由长链非编码rna linc01234编码的小肽与应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤分子生物学领域和医学领域，具体涉及一种由长链非编码rna linc01234编码的小肽mbop(mek-binding oncopeptide)，产生该小肽的抗体的方法，以及该小肽的用途。
背景技术：2.高通量测序技术的不断发展，使研究者们注意到了非编码rna(noncoding rna，ncrna)的存在，以及这些ncrna在细胞迁移、增殖、发育和免疫等方面发挥的多种调节作用。近年来，随着核糖体测序，质谱测序等技术的不断更新，研究者们发现，最初被认为不具有编码功能的ncrna中存在着可编码小肽的开放阅读框(open reading frame，orf)。长链非编码rna(long noncoding rna，lncrna)是长度超过200个核苷酸的ncrna，是近年来被鉴定出具有较强编码小肽潜力的一类功能性rna分子。lncrna编码的小肽已经被报道能够在结直肠癌，三阴性乳腺癌和肝癌等多种肿瘤疾病的发生发展方面发挥重要的调节作用(cancer lett.2021jan 28；497:89-99.)。因此，本发明结合编码能力预测数据库和体内外生物学实验，寻找出具有orf的lncrna，并对由该orf编码的小肽进行表达水平、亚细胞定位方面的表征，以及其在肿瘤细胞中的生物学功能方面的研究，以期为临床肿瘤疾病的诊断提供新的标记物(biomarker)，为治疗提供新的药物靶标。
技术实现要素：3.针对肿瘤疾病分子分型解析不够深入的现状，本发明的一个目的是提供由长链非编码rna linc01234编码的小肽。
4.长链非编码rna linc01234的开放阅读框linc01234orf的核苷酸序列如seq id no:1所示，该编码区产生的小肽mbop的氨基酸序列如seq id no:2所示。
5.基于一对人结直肠癌组织的氨基酸测序结果，在结直肠癌的癌组织中测到的氨基酸序列如seq id no:3所示，对应的癌旁组织中测到的氨基酸序列如seq id no:4所示。
6.基于所述的seq id no:2的68-82氨基酸(amino acid，aa)片段作为抗原，通过免疫反应产生的检测mbop含量的抗体。
7.所述的编码小肽的核苷酸序列linc01234orf的过表达质粒porf-flag。该过表达小肽mbop的质粒porf-flag构建方法，包括以下步骤：分析序列seq id no:1和质粒载体pcdna3.1+的酶切位点分布情况，筛选出限制性内切酶bamh i和ecor i；向目的基因seq id no:1的末端加上一个flag标签，并按照内切酶的酶切位点设计引物，合成适用于质粒构建的目的片段；用限制性内切酶对目的片段和pcdna3.1+载体进行酶切、纯化、连接、转化，即得到过表达mbop的过表达质粒。
8.本发明的另一个目的是提供所述小肽在作为诊疗结直肠癌和宫颈癌的标记物中的应用。
9.本发明的再一个目的是提供所述小肽在制备靶向mbop的抗结直肠癌和宫颈癌的
药物中的应用。
10.本发明所述小肽mbop在结直肠癌和宫颈癌细胞系中的表达高于正常结肠上皮细胞中的表达。
11.本发明所述小肽mbop在结直肠癌组织中的表达高于配对的癌旁组织中的表达。
12.本发明所述小肽mbop在结直肠癌细胞中的亚细胞定位为细胞质。
13.本发明所述小肽mbop可以促进结直肠癌细胞hct116和hct15的迁移和增殖功能。
14.本发明具有如下优点：本发明开发了一种新的肿瘤标记物和药物靶标，具体是由seq id no:1的核苷酸序列编码的小肽seq id no:2。所述的小肽在结直肠癌细胞系中高表达，而在正常结肠上皮中几乎不表达；所述的小肽在宫颈癌细胞中高表达；所述的小肽在结直肠癌组织中的表达高于对应的癌旁正常组织中的表达。所述的小肽能够促进结直肠癌细胞系hct116和hct15的迁移和增殖能力。所述的小肽在结直肠癌细胞中具有促癌作用。这些结果表明，小肽mbop可以作为诊疗结直肠癌和宫颈癌的标记物；也有作为结直肠癌和宫颈癌的药物靶标，制备靶向mbop的药物(如化合物抑制剂，蛋白水解靶向嵌合体)的潜能。
附图说明
15.图1为小肽mbop在其模板链linc01234上定位的示意图。
16.图2为氨基酸测序实验中一对结直肠癌组织中天然存在的mbop片段的情况。癌组织中可测到3个片段，覆盖率更高，达到82.35％；癌旁组织中可测2个片段，覆盖率为61.18％。
17.图3 western blot实验证明靶向小肽mbop的抗体anti-mbop的有效性。
