓度为5-10g/l时补加甘油可以获得最佳效果。基于上述研究成果，从而完成本发明。
7.具体的，本发明的技术方案如下：
8.首先，本发明提供一种裂殖壶菌高产二十二碳六烯酸(dha)发酵方法，所述发酵方法包括：采用葡萄糖和甘油两种碳源分段发酵方法对裂殖壶菌进行发酵培养；具体的，先用葡萄糖为碳源对裂殖壶菌进行培养，当葡萄糖浓度降至5-10g/l时补加甘油。
9.其中，所述葡萄糖初始浓度控制为20-60g/l，优选为20-40g/l，较低的糖浓度更有利于菌体生长。
10.补加甘油时的甘油总浓度控制为60-120g/l，可以一次补加，也可以分次补加，一次补加甘油浓度优选为100g/l，甘油有利于细胞积累dha。
11.其次，本发明提供上述发酵方法在生产二十二碳六烯酸(dha)中的应用。如前所述，采用本发明的发酵方法，可以显著提高裂殖壶菌生产dha的生产效率，既能缩短发酵时间，同时还能提高细胞油脂中二十二碳六烯酸(dha)的比例，进而提高dha的发酵产量。
12.需要说明的是，经试验验证，上述发酵方法和策略对裂殖壶菌具有普适性，因此可适用于任意裂殖壶菌的dha发酵。
13.以上技术方案的有益技术效果：
14.上述技术方案通过控制甘油补加时机解决了葡萄糖、甘油同时存在相互抑制的问题，能够充分发挥了葡萄糖、甘油对裂殖壶菌产dha的各自优势，既能有效缩短发酵时间，同时还能显著提高dha的发酵产量，从而降低成本，提高生产效率，因此具有良好的实际生产应用之价值。
附图说明
15.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
16.图1为本发明实施例中两种碳源单独发酵生产dha进程；其中，a为发酵过程中底物浓度变化，b为发酵过程中细胞干重变化，c为发酵过程中油脂含量变化，d为发酵过程油脂脂肪酸中dha比例的变化；
17.图2为本发明实施例中不同比例的混合碳源发酵结果；其中，a为消耗的碳源，b为细胞干重，c细胞中油脂含量，d为油脂脂肪酸中dha比例；
18.图3为本发明实施例中不同初始葡萄糖浓度的消耗进程；其中，a为发酵过程中葡萄糖浓度变化，b为发酵过程中od
600
值变化。
19.图4为本发明实施例甘油补加时机对dha发酵的影响；其中，a为发酵过程中底物浓度变化，b为发酵过程中细胞干重变化，c为发酵过程中菌体细胞油脂含量变化，d为油脂总脂肪酸中dha比例变化；
20.图5为本发明实施例葡萄糖、纯甘油单碳源发酵进程；其中，a为发酵过程中葡萄糖、甘油浓度与细胞干重的变化，b为发酵过程中油脂含量与dha比例的变化；
21.图6为本发明实施例葡萄糖、甘油双碳源分段控制发酵结果，甘油一次补加。
10g/l时再补加甘油继续发酵培养，可以获得最佳效果。
35.因此，本发明的又一具体实施方式中，提供一种裂殖壶菌利用葡萄糖和甘油两种碳源分段控制高效发酵产dha的方法，所述方法包括采用两种碳源分段对裂殖壶菌进行发酵培养；具体的，先用葡萄糖碳源对裂殖壶菌进行培养，当发酵液中葡萄糖浓度降至5-10g/l时补加甘油继续培养至发酵结束。
36.本发明的具体实施例中初始葡萄糖浓度为20-40g/l，当葡萄糖浓度降至5-10g/l时补加60-120g/l的甘油。经试验验证，采用5l发酵罐进行发酵，发酵周期为55-80小时，油脂脂肪酸中dha比例可达45.0％左右。
37.如上所述，补加甘油时的甘油总浓度控制为60-120g/l，甘油可一次补加，也可以分次补加；一次补加时优选控制甘油浓度为100g/l；分次补加每次补加甘油浓度控制为40-60g/l。
38.所述发酵方法中，控制接种量5-10％，培养温度25-30℃，通气量0.1-1m3/h，通过转速调节溶解氧饱和度0-20％。
39.本发明的又一具体实施方式中，发酵培养基中其他营养成分按照常规裂殖壶菌发酵培养基配制即可，在本发明的一个具体实施方式中，在发酵初始阶段，裂殖壶菌的发酵培养基由葡萄糖、酵母粉、谷氨酸钠和硫酸铵溶于(50％v/v)人工海水中配制而成。
40.本发明的又一具体实施方式中，所述人工海水可采用常规海洋真菌培养时所需的人工海水进行配制，在本发明的一个具体实施方式中，人工海水配方如下：氯化钠11.2g/l，氯化钾0.8g/l，硫酸镁1.9g/l，硫酸钙0.9g/l，氯化镁2.6g/l。
41.本发明的又一具体实施方式中，提供上述发酵方法在生产dha中的应用。如前所述，采用本发明的发酵方法，可以显著提高裂殖壶菌发酵生产dha的效率。
