1.本发明涉及抗癌化学药物技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的亚铜配合物及其制备方法和应用。
背景技术：2.金属抗癌药物因其优越的性能和在生物医学诊断和治疗方面的优势而受到广泛关注。自顺铂及相关铂类药物被发现以来，人们对开发金属抗癌药物产生了极大的兴趣。目前使用的铂配合物所显示出的严重副作用促使研究人员设计和开发具有低毒性的新型过渡金属抗癌药物。过渡金属配合物因其丰富的配位几何形状和配位数、多种氧化还原态和电子性质、独特的热力学和动力学特征，以及阳离子金属离子和配体本身的固有性质，使得金属配合物在开发和研制新型金属抗癌药物方面着重要应用前景。
3.铜(cu)作为人体必需的微量元素，在维持身体健康方面发挥着至关重要的作用，在天然生物途径内源金属的基础上，毒副作用较小，耐受性较好，且铜配合物水溶性好，配位模式多变，通常表现出比其他金属化合物更好的抗癌活性及对正常细胞的较低毒性，因此铜配合物有望成为替代铂的一类新型金属抗癌药物。铜诱导细胞毒性的主要机制通常被认为与cu(ii)/cu(i)之间的氧化还原性质直接相关，由于铜(ii)诱导ros(活性氧)生成，cu(ii)可被还原为cu(i)，cu(i)可催化过氧化氢(h2o2)生成羟基自由基(oh
·
)。高度活性的羟基自由基能够与任何生物分子相互作用，可以从含氨基的碳上夺取氢形成碳中心蛋白自由基、从不饱和脂肪酸中夺取氢形成脂质自由基，从而导致细胞氧化损伤。另一方面，在摄取过程中，cu(ii)被一种类膜结构结合的金属还原酶还原为cu(i)，并通过跨膜转运蛋白被细胞吸收。因此，如果直接将cu(i)配合物用于抗肿瘤药物，使其氧化态直接为cu(i)，从而在细胞内快速产生羟基自由基、加快细胞对铜的摄取，这对增强铜配合物的抗肿瘤活性将有重要意义。
4.目前，人们合成亚铜配合物的主要方式是由亚铜盐与相应的配体进行作用，从二价铜合成亚铜配合物的研究很少。亚铜盐容易被空气中的氧氧化为二价铜，因此在合成亚铜配合物的过程中经常需要在惰性气体的保护下进行，这也在一定程度上限制了亚铜配合物的合成及在抗肿瘤药物领域的研究。
5.席夫碱具有良好的配位能力以及良好的抗菌、抗癌、抗炎等生理活性。其中，水杨醛类schiff碱在抑菌、杀菌、抗肿瘤等方面表现出较高的活性，因此水杨醛类席夫碱及其金属配合物在医药研发行业具有较大的潜力。喹啉类药物在自然界中普遍存在，它通常作为复杂天然产物的结构亚基。喹啉类药物还具有多种药理特性，是药物化学领域中具有十分重要的生物活性的杂环化合物。此外，喹啉及其衍生物金属配合物有望开发成为一类具有新作用机制的高活性、低毒性的抗肿瘤药物。
技术实现要素：6.本发明克服现有技术的不足，提供一种具有抗肿瘤活性的亚铜配合物。
7.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种席夫碱亚铜配合物，所述亚铜配合物的化学式为[cul]clo4，其中l为2-(α-喹啉甲氧基)苯甲醛缩对甲基苯胺席夫碱；所述亚铜配合物的结构式为：
[0008][0009]
进一步的，所述亚铜配合物的晶体结构是单斜晶系，p21/c空间群结构，晶胞参数为：α＝90
°
，β＝92.708(11)
°
，γ＝90
°
，z＝4，单胞体积整个结构是由席夫碱配体l和一个+1价铜离子，外界一个高氯酸根离子组成，所述配合物为黄色；在配合物的晶体结构中，铜离子是三配位的，三个配位原子分别是醚键中的o原子、c＝n键中的n原子、喹啉环上的n原子，cu与三个配位原子处于同一平面，构成t形结构。
[0010]
本发明还提供上述席夫碱亚铜配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
将配体l溶于入无水乙醇中，加热使配体完全溶解，保持溶液温度在30-40℃，加入无机铜盐cu(clo4)2·
6h2o，待金属盐全部溶解后，溶液变为棕色；迅速用滤纸过滤，滤液采用溶剂缓慢挥发法培养单晶，静置一天后，滤液中析出黄色针状晶体，即为[cul]clo4配合物。
[0012]
本制备方法特征是所用的铜盐为二价铜，而所得的配合物中，铜金属中心的价态为正一价。此类反应在目前的报道中很少见。直接将正一价的cu(i)配合物用于抗肿瘤药物，使其氧化态直接为cu(i)，从而在细胞内快速产生羟基自由基、加快细胞对铜的摄取，这对增强铜配合物的抗肿瘤活性将有重要意义。
[0013]
进一步的，配体l的合成方法为：向水杨醛的乙腈溶液中加入k2co3，然后加入2-氯甲基喹啉盐酸盐，加热回流8h～10h，将混合物抽滤，减压脱溶，用二氯甲烷使固体完全溶解，并用蒸馏水萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥。干燥后过滤，再减压脱溶，用乙腈对黄色固体进行多次重结晶，减压过滤，得醚类中间体，将醚类中间体与对甲基苯胺在乙醇溶液中加热回流5h～6h得到配体l，即2-(α-喹啉甲氧基)苯甲醛缩对甲基苯胺席夫碱。