18.图4 western blot实验证明小肽mbop在结直肠癌组织中高表达。
19.图5 western blot实验证明小肽mbop在结直肠癌细胞系hct116，hct15和ht29中的表达高于正常结肠上皮细胞fhc中的表达；小肽mbop在宫颈癌细胞hela中高表达；结直肠癌细胞系和宫颈癌细胞中mbop的表达量高于胃癌细胞系mkn45和hgc27和肾胚细胞293t中的表达量。
20.图6 western blot实验证明小肽mbop在balb/c nude雌性裸鼠的结肠部位中存在，说明小肽mbop的序列具有一定的保守性。
21.图7小肽mbop的亚细胞定位为细胞质。对hct116和hct15细胞进行质核分离后，发现(a)linc01234orf和(b)mbop主要分布在细胞质中。
22.图8免疫荧光实验证明小肽mbop的亚细胞定位为细胞质。
23.图9小肽mbop无膜锚定序列。经数据库(a)transmembrane hidden markov model(tmhmm)server 2.0；(b)signalp-5.0server和(c)protscale分析，发现小肽mbop无膜锚定序列。
24.图10 transwell实验证明小肽mbop有促进结直肠癌细胞系hct116和hct15迁移的能力。
25.图11划痕实验证明小肽mbop有促进结直肠癌细胞系hct116和hct15迁移的能力。
26.图12细胞周期实验证明小肽mbop能通过增加结直肠癌细胞系hct116和hct15的g2/m期的比例从而促进其增殖的能力。
27.图13克隆形成实验证明小肽mbop有促进结直肠癌细胞系hct116和hct15增殖的能力。
28.图14 hct116的稳定过表达细胞株co-gfp，orf-gfp和orfm-gfp在裸鼠体内维持过表达状态。(a)orf-gfp组细胞在体内产生了小肽mbop。(b)过表达小肽orf-gfp组和启动子突变的orfm-gfp组细胞均在裸鼠体内产生了显著的核苷酸序列linc01234orf的过表达情况。
29.图15异种移植瘤模型实验证明小肽mbop有促进结直肠癌细胞系hct116增殖的能力。orf-gfp组肿瘤增殖明显增强(图15a，b)。三组裸鼠的体重则均呈下降趋势，但并无显著性差异(图15c)。免疫组化实验证实了orf-gfp组肿瘤内mbop的表达量较co-gfp和orfm-gfp组高(图15d)。
具体实施方式
30.本发明结合附图和实施例作进一步的说明。以下的实施例是说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。
31.实施例1人长链非编码rna linc01234中存在编码区linc01234orf，能够编码小肽mbop。
32.1、方法1.1分析长链非编码rna linc01234编码小肽的潜力
33.利用在线数据库lncrnadisease2.0(http://www.rnanut.net/lncrnadisease/)和ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析了与肿瘤疾病相关的lncrna，再用编码能力预测数据库regrna2.0(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)，cpc(http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)和cpat(http://lilab.research.bcm.edu/cpat/index.php)分析锁定了长链非编码rna linc01234。利用postar3(http://postar.ncrnalab.org)和gwips-viz(https://gwips.ucc.ie/index.html)分析发现linc01234中存在一个高编码潜能的区域，linc01234的开放阅读框linc01234orf的核苷酸序列如seq id no:1所示，该编码区产生的小肽mbop的氨基酸序列如seq id no:2所示。
34.1.2 western blot取分装好的ripa裂解液(强)在冰上解冻，临用前加入蛋白酶抑制剂pmsf(终浓度1mmol/l)，leupeptin(终浓度0.5μg/ml)，pepstatin(终浓度0.7μg/ml)。吸弃培养基后，使用预冷的1
×
pbs缓冲液1ml轻柔漂洗细胞，并吸弃1
×
pbs缓冲液。再加入1ml 1
×