42.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
43.实施例
44.1 材料和方法
45.1.1 菌株
46.裂殖壶菌(schizochytrium limacinum)sr21(atcc mya1381)，购自美国典型培养物保藏中心。
47.裂殖壶菌(schizochytrium limacinum)sfd-1502，发明人实验室筛选获得的一株发酵产dha菌株。该菌种公众可以从山东省食品发酵工业研究设计院获得。
48.1.2培养基
49.人工海水配方：氯化钠11.2g/l，氯化钾0.8g/l，硫酸镁1.9g/l，硫酸钙0.9g/l，氯化镁2.6g/l。
50.种子培养基：葡萄糖50g/l，酵母粉20g/l，谷氨酸钠5g/l，50％v/v人工海水。
51.葡萄糖发酵培养基：葡萄糖120g/l，酵母粉11.75g/l，谷氨酸钠6.66g/l，硫酸铵1g/l，50％v/v人工海水。
52.甘油发酵培养基：甘油120g/l，酵母粉11.75g/l，谷氨酸钠6.66g/l，硫酸铵1g/l，50％v/v人工海水。
53.1.3培养方法
54.1.3.1菌种培养
55.菌种活化：将保存有裂殖壶菌菌株的甘油管接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min恒温震荡培养22h，按5％接种量再次转接到装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min恒温震荡培养17h，用于接种摇瓶。
56.1.3.2摇瓶培养
57.将摇床培养好的液体种子，按5％接种量接种到装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min恒温震荡培养。
58.1.3.3发酵罐培养
59.5l发酵罐：镇江达森发酵设备有限公司10l标准全自动发酵罐。
60.发酵控制：接种量7％，28℃，通气量0.5m3/h，罐压0.1mpa，通过转速调节溶解氧饱和度控制0-20％。
61.1.4分析和测定方法
62.1.4.1菌体浓度测定
63.发酵液经适当稀释后在640nm处测定吸光值。
64.1.4.2细胞干重的测定
65.量取一定体积的发酵液于离心管中，4000rpm离心l0min，1.0％氯化钠溶液离心洗涤两次，冻干称重。
66.1.4.3油脂含量的测定
67.称取1g干菌粉置于10ml离心管中，用5ml正己烷浸泡，并间接超声处理5min，于3000rpm离心5min，小心吸取上清于干净试管备用，重复抽提3次，将3次所得上清液合并后置于60℃烘箱，蒸干溶剂，待恒重后测定油脂含量(质量百分比)。
68.1.4.4dha含量的测定
69.取发酵液5-10ml，离心收集菌体，洗涤2次，弃去上清，然后加入4mol/l盐酸溶液4ml，混匀后沸水浴10min，冷水冷却至室温，冰浴10min，加入正己烷10ml，充分震荡1min，静置分层后，取上层清液1ml，加入内标液1ml，4mol/l koh-甲醇溶液0.2ml，剧烈震荡1min，离心分层，取上层有机相用于气相色谱分析。
70.采用安捷伦gc-7890b气相色谱仪，db-23(60mm*0.25mm*0.25mm)毛细管柱用于油脂气相色谱分析。选用高纯氮气作为载气，柱流量3.0ml/min，尾吹流量30ml/min，气化室温度250℃；检测器为fid检测器，温度280℃，氢气流速40ml/min，空气流速400ml/min；柱箱初始温度100℃，之后以25℃/min升至200℃，再以4℃/min升至230℃，保持9min；进样量为1μl，分流比为30:1。
71.采用内标法进行定量测定。
[0072][0073]
式中：ai为脂肪酸i甲酯峰面积；as为内标峰面积；f
is
为脂肪酸甲酯i相对于内标的相对校正因子；mi为脂肪酸i的相对分子质量；m
甲酯
为脂肪酸i甲酯的相对分子质量；m为待测试样质量；ms为内标的质量。
[0074]
2结果与讨论
[0075]
2.1分别以葡萄糖或甘油为碳源进行产dha裂殖壶菌培养
[0076]
实验以菌株sfd-1502为例，分别以120g/l葡萄糖和120g/l甘油为碳源进行发酵dha实验，摇瓶培养发酵进程曲线如图1所示。结果显示，以葡萄糖为碳源培养84h葡萄糖被全部消耗；而以甘油为碳源84h仍有约1/3的甘油残留，培养至120h，仍有4.76g/l残留。以葡萄糖为碳源最大生物量为47g/l，甘油为碳源最大生物量为47.75g/l，基本没有差别。以葡萄糖为碳源前期dha产量增长较快，甘油为碳源虽然dha的增长滞后于葡萄糖，但总量比葡萄糖高约38.8％。最关键的是甘油为碳源细胞油脂总脂肪酸中的dha比例一直高于葡萄糖，甘油碳源dha占总脂肪酸最高比例达47.49％，葡萄糖碳源只有37.46％。