[0014]
进一步的，所述配体l与cu(clo4)2·
6h2o的摩尔比为1:1～1:2。
[0015]
进一步的，所述水杨醛、k2co3和2-氯甲基喹啉盐酸盐的摩尔比为1:(2.5～3.5):(1～1.1)。
[0016]
进一步的，所述醚类中间体与对甲基苯胺的摩尔比为1:1～1:1.2。
[0017]
另外，本发明还提供上述的席夫碱亚铜配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0018]
进一步的，所述肿瘤为宫颈癌，胃腺癌，肺癌和肝癌。
[0019]
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：
[0020]
采用本发明方法制备的席夫碱亚铜配合物，经过细胞毒性测试实验(mtt法)证实，
所述席夫碱亚铜配合物表现出良好的细胞毒性作用(ic
50
＜20μm)以及良好的广谱抗癌活性，与其相对应的配体活性相比较可以看出铜离子的加入明显提高了配体本身的细胞毒性作用；同时对正常细胞huvec进行研究发现亚铜配合物对正常细胞的毒性作用均小于顺铂，一定程度上克服了顺铂对正常机体毒副作用这一缺点，具备了成为抗肿瘤药物的前提之一。经hoechst 33342染色实验证明，所述席夫碱亚铜配合物可能通过诱导细胞凋亡的方式对癌细胞产生毒性作用；通过利用dcfh-da探针来检测经过亚铜配合物处理过后细胞内的ros水平，表明该亚铜配合物可能是以副凋亡的形式诱导细胞死亡。
[0021]
本发明的席夫碱亚铜配合物结构新颖，制备方法简单可靠、产物稳定性好、制备成本低，其对四种癌细胞hela、bgc-823、nci-h460、hepg-2表现出良好的细胞毒性作用和广谱抗癌活性，同时对正常细胞的毒性作用均小于顺铂，并且很可能通过诱导细胞凋亡的方式对癌细胞产生毒性作用，可作为抗肿瘤候选药物。
附图说明
[0022]
图1为本发明中席夫碱亚铜配合物晶体结构图。
[0023]
图2为本发明中配体l的合成路线图。
[0024]
图3为本发明中配体l的核磁共振(1h nmr)图。
[0025]
图4为本发明中配体l的核磁共振(
13
c nmr)图。
[0026]
图5本发明中席夫碱亚铜配合物的高分辨质谱图。
[0027]
图6为本发明制备的席夫碱亚铜配合物对hela细胞毒性的影响结果。
[0028]
图7为本发明制备的席夫碱亚铜配合物对hela细胞形态的影响结果(100x)。
[0029]
图8为本发明制备的席夫碱亚铜配合物对hela细胞内ros产生的结果(100x)。
具体实施方式
[0030]
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0031]
实施例1
[0032]
合成配体l(2-(α-喹啉甲氧基)苯甲醛缩对甲基苯胺席夫碱)
[0033]
如图2所示合成路线，向1.599ml(15.32mmol)水杨醛的150ml乙腈溶液中加入3.231g(15.83mmol)2-氯甲基喹啉盐酸盐，6.560g(47.49mmo)碳酸钾以及催化量的碘化钾，在n2气氛下加热回流9h，反应全程用薄层色谱(tlc)进行跟踪监测(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2：1)。反应完成后，将混合物抽滤，用少量的乙腈洗涤滤渣和烧瓶内壁，洗涤液合并至滤液中。减压脱溶，加入适量的二氯甲烷使固体完全溶解，用蒸馏水萃取三次，收集有机相并用无水硫酸钠干燥。干燥后过滤，减压脱溶后得到黄色固体，用乙腈对黄色固体进行多次重结晶，减压过滤，最终得到淡黄色针状晶体(中间体，2.868g，产率：71.1％)。
[0034]
称取上述中间体2.868g(10.88mmol)和1.286g(12.00mmol)对甲基苯胺，然后投入150ml无水乙醇中，在n2气氛下加热回流5h。反应完成后，浓缩反应原液，浓缩后放入冰箱冷冻室中。15min后，浓缩液中析出大量絮状固体，减压脱溶后得到淡黄色固体。用无水乙醇对淡黄色固体进行多次重结晶，减压过滤后得到白色絮状固体(l，3.366g，产率：87.8％)，熔点:81.2℃～81.7℃。
[0035]
图3、图4分别为配体l的核磁共振氢谱和碳谱。
[0036]
ft-ir(kbr,v/cm-1
):1596.49,1506.04,1446.67,1367.13,1260.58,1250.06,1224.60,1049.62,812.14,739.34.