pbs缓冲液，用细胞刮刀挂下细胞，用移液器将其转移至1.5ml rnase-free ep管中，在4℃，13 400g离心10min，吸弃上清液。每个孔加入50～100μl裂解液。用移液器吹打细胞悬液约10次后，将ep管移入4℃层析柜的转盘上，裂解约30～60min。再在4℃，13 400g离心10min，吸取上清至新的1.5ml rnase-free ep管，该部分上清液即为细胞总蛋白样本。吸取一部分蛋白样本，加入1/4体积的5
×
蛋白上样缓冲液，混匀后在100℃水浴锅中变性10min后，进行电泳或者-80℃冻存。
35.配制15％sds-page凝胶，吸取上述变性蛋白样本各10μl加入到凝胶泳道中，恒压80v电泳25min后，恒压130v继续电泳70min。再用45min的恒流200ma将蛋白转移到0.22μm pvdf膜上。转膜后，在室温下使用5％脱脂奶粉缓冲液封闭2h。用tbst缓冲液洗膜后，用一抗
稀释液4℃孵育过夜。用tbst缓冲液洗膜后，用二抗稀释液在室温下孵育2h。用tbst缓冲液洗膜后，进行曝光成像。
36.1.3氨基酸测序分析一对结直肠癌组织中小肽mbop的表达情况取一对结直肠癌组织，进行组织蛋白的提取、定量、变性。用15％sds-page凝胶电泳分开蛋白样品后，分别切取结直肠癌组织和癌旁组织的溴酚蓝前沿到15kda处的部分。分别对两块胶样进行裂解和还原，酶切和质谱分析。色谱系统由捕集柱(75μm
×
2cm，纳米级，c18，3μm，)和分析柱(50μm
×
15cm，纳米级，c18，2μm，)组成。通过配备thermo ltq-orbitrap velos pro的nanospray flex电离源的ftms(傅立叶变换离子回旋共振质量分析仪)分析仪和配备thermo ltq-orbitrap elite的离子阱分析仪相结合进行数据采集。
37.2、实验结果
38.2.1数据库预测到的长链非编码rna linc01234在结直肠癌细胞系hct116中存在一个开放阅读框linc01234orf，其编码了小肽mbop的序列(图1)。
39.2.2利用一对人结直肠癌组织进行氨基酸测序，并与小肽mbop的序列进行比对，发现小肽mbop天然存在，且癌组织中的序列覆盖率高于癌旁组织中的序列覆盖率(图2)。
40.实施例2人长链非编码rna linc01234编码的小肽mbop在结直肠癌中高表达
41.1、方法
42.1.1抗体制备针对小肽mbop的全长氨基酸序列进行抗原表位性质预测分析，再利用上述氨基酸测序的结果，确定了mbop序列的68-82aa(psdhasvwgnedqpr)作为产生mbop抗体的抗原序列。
43.首先合成68-82aa序列，然后偶联klh标签，再免疫3只实验级大耳白兔。人道处死大耳白兔后，亲和纯化抗体anti-mbop。
44.1.2过表达质粒的构建将预测到的seq id no:1序列的末端加一个flag标签，按照限制性内切酶bamh i和ecor i的酶切序列设计引物，合成线性连接seq id no:1和一个flag标签的目的片段，用限制性内切酶bamh i和ecor i对合成的目的片段和pcdna3.1+载体质粒进行37℃水浴酶切4h、纯化、t4连接酶16℃水浴连接12h，转化至dh5α感受态细胞，获得porf-flag质粒。启动子突变操作即将seq id no:1序列的第一个启动子atg突变为att，其余步骤如上述porf-flag质粒的构建步骤，即可获得启动子突变质粒porfmut-flag。
45.1.3质粒转染转染前一天，将细胞种到6孔板中，使细胞融合度达到约40％～60％。按照质粒/jetprime buffer/jetprime＝2ug/200μl/5μl的比例配制转染体系，将pcdna3.1+，porf-flag和porfmut-flag质粒转染至细胞中，48h后收集细胞。
46.1.4western blot利用western blot实验检测靶向小肽mbop的抗体anti-mbop的有效性，并比较数对结直肠癌中小肽mbop的表达情况。使用anti-mbop抗体和山羊抗兔二抗检测上述样本中小肽mbop的表达情况。
47.2、结果
48.2.1靶向小肽mbop的抗体anti-mbop的有效性验证情况。在结直肠癌细胞系hct116和hct15中转染质粒pcdna3.1+，porf-flag和porfmut-flag后48h，收集细胞蛋白样本进行靶向小肽mbop的抗体的验证。实验发现anti-mbop抗体能与靶向标签蛋白flag的抗体产生同一位置的条带，说明靶向小肽的anti-mbop抗体有效(图3)。