[0077]
2.2葡萄糖、甘油按比例混合发酵
[0078]
通过上述分析发现以葡萄糖为碳源发酵周期短，但油脂总脂肪酸中dha比例低，发酵液中dha总产量低，而甘油为碳源油脂脂肪酸中dha的比例高，但发酵周期长。为发挥两种底物的优势，实验将两种底物按照不同的比例混合配制培养基，接种培养72小时取样分析，结果如图2。实验结果显示，采用两种碳源混合发酵相比葡萄糖单独发酵，总碳源消耗速率显著降低，菌体生长也受到一定程度的抑制。以葡萄糖为碳源发酵72小时葡萄糖消耗为93.7g/l的，菌体干重达到39.92g/l，而两种碳源混合发酵总碳源消耗大约只有单独使用葡萄糖的1/2，差异显著。与甘油单独发酵相比，葡萄糖存在也影响了甘油的消耗速率。油脂合成方面，两种碳源混合发酵，细胞中油脂含量明显低于葡萄糖，还不到葡萄糖底物的50％，但油脂脂肪酸中的dha比例似乎未受到影响，并随着混合碳源中甘油比例的增加而增加。结论是两种碳源混合发酵结果比单一碳源差。
[0079]
2.3葡萄糖、甘油分段发酵
[0080]
2.3.1葡萄糖消耗速率
[0081]
不同的初始葡萄糖浓度消耗进程如图3。摇瓶发酵20g/l葡萄糖大约需要24小时消耗完，40g/l葡萄糖大约需要32小时，60g/l葡萄糖大约需要44小时，三种葡萄糖浓度菌体生长趋势基本一致，20g/l初糖浓度菌体生长更快一些，培养至20小时的菌体浓度(24.32)大约是120g/l葡萄糖菌体浓度(11.56)的2倍，低糖浓度更利于菌体生长。
[0082]
2.3.2甘油添加时机选择
[0083]
分别采用20g/l、40g/l、60g/l葡萄糖浓度进行前期菌体培养，当葡萄糖耗尽时补加甘油，使总碳源浓度均为120g/l。发酵结果见表1，同样培养120小时，甘油残留量比甘油单碳源发酵还要高，甘油添加量越多残留量越高，说明葡萄糖、甘油分段发酵，当发酵液中的葡萄糖耗尽后补加甘油，结果也比单独甘油发酵效果差。
[0084]
表1葡萄糖耗尽添加甘油分段发酵结果
[0085][0086][0087]
然后发明人用40g/l的初始葡萄糖浓度对甘油添加时机进行考察。当剩余葡萄糖浓度分别降至20g/l、10g/l、5g/l、0g/l时，补加80g/l的甘油，结果如图4所示。结果显示，当剩余葡萄糖浓度为20g/l时补加甘油发酵结果和混合碳源相似，葡萄糖的存在抑制了甘油
的消耗。当葡萄糖浓度为10g/l、5g/l时补料，没有出现碳源抑制现象，葡萄糖浓度为10g/l时，底物消耗速率更快些，发酵120小时120g/l碳源已全部消耗完，发酵周期比单独使用甘油短，而且油脂中dha比例达到最值42.31％，明显高于单独使用葡萄糖。
[0088]
2.3.3初始葡萄糖浓度的选择
[0089]
分别采用20g/l、40g/l、60g/l初始葡萄糖浓度进行前期发酵，当发酵液中葡萄糖浓度降至10-5g/l时分别补加100g/l、80g/l、60g/l的甘油，发酵结果见表2。结果显示初始葡萄糖浓度为20g/l时，油脂脂肪酸中dha达到了47.19％，已经和单独甘油发酵相当。同时，初始葡萄糖浓度为20g/l时，补加甘油为量100g/l，培养120小时发酵液中已经检测不到甘油，发酵周期比甘油短，发挥了双碳源的优势。
[0090]
表2不同初始葡萄糖浓度分段发酵结果
[0091][0092]
2.3.4 5l罐双碳源分段控制一次补料发酵
[0093]
5l发酵罐(装液量3.5l)单碳源发酵结果如图5所示。与摇瓶相比，5l发酵罐发酵发酵周期明显缩短，细胞干重也略微提高，但细胞中的油脂含量以及油脂总脂肪酸中dha比例都有所降低。
[0094]
5l发酵罐葡萄糖、甘油两种碳源分段发酵一次补料发酵结果如图6所示，以20g/l的葡萄糖为初始碳源，培养约8小时发酵液中葡萄糖浓度降至8.82g/l，然后一次性补加100g/l甘油，发酵没有延滞期，甘油被快速消耗，56小时碳源被完全消耗，发酵周期比摇瓶培养缩短近1倍，油脂脂肪酸中dha比例达45.50％。
[0095]
2.3.5 5l罐双碳源分段控制多次补料发酵
[0096]