[0037]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.08(s,1h),8.19(s,2h),8.08(s,1h),7.84(s,1h),7.75(s,1h),7.64(d,j＝8.5hz,1h),7.56(s,1h),7.38(d,j＝0.8hz,1h),7.19(d,j＝7.4hz,4h),7.05(d,j＝14.5hz,2h),5.48(s,2h),2.37(s,3h).
[0038]
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ189.59,158.25,157.41,155.45,137.22,136.04,135.60,132.61,129.93,129.74,128.96,127.84,127.76,127.63,126.66,125.21,121.50,121.01,118.97,112.65,71.72,21.01.
[0039]
实施例2
[0040]
席夫碱亚铜配合物[cul]clo4的制备
[0041]
称取0.0705g(0.20mmol)配体l，投入20ml无水乙醇中，加热使配体完全溶解，保持溶液温度在30-40℃左右，然后加入0.0741g(0.20mmol)cu(clo4)2·
6h2o。待金属盐全部溶解后，溶液变为棕色。迅速用滤纸过滤，滤液采用溶剂缓慢挥发法培养单晶，静置一天后，滤液中析出黄色针状晶体。对其进行红外吸收光谱(ft-ir)及高分辨质谱(hrms)测试，结果如下：ft-ir(kbr,v/cm-1
):1602.81,1586.04,1565.35,1401.46,1248.51,1093.63,828.76,751.94,622.73.hrms(esi-tof)m/z[c
24h20
cun2o]
+
理论值为415.0866，实测值为415.0866(图5)。
[0042]
配合物经x射线单晶衍射测定为单斜晶系，p21/c空间群的结构，晶胞参数为：配合物经x射线单晶衍射测定为单斜晶系，p21/c空间群的结构，晶胞参数为：α＝90
°
，β＝92.708(11)
°
，γ＝90
°
，z＝4，单胞体积整个结构是由席夫碱配体l和一个铜离子，一个高氯酸根离子组成。在配合物的晶体结构中，铜离子是三配位的，三个配位原子分别是醚键中的o原子、n(1)-c(8)中的n原子、喹啉环上的n原子。十分有趣的是，该配合物中铜离子为+1价。理由如下：(1)n(1)-c(8)的键长为故n(1)-c(8)为双键，所以n(1)配位原子为中性；(2)醚键中的o配位原子为中性；(3)喹啉环中的n配位原子为中性；(4)外界离子只有一个高氯酸根离子。在此配合物中，cu与剩下的三个配位原子处于同一平面，构成t形结构。表1和表2分别列出了配合物的晶体学数据及主要键长键角数据。
[0043]
表1配合物的晶体学数据
[0044][0045][0046]
表2配合物的部分键长和键角数据(
°
)
[0047][0048]
实施例3
[0049]
席夫碱亚铜配合物[cul]clo4的细胞毒性测试试验
[0050]
细胞毒性的检测是采用mtt(四甲基偶氮唑盐，简称噻唑兰)法进行的，其基本步骤是:设置空白组(细胞培养基)、对照组(相同浓度的药物溶解介质)以及加药组。将细胞接种于96孔培养板中(5
×
103个/孔)，每组6复孔，孔板四周用无菌pbs进行填充，置于培养箱(37℃，5％co2)中孵育24h后，分别将不同浓度的配合物加入相应孔板中，继续置于培养箱中孵育。48h后，每孔加入20μl的mtt溶液(5mg/ml)继续孵育4h，小心吸弃上清，加入二甲基亚砜(100μl/孔)，轻微震荡，室温反应10min,用酶标仪检测492nm处的吸光度值，然后分析数据，每组实验重复三次。通常还用半数抑制率ic
50