48.2.2小肽mbop在结直肠癌组织中高表达。提取9对结直肠癌组织的蛋白样本，进行小肽mbop的蛋白含量检测，发现mbop在6个癌组织中的表达高于对应的癌旁组织，说明mbop在结直肠癌组织中高表达(图4)。
50.2.3小肽mbop在结直肠癌细胞系中高表达。取结直肠癌细胞系hct116，hct15，ht29，sw48，sw620和rko，正常结肠上皮细胞系fhc，胃癌细胞系mkn45和hgc27，宫颈癌细胞系hela和肾胚细胞系293t进行小肽mbop的含量检测，发现小肽在hct116，hct15和ht29中的表达高于fhc中的表达；结直肠癌细胞系hct116，hct15，ht29，sw48，sw620和rko中小肽mbop的表达高于胃癌细胞系、宫颈癌细胞系和肾胚细胞(图5)。
51.2.4在一只balb/c nude雌鼠的各个器官中，仅结肠部位存在小肽mbop的表达，说明小肽mbop具有一定的序列保守性，且其表达具有一定的组织特异性(图6)。
52.实施例3人长链非编码rna linc01234编码的小肽mbop的亚细胞定位为细胞质
53.1、方法
54.1.1质核分离实验按照质核分离试剂盒paris
tm kit的说明书，将cell fraction buffer，cell disruption buffer置于冰上预冷，并按照以下步骤提取细胞质和细胞核中的蛋白：各准备1
×
106个hct116和hct15细胞，将其沉淀置于冰上。使用300～500μl的冰cell fraction buffer轻柔重悬细胞沉淀，并在冰上静置5～10min。在4℃，500g的条件下离心1～5min。用200μl移液器小心吸取上清液至另一个rnase-free离心管中，上清液即为细胞质部分蛋白。沉淀部分为细胞核部分，可用冰cell fraction buffer再洗一次，以除去细胞核部分的细胞质，然后加入300～500μl冰cell disruption buffer后，剧烈吹打细胞沉淀，即为细胞核蛋白样本。蛋白样本需保存于-80℃。
55.1.2western blot实验利用western blot实验检测小肽mbop的亚细胞定位情况。使用gapdh作为细胞质的内参蛋白，使用h3作为细胞核的内参蛋白，利用anti-mbop抗体检测上述质核分离的蛋白样本在天然状态下的小肽mbop的分布情况。
56.1.3基因的mrna表达水平检测
57.1.3.1细胞总rna提取按照axyprep总rna制备试剂盒的说明书，按照以下步骤对细胞rna进行提取：弃尽培养基，每孔加入300μl裂解液buffer r-i，缓慢转动细胞板，使裂解液可以均匀覆盖所有贴壁细胞，再用移液器吹打约10次，并全部转移到试剂盒内的1.5ml rnase-free离心管中。用装有21-25号枕头的无菌注射器吹吸约10次后，加入110μl buffer r-ii，涡旋振荡约30s后，以4℃，12 000g离心5min。在此过程中，准备1.5ml rnase-free的ep管，加入200μl异丙醇，并将试剂盒内的离心柱插套至2ml的接收管中。吸取离心后的上清液到含有200μl异丙醇的ep管中，吹打混匀后全部转移至离心柱中，以4℃，6 000g离心1min。取出离心柱后弃尽
接收管中的液体，并将离心柱重新置于接收管中。接下来，依次用500μl buffer w1a，700μl buffer w2和700μl buffer w2漂洗离心柱，并均在4℃，12 000g离心1min。漂洗最后一次后，再将离心柱置于接收管中，以4℃，12 000g离心1min以充分除去漂洗液。再将离心柱转移到试剂盒内的1.5ml rnase-free离心管中，通风橱中开盖放置约2min，并按照细胞量的多少加入50～100μl buffer te，室温静置1min后，在4℃，12 000g离心1min，即得细胞的总rna样本，需保存于-80℃。
58.1.3.2组织总rna提取在实验前先将剪刀、镊子和钢珠用锡箔纸包好置于120℃烘箱高温烘烤4h，并自然冷却。根据天根rnasimple total rna kit提取组织样本中的总rna。剪取半颗米粒大小的组织样本置于rnase-free的2ml离心管中，并加入一颗钢珠，再加入1ml裂解液rz。将离心管加到预冷的组织研磨仪插管底座上，以60hz的频率进行180s的组织研磨。将样本管在室温放置5min后，在4℃，13 400g离心5min，吸取上清液至一个新的1.5ml rnase-free离心中。再加入200μl氯仿，室温剧烈振荡20s，并静置3min。