5l发酵罐葡萄糖、甘油两种碳源分段控制多次补料发酵结果如图7所示，以40g/l的葡萄糖为初始碳源，培养约20小时发酵液中葡萄糖浓度降至6.18g/l，分三次补加120g/l甘油，一次补加40g/l，发酵结果如图7所示，发酵周期80小时，生物量69.5g/l，细胞油脂含量达60.35％，油脂中dha占总脂肪酸的比例为46.28％。
[0097]
2.4菌株sfd-1502与菌株sr21双碳源dha发酵比较
[0098]
上述试验均采用菌株sfd-1502作为发酵菌，为验证上述发酵方法对裂殖壶菌的普适性，发明人对菌株sfd-1502与菌株sr21双碳源dha发酵进行比较。初始葡萄糖浓度为20g/l，摇瓶培养10小时(菌株sfd-1502发酵液葡萄糖浓度9.87g/l，菌株sr21发酵液葡萄糖浓度为9.23g/l)，一次补加甘油100g/l，菌株sfd-1502与菌株sr21 dha发酵进程如图8所示，结果显示菌株sr21采用双碳源分段控制方法，发酵行为与菌株sfd-1502相似，发酵进程平稳，碳源消耗速度正常，两菌株相比，耗糖速度和菌体干重相似，菌体量(od值)sr21菌株略高于菌株sfd-1502，细胞油脂含量、油脂中dha占总脂肪酸的比例菌株sfd-1502都略高于sr21。表明上述双碳源分段发酵方法具有裂殖壶菌普适性。
[0099]
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参
照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
技术特征：1.葡萄糖和甘油双碳源分段发酵控制方法在裂殖壶菌发酵产二十二碳六烯酸dha中的应用。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用至少包括：(a)初始培养基以葡萄糖为碳源；(b)确定适宜时机补加甘油；(c)缩短发酵周期；(d)提高油脂总脂肪酸中dha比例。3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用具体方法包括：先用葡萄糖碳源对裂殖壶菌进行培养，当葡萄糖浓度降至5-10g/l时补加甘油。4.如权利要求3所述应用，其特征在于，葡萄糖初始浓度控制为20-60g/l；补加甘油时的甘油总浓度控制为60-120g/l。5.如权利要求3所述应用，其特征在于，甘油采用一次补加或分次补加；一次补加时优选控制甘油浓度为100g/l；多次补加每次补加甘油浓度优选为40-60g/l。6.一种裂殖壶菌高产dha发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括：采用两种碳源分段发酵方法对裂殖壶菌进行发酵培养；具体的，先用葡萄糖碳源对裂殖壶菌进行培养，当葡萄糖浓度降至5-10g/l时补加甘油。7.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述葡萄糖初始浓度控制为20-60g/l；补加甘油时的甘油总浓度控制为60-120g/l。8.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，甘油采用一次补加或分次补加；一次补加时优选控制甘油浓度为100g/l；多次补加每次补加甘油浓度优选为40-60g/l。9.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法中，控制接种量5-10％，25-30℃，通气量0.1-1m3/h，相对溶解氧浓度度控制在0-20％。10.权利要求6-9任一项所述发酵方法在生产dha中的应用。
技术总结本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种裂殖壶菌高产二十二碳六烯酸发酵方法及其应用。本发明系统研究了葡萄糖和甘油两种碳源发酵对裂殖壶菌生产DHA的影响。研究发现葡萄糖和甘油按比例混合作为发酵原料，两种碳源消耗会相互抑制，生产效率比纯甘油原料还要低；如果先用葡萄糖培养菌体，当葡萄糖耗尽后再补加甘油，生产效率也比纯甘油原料要低。进而本发明通过控制甘油补加时机解决了葡萄糖和甘油两种碳源相互抑制的问题，充分发挥了双碳源各自优势，提高了裂殖弧菌生产DHA的生产效率，从而降低成本，因此具有良好的实际生产应用之价值。应用之价值。应用之价值。
技术研发人员：赵祥颖 张家祥 张华秋 刘丽萍 姚明静 赵晨 刘建军
受保护的技术使用者：山东省食品发酵工业研究设计院
技术研发日：2022.04.08
技术公布日：2022/7/5