值来衡量细胞毒性的强弱。ic
50
定义为:杀死半数细胞所需药物的浓度。
[0051]
席夫碱亚铜配合物[cul]clo4的体外细胞毒性研究
[0052]
研究亚铜配合物[cul]clo4的体外抗肿瘤活性，以顺铂作为阳性对照，利用mtt比色法探究了亚铜配合物对四种癌细胞hela、bgc-823、nci-h460、hepg-2以及正常细胞huvec的细胞毒性作用。实验结果如下表3所示，对比亚铜化合物和顺铂的ic
50
值，发现亚铜配合物表现出良好的细胞毒性作用以及广谱的抗癌活性，与其相对应的配体活性相比较可以看出铜离子的加入明显提高了配体本身的细胞毒性作用。对正常细胞huvec进行研究发现亚铜配合物对正常细胞的毒性作用小于顺铂，一定程度上克服了顺铂对正常机体毒副作用这一缺点，具备了成为抗肿瘤药物的前提之一。表3列出了配合物对细胞的ic
50
值数据。
[0053]
表3配合物对细胞的ic
50
值
[0054]
[0055]
基于亚铜配合物良好的细胞毒性，研究时间对这几种配合物抗癌活性的影响，根据ic
50
值我们主要对hela细胞及nci-h460细胞进行处理。结果如图6所示，随着时间的不断延长，配合物对于肿瘤细胞毒性不断增大，说明具有一定的时间依赖性。
[0056]
实施例4
[0057]
席夫碱亚铜配合物[cul]clo4的凋亡形态检测试验
[0058]
凋亡形态检测试验利用hoechst 33342染色法。hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或者流式细胞仪进行检测。
[0059]
mtt实验结果表明，亚铜配合对hela、nci-h460细胞表现出良好的毒性作用。诱导凋亡是细胞死亡的主要方式之一，而细胞凋亡是以一系列的形态学变化为特征的，因此采用hoechst33342染色法观察了hela、nci-h460两种癌细胞经过这几种配合物处理后的相应的形态学变化，并根据每种配合物的ic
50
值设置相应的浓度进行处理。其基本步骤为：设置对照组(相同浓度的药物溶解介质)，阳性对照组和加药组，以顺铂为阳性对照。然后将肿瘤细胞接种于12孔培养板(4
×
105个/孔)中培养24h后，分别向每个孔板中加入对照、阳性对照及一定浓度的配合物，孵育24h后，用预冷的pbs冲洗，然后加入hoechst 33342(1μg.ml-1
)37℃避光染色15min。再用预冷的pbs冲洗2-3次，每次3分钟，最后在荧光显微镜下进行观察并拍照。
[0060]
利用hela细胞检测亚铜配合物对其产生的形态学变化。处理结果如图7所示，在对照组中，由于没有受到任何外界影响，细胞保持正常的生长状态，能将进入细胞中的hoechst 33342染料排除出体外，所以细胞呈现无色或者浅蓝色；在阳性对照组中，由于顺铂的作用，细胞呈现出亮蓝色及少部分由于晚期凋亡细胞皱缩产生的高亮蓝色；而在加药组中，由于凋亡细胞增多，所以经过亚铜配合物处理过的细胞呈现出亮蓝色且伴随着由于细胞皱缩产生的高亮细胞，同时细胞还出现了细胞膨大、核碎裂以及凋亡小体等特征性的凋亡形态。
[0061]
实施例5
[0062]
席夫碱亚铜配合物[cul]clo4对细胞内ros水平影响
[0063]
根据以上实验例结果，亚铜配合物可能通过诱导细胞凋亡的方式对癌细胞产生毒性作用。细胞凋亡与细胞内ros的产生密切相关，细胞的凋亡往往伴随着ros水平的升高。因此利用dcfh-da探针来检测经过亚铜配合物处理过后细胞内的ros水平，从而对配合物的抑癌机制进行探究。
[0064]
如图8所示，利用dcfh-da探针探究了亚铜配合物对于hela细胞中ros水平的影响。对照组细胞中基本没有明显的绿色荧光；而在加药组中，随着配合物浓度的不断增大，hela细胞中的绿色荧光不断增强，这说明，亚铜配合物可以通过上调细胞中的ros水平从而导致细胞凋亡，且具有一定的浓度依赖性。同时，经过亚铜配合物处理的细胞都出现了细胞变圆膨胀的形态，与hoechst 33342染色结果相似。这表明该亚铜配合物可能是以副凋亡的形式诱导细胞死亡。