在4℃，13 400g离心10min后，样品分三层，rna样本主要在第一层无色水相中，小心吸取该层液体(一般吸取400μl)到一个新的1.5ml rnase-free离心中，再加入200μl无水乙醇，用移液器吹打均匀后将体系全部转入吸附柱cr3中，在4℃，13 400g离心0.5min以弃去废液。用500μl去蛋白液rd漂洗一次后，在4℃，13 400g离心0.5min。再加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，在4℃，13 400g离心0.5min。重复一次rw漂洗步骤后，再进行一次4℃，13 400g离心2min的操作以尽力去除残余漂洗液。将吸附柱转入一个新1.5ml的ep管中，在通风橱中放置约2min。最后根据所用的组织量加入适当量的rnase-free ddh2o，再室温静置2min后，在4℃，13 400g离心2min后得到最终的组织rna样本。rna样本需保存于-80℃。
59.1.3.3逆转录在逆转录之前，需要进行rna样本浓度的检测和计算。使用nanodrop 2000在rna模式下进行浓度测定，a260/a280的值分布在2.00～2.08，a260/a230的值均＞1.5，说明rna样本的质量较高，无dna、蛋白质以及试剂污染。
60.按照逆转录试剂说明书在冰上配制逆转录体系，吸取500ng rna样本对应的体积到200μl的ep管中，并用rnase-free ddh2o补液至8μl，再加入2μl的ii qrt supermixa，并用移液器吹打均匀，并进行离心。将ep管转移至50℃水浴锅，反应15min后，再将其转移到85℃，反应5s后，立即转移到冰上。吸取40μl的rnase-free ddh2o加到ep管中，使其终浓度变成10ng/μl。该cdna样本可以放在-20℃保存。
61.1.3.4 rt-qpcr
62.在冰上配制如下反应体系：
63.pcr扩增程序如下：
64.数据处理：基因定量用microsoft excel进行计算：选择gapdh，u6作为内参基因，对照组的表达量设为1，实验组目的基因的相对表达量为2
‑△△
ct
。
65.1.4稳转株构建按照上述过表达质粒的构建方法，将目的片段插入带有绿色荧光蛋白的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro质粒中，分别得到过表达小肽的orf-gfp质粒，以及过表达启动子突变序列的orfm-gfp质粒，空载体记为co-gfp。
66.使用293t细胞系进行慢病毒包装。应提前一天种3个6cm细胞培养皿的293t细胞，使其次日细胞融合度达到约70％～80％。
67.包装体系如下：
68.具体配制过程为：准备灭菌的ep管若干，取其中3个，各加入400μl opti-mem空白培养基和30μl lipofectamine 2000，混匀；再取3个ep管，各加入400μl opti-mem空白培养
基和两个包装载体质粒，以及5μg的co-gfp，orf-gfp和orfm-gfp质粒，混匀。静置5min后，将用opti-mem稀释的lipofectamine 2000一对一加入到opti-mem稀释的质粒里，混匀后静置20min。取出提前种板的293t细胞，吸弃培养基，加入3ml空白培养基，再将包装慢病毒的转染体系轻柔加到293t细胞里，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养6h，取出细胞，将培养基换成完全培养基，再放回细胞培养箱培养42h。
69.在转染病毒液之前24h，将需要构建稳定过表达细胞株的细胞种到6孔板中，使其在次日的融合度达到约20％。取出慢病毒转染48h的293t细胞，用5ml注射器(不用针头)吸取培养基，再用一次性滤头(0.45μm)过滤病毒液，并加入一定量的助感染试剂polybrene(终浓度为8μg/ml)。吸弃6孔板中的培养基，向板中3个孔各加1ml含有co-gfp，orf-gfp和orfm-gfp质粒的病毒液。24h后，显微镜下观察细胞状态，并加入1ml完全培养基。再过24h后，吸弃全部培养基，换成完全培养基，此时在显微镜下应该能观察到细胞中的绿色荧光。后期可以通过逐级稀释的方法，将细胞种到96孔板中，再用加有一定浓度的嘌呤霉素的培养基培养细胞，从而挑取单克隆细胞系。
70.1.5免疫荧光在12孔板的3个孔中各滴加一滴培养基，并用镊子夹起细胞爬片，小心盖到12孔板中的培养基液滴上，使其被吸附固定住。将12孔板放回细胞培养箱中，孵育15min。将稳定过表达细胞系co-gfp，orf-gfp和orfm-gfp消化，计数，稀释。取出12孔板，用200μl移液枪头吸取2滴细胞悬液，滴加到细胞爬片的正中间。将12孔板放回细胞培养箱，孵育6～8h，细胞贴在细胞爬片上后，加入1ml完全培养基，并放回细胞培养箱中孵育过夜。
71.第二天取出12孔板，吸弃全部培养基，用1
×
pbs轻柔漂洗细胞爬片3次。再在暗处向每孔加入4％固定甲醛500μl，避光孵育1h。1
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pbs轻柔漂洗细胞爬片3次后，每孔加入500μl含0.5％(v/v)tritonx-100的pbs通透液，室温孵育20min后，用1
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pbs轻柔漂洗细胞爬片3次。配制含10％(v/v)山羊血清的pbs封闭液，将其加到细胞爬片上，室温封闭1h，用1
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pbs轻柔漂洗细胞爬片3次。按照既定的稀释比例配好anti-mbop一抗稀释液，将其加到细胞爬片上，4℃过夜。次日，全部操作需要避光。预热1
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pbs溶液，回收一抗稀释液，用预热的1
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pbs溶液轻柔漂洗细胞3次。按照比例向pbs封闭液中加入荧光二抗，并加到细胞爬片上，室温孵育1h后，用预热的1
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pbs溶液轻柔漂洗细胞3次。用hochest染核20min后，用预热的1
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pbs溶液轻柔漂洗细胞3次。最后，在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭剂，用注射器针头挑取细胞爬片，镊子小心夹起，再将其下缘靠在吸水纸上，以除去多余的液体，并将细胞爬片的细胞面朝下，盖到淬灭剂上，小心避免气泡。再滴加3～4滴透明指甲油到细胞爬片的边缘位置封片。宜在制片完成后的半个月内进行荧光拍摄。
72.1.6分析小肽mbop的膜定位潜力使用transmembrane hidden markov model(tmhmm)server 2.0，signalp-5.0server和protscale分析了mbop的细胞膜锚定潜能。
73.2、结果
74.2.1 rt-qpcr和western blot实验证明核苷酸序列linc01234orf和小肽mbop主要分布在细胞质中。实验结果表明，质核分离实验较好的分离了hct116和hct15细胞的细胞质和细胞核部分，核苷酸序列linc01234orf和小肽mbop在细胞质中的含量明显更高，说明小肽mbop主要分布在细胞质中(图7)。
75.2.2免疫荧光实验证明小肽mbop主要分布在细胞质中(图8)。
76.2.3数据库预测分析小肽mbop无膜锚定序列(图9)，因此小肽mbop主要定位在细胞质中。
77.实施例4人长链非编码rna linc01234编码的小肽mbop促进结直肠癌细胞的迁移和增殖
78.1、方法
79.1.1transwell实验配制15％胎牛血清(v/v)的完全培养基，按照每孔600μl的量将这部分培养基加到transwell板的下室，将transwell的上室置入加有培养基的孔中，除尽气泡，将其放在细胞培养箱中静置约20min。再将经转染48h的细胞消化，计数，并用无血清培养基重悬细胞。用血球计数板在显微镜下对细胞进行计数，按照每个transwell小室种2
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104个细胞的密度，计算所需要吸取的细胞悬液。各取一个1.5ml灭菌的ep管，吸取所需量的2倍细胞悬液，并用无血清培养基补液至400μl，用移液器吹打均匀。取出transwell板，各吸取200μl细胞悬液，小心加到transwell上室中，小心摇匀后，放回细胞培养箱中，继续培养。培养48h后，取出transwell板，吸弃下室的培养基，加入600μl 4％固定甲醛溶液，在室温下避光固定30min。再吸弃固定甲醛溶液，换成pbs溶液，漂洗一遍。吸弃pbs溶液，加入600μl结晶紫溶液，室温孵育20min后，回收结晶紫溶液，并用pbs溶液漂洗transwell上室多次直至无多余结晶紫溶液。用小棉签擦除transwell上室顶面的未迁移细胞，并自然晾干。将transwell小室置于显微镜下观察，并在明场拍照记录。