技术特征：1.一种席夫碱亚铜配合物，其特征在于，所述亚铜配合物的化学式为[cul]clo4，其中l为2-(α-喹啉甲氧基)苯甲醛缩对甲基苯胺席夫碱；所述亚铜配合物的结构式为：。2.根据权利要求1所述的一种席夫碱亚铜配合物，其特征在于，所述亚铜配合物的晶体结构是单斜晶系，p21/c空间群结构，晶胞参数为：a=7.0222(8)
å
，b=18.549(2)
å
，c=16.667(3)
å
，α=90
˚
，β=92.708(11)
˚
，γ=90
˚
，z=4，单胞体积v=2168.5(5)
å
3，整个结构是由席夫碱配体l和一个+1价铜离子，外界一个高氯酸根离子组成，所述配合物为黄色；在配合物的晶体结构中，铜离子是三配位的，三个配位原子分别是醚键中的o原子、c=n键中的n原子、喹啉环上的n原子，cu与三个配位原子处于同一平面，构成t形结构。3.根据权利要求1所述的一种席夫碱亚铜配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将配体l溶于入无水乙醇中，加热使配体完全溶解，保持溶液温度在30-40℃，加入无机铜盐cu(clo4)2·
6h2o，待金属盐全部溶解后，溶液变为棕色；迅速用滤纸过滤，滤液采用溶剂缓慢挥发法培养单晶，静置一天后，滤液中析出黄色针状晶体，即为[cul]clo4配合物。4.根据权利要求3所述的一种席夫碱亚铜配合物的制备方法，其特征在于，配体l的合成方法为：向水杨醛的乙腈溶液中加入k2co3，然后加入2-氯甲基喹啉盐酸盐，加热回流8h～10 h，将混合物抽滤，减压脱溶，用二氯甲烷使固体完全溶解，并用蒸馏水萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥；干燥后过滤，再减压脱溶，用乙腈对黄色固体进行多次重结晶，减压过滤，得醚类中间体，将醚类中间体与对甲基苯胺在乙醇溶液中加热回流5h～6h得到配体l，即2-(α-喹啉甲氧基)苯甲醛缩对甲基苯胺席夫碱。5.根据权利要求3所述的一种席夫碱亚铜配合物的制备方法，其特征在于，所述配体l与cu(clo4)2·
6h2o的摩尔比为1:1～1:2。6.根据权利要求4所述的一种席夫碱亚铜配合物的制备方法，其特征在于，所述水杨醛、k2co3和2-氯甲基喹啉盐酸盐的摩尔比为1:2.5~3.5:1~1.1。7.根据权利要求4所述的一种席夫碱亚铜配合物的制备方法，其特征在于，所述醚类中间体与对甲基苯胺的摩尔比为1:1～1:1.2。8.权利要求1所述的席夫碱亚铜配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌，胃腺癌，肺癌和肝癌。
技术总结本发明涉及抗癌化学药物技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的亚铜配合物及其制备方法和应用；亚铜配合物的化学式为[CuL]ClO4，其中L为2-(α-喹啉甲氧基)苯甲醛缩对甲基苯胺席夫碱；席夫碱亚铜配合物的制备方法，由配体L与二价铜盐Cu(ClO4)2合成，所得配合物中铜为+1价。该席夫碱亚铜配合物对四种癌细胞HeLa、BGC-823、NCI-H460、HepG-2表现出良好的细胞毒性作用以及广谱的抗癌活性，并且很可能通过诱导细胞凋亡的方式对癌细胞产生毒性作用，同时对正常细胞的毒性作用小于顺铂，具有潜在的药用价值，有望开发成为新一代抗肿瘤候选药物。选药物。选药物。
技术研发人员：高春艳 李柄金 贺卿 殷丛丛 郭冬冬 张永坡 赵晋忠 杜维俊
受保护的技术使用者：山西农业大学
技术研发日：2022.05.12
技术公布日：2022/7/5