80.1.2划痕实验将经转染48h的细胞消化，计数，并用无血清培养基重悬细胞。使用血球计数板在显微镜下对细胞进行计数，计算每孔种3
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105个细胞所需要的细胞悬液体积。取一块新的6孔板，在其底板上用油漆笔画平行直线，一般一个孔可以画平行的三条线。将计算后的细胞悬液加到画线6孔板中，并为每孔补液至2ml，将6孔板中的细胞悬液充分摇匀后，放回细胞培养箱中培养。次日，在显微镜下观察细胞，此时细胞融合度达到约95％，用200μl移液枪头在6孔板中画直线，该直线应垂直于前一天油漆笔画的平行线。并弃尽培养基，用pbs溶液漂洗细胞，以洗去画线过程中被刮下的细胞，换成含1％胎牛血清(v/v)的培养基，立即拿到显微镜下进行明场拍照，隔24h，48h后分别再进行明场拍照。
81.1.3细胞周期实验将经转染48h的细胞在4℃，1 000rpm的条件下离心5min。用移液器小心吸弃上清液，可以保留约50μl培养基，以免吸弃过程中吸走细胞沉淀。用1ml pbs重悬细胞沉淀，再在4℃，1 000rpm的条件下离心5min。用移液器小心吸弃上清液，可以保留约50μl pbs。加入1ml70％乙醇溶液，轻柔重悬细胞，并将样本管插在4℃层析柜中的转盘上，固定至少12h后，在4℃，1 000rpm的条件下离心10min。吸弃上清液，保留约50μl乙醇液以免吸走细胞。用1ml pbs重悬细胞沉淀，再在4℃，1 000rpm的条件下离心5min。上述离心过程中，按照实验所需要的样本数量配制碘化丙啶染色工作液，每个待测样本需要的染色工作液包括500μl染色缓冲液、25μl碘化丙啶染色液(20
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)和10μl rnase a(50
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)。吸弃上述离心样本的上清液后，用移液器转移450μl碘化丙啶染色工作液，并轻柔重悬，将细胞样本放在37℃水浴锅中避光保存。
82.上样前，需用40目筛网处理细胞悬液，将细胞液加至流式上样管中，设置流式细胞仪，分别记录pcdna3.1+，porf-flag和porfmut-flag组细胞的g1期，s期和g2/m期所占的百分比。
83.1.4克隆形成实验将稳定过表达细胞系co-gfp，orf-gfp和orfm-gfp消化，并用含15％胎牛血清(v/v)的完全培养基重悬细胞，再用血球计数板对其计数，并用逐级稀释的方法，将其细胞浓度稀释到1 000个细胞/2ml。向6孔板中种入稳定过表达细胞株细胞，每孔1 000个细胞，充分摇匀细胞，并放在细胞培养箱中继续培养，所用培养基是含15％胎牛血清(v/v)的完全培养基。待10～14天后，取出6孔板，吸弃孔中的培养基，并用1ml pbs漂洗细胞板。再加入600μl 4％固定甲醛溶液，在室温下避光固定30min。吸弃固定甲醛溶液，加入600μl结晶紫溶液，室温孵育20min后，回收结晶紫溶液，并用pbs溶液漂洗细胞板。待板自然晾干后，用显微镜相机拍摄记录数据。
84.1.5异种移植瘤模型实验
85.1.5.1第一次接瘤将hct116细胞的三株稳定过表达细胞co-gfp，orf-gfp和orfm-gfp进行扩增，消化，收集细胞。再用pbs多洗涤一次细胞沉淀，将细胞离心后，用少量的冰pbs重悬细胞。吸取约20μl细胞悬液并进行适当稀释后，用血球计数板在显微镜下计数，并用冰pbs调整细胞悬液浓度至8
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106个细胞/150μl。用1ml医用注射器将150μl细胞悬液接种在4周雌性balb/cnude裸鼠的腋下的皮下位置，约过2周后，裸鼠皮下长出了可见的肿瘤块。再过约1月后，裸鼠体内的肿瘤块长到足够大，可以提供足够进行二次接瘤的瘤块。
86.1.5.2二次接瘤在实验前先将剪刀、镊子和钢珠用锡箔纸包好置于120℃烘箱高温烘烤4h，并自然冷却，准备好冰生理盐水和细胞小皿。人道处死裸鼠后，剥瘤，将瘤块外围的组织剪去，瘤块内部的豆腐渣样组织也剪去。从中间实质部分取出一小块，提取rna和蛋白，进行linc01234orf和mbop的表达量检测。将剩余大部分组织剪成约1mm3体积的组织小块，放在冰生理盐水中备用。用剪刀在4周雌性balb/c nude裸鼠的腹侧剪开一个小口，将组织块推进该小口中，并用直镊将该组织块从腹侧推向腋下位置，以防裸鼠活动过程中，组织块从小口掉出。组织块接瘤后几天，密切关注裸鼠状态以及其体内组织块的状态。
87.1.5.3收集数据在二次接瘤后的第9天，开始第一次记录裸鼠的体重，以及裸鼠肿瘤的尺寸。裸鼠肿瘤的体积按照v＝1/2
×a×
b2来计算，其中a是肿瘤的长，b是肿瘤的宽。按照每三天记录一次的频率持续记录到第八次，在裸鼠肿瘤不超过2 000mm3体积的情况下，人道处死裸鼠。剥瘤，并将肿瘤表面和核心部分的组织去掉。剩余的肿瘤实质部分，分别进行rna提取，蛋白提取，免疫组化前处理，以及-80℃冻存。
88.2、结果
89.2.1通过transwell实验，证明小肽mbop具有促进迁移的功能。transwell实验的原理是利用培养基中的血清浓度差，诱导细胞从transwell小室的顶面迁移到transwell小室的底面。实验结果表明，小肽mbop过表达组发生迁移的细胞数量高于转染空载体的pcdna3.1+组和启动子突变质粒porfmut-flag组，这说明小肽mbop具有促进细胞迁移的功
能(图10)。
90.2.2通过划痕实验，证明小肽mbop具有促进迁移的功能。划痕实验的原理是利用人为制造贴壁细胞间的空间间隔，诱导细胞从密集处迁移到无细胞处。实验结果表明，小肽mbop过表达组发生迁移的细胞数量高于转染了空载体的pcdna3.1+组和启动子突变质粒porfmut-flag组，这说明小肽mbop具有促进细胞迁移的功能(图11)。
91.2.3通过细胞周期实验，小肽mbop具有促进增殖的功能(图12)。细胞周期g2/m期占比的多少被认为是细胞增殖活跃程度的指标，小肽mbop过表达组的细胞g2/m期占比高于转染了空载体的pcdna3.1+组和启动子突变质粒porfmut-flag组，这说明小肽mbop具有促进细胞增殖的功能(图12)。
92.2.4通过克隆形成实验，小肽mbop具有促进增殖的功能。稳定过表达小肽mbop的orf-gfp组形成的细胞克隆数量高于对照组co-gfp和启动子突变组orfm-gfp，因此小肽mbop具有促进细胞增殖的功能(图13)。
93.2.5通过异种移植瘤模型实验证明小肽mbop具有促进增殖的功能。第一次接瘤后对瘤块内的linc01234orf和mbop进行了检测，证明稳定过表达细胞株在体内能够维持显著的过表达情况(图14)。利用验证后的瘤块进行二次接瘤后，发现小肽mbop过表达组的瘤块体积增殖显著高于对照组和启动子突变组，说明小肽mbop具有促进增殖的功能(图15)。
技术特征：1.一种由长链非编码rna linc01234编码的蛋白小肽，其特征在于：所述蛋白小肽的核苷酸序列如seq id no:1所示，命名为linc01234orf；其氨基酸序列如seq id no:2，命名为mbop。2.含有权利要求1所述的编码小肽的核苷酸序列linc01234orf的过表达质粒porf-flag。3.基于权利要求2所述的过表达质粒porf-flag的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：分析序列seq id no:1和质粒载体pcdna3.1+的酶切位点分布情况，筛选出限制性内切酶bamh i和ecor i；向目的基因seq id no:1的末端加上一个flag标签，并按照内切酶的酶切位点设计引物，合成适用于质粒构建的目的片段；用限制性内切酶对目的片段和pcdna3.1+载体进行酶切、纯化、连接、转化，即得到过表达mbop的过表达质粒。4.权利要求1所述的小肽在作为诊疗结直肠癌和宫颈癌标记物中的应用。5.权利要求1所述的小肽作为肿瘤标志物在制备靶向mbop的抗结直肠癌和宫颈癌的药物中的应用。
技术总结本发明提供由长链非编码RNA LINC01234编码的小肽与应用。长链非编码RNA LINC01234中包含的LINC01234ORF区域，能够编码表达一种新的人类小肽MBOP，且该小肽在结直肠癌和宫颈癌中高表达，并主要定位在细胞质中。小肽MBOP能调控结直肠癌细胞迁移和增殖过程，因此可以作为诊疗结直肠癌和宫颈癌的新的分子分型标记物和药物靶点。物和药物靶点。
技术研发人员：余露山 唐春媛 周蓥 孙文 刘宇茜 曾苏
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5
