1.本发明属于核酸或微生物的测定或检验方法技术领域，具体涉及检测鸡滑液囊支原体的方法及其所用试剂。
背景技术：2.鸡滑液囊支原体(mycoplasma synoviae,ms)，通常寄生在呼吸道系统，是一种能感染鸽子、鹌鹑等野禽和鸡、鸭、鹅等家禽，从而引起以关节滑液囊膜及腱鞘等发生传染性渗出性滑膜炎、腱鞘滑膜炎及黏液囊炎为主要特征的传染病，也可以引起呼吸道疾病，严重的甚至引起全身性传染病，在野生条件下家禽支原体引起的关节炎都是由滑液支原体感染引起的，滑液支原体可继发新城疫病毒、大肠杆菌、传染性支气管炎病毒等病原微生物混合感染。6日龄左右的雏鸡就可以感染传染性滑膜炎，鸡群中常见滑膜炎感染率从2％到75％，主要感染腿关节，特别是胫跗跖跗关节，引起鸡的淘汰率高，给国内外的养鸡业造成巨大的经济损失。
3.近年来，随着技术的不断进步和发展，微滴式数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)是近几年出现的新一代聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术。通过油包水技术将反应液分割为数万个纳米级大小的微滴，每一个微滴都是一个独立的pcr反应体系，当pcr扩增完成后，利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，再根据统计学中的泊松分布原理分析阳性微滴的个数与比例，即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，从而实现对低至单个拷贝核酸分子的绝对定量。与传统实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)方法相比，它不依赖于标准曲线，因而定量结果更为精确，同时也使体系受反应抑制因子的影响大大降低。
技术实现要素：4.本发明要解决的技术问题是，如何实现鸡滑液囊支原体的精准检测。
5.为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供检测或辅助检测鸡滑液囊支原体的方法，所述方法包括利用试剂或试剂盒对待测样品进行数字pcr，根据数字pcr产物确定或辅助确定待测样品是否为鸡滑液囊支原体或，是否含有鸡滑液囊支原体或，是否感染鸡滑液囊支原体，
6.所述试剂或试剂盒为检测或辅助检测鸡滑液囊支原体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括鸡滑液囊支原体引物探针，所述鸡滑液囊支原体引物探针包括引物ms-f和引物ms-r、探针ms-probe，
7.所述引物ms-f为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna；
8.所述引物ms-r为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna；
9.所述探针ms-probe的核苷酸序列是seq id no.4。
10.进一步地，上述的方法中，所述ms-f、ms-r、ms-probe的物质的量比值为2:2:1。
11.进一步地，上述的方法中，所述数字pcr试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。
12.进一步地，上述的方法中，所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如seq id no.1所示的dna分子。
13.进一步地，上述的方法中，所述数字pcr中采用的pcr体系中所述ms-f的含量为1μmol/μl，所述ms-r的含量为1μmol/μl，所述ms-probe的含量为0.5μmol/μl。
14.进一步地，上述的方法中所述数字pcr中采用的引物退火条件为54℃1分钟。
15.为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述的试剂或试剂盒。
16.上述的试剂或试剂盒、组合物中，所述引物探针可单独包装也可组合包装。
17.所述阳性标准品质粒单独包装。
18.为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供上述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测鸡滑液囊支原体中的应用。
19.为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供上述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染鸡滑液囊支原体的应用。
20.为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供上述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测病原是否为鸡滑液囊支原体的应用。
21.本发明中，所述ms-probe为特异性识别鸡滑液囊支原体的探针，所述ms-pro的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。
22.荧光基团可选自但不限于fam(5/6-羧基荧光素)、vic(绿色荧光蛋白)、tet(四氯-6-羧基荧光素)、joe(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、hex(六氯-6-甲基荧光素)、cy3、tamra(6-羧基四甲基若丹明)、rox(羧基-x-罗丹明)、texas red、lc red640、cy5(花菁染料)、lc red705、fitc(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重pcr检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同即可。
23.所述淬灭基团可选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。
24.以20μl反应体系为例，具体检测方法如下：
25.20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，20μmol/μl ms-f、ms-r引物各1μl，10μmol/μl探针ms-pro 1μl，dna/rna模板2μl，用ddh2o补足至20μl。反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度54℃1min，40个循环；98℃10min；4℃结束。
26.上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。所述待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如空气)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。
27.本发明取得的有益技术效果如下：
28.1、本试验建立的ddpcr方法，与qpcr检测方法在灵敏性检测方面进行了比较。在定量检测相同稀释度的ms质粒dna时，且ddpcr方法比qpcr方法检测的拷贝数更低1个滴度，更为灵敏。
29.2、本试验建立了一种绝对定量检测ms的ddpcr方法，并对方法中的引物和探针浓度、退火温度进行优化，发现引物终浓度为1μmol/μl、探针浓度为0.5μmol/μl的情况下，反应具有最低的负荧光幅度(灰色)，阳性微滴信号(蓝色)高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。退火温度为54℃，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。
30.3、本方法中，阳性模板浓度过高，ddpcr扩增的阳性产物超出10000copies/μl时，
系统会读不出拷贝数，在这种情况下，为更准确获取扩增阳性的阳性拷贝数，应对模板浓度进行一定浓度的稀释后才能成功获得检测的拷贝数。而对临床样品的检测，往往由于样品中的目的模板含量低，因而本方法更适合于临床样品的检测。
31.本方法中，由于对操作的要求较高，在操作过程中所吸取的液体不能有气泡，而且扩增后读取的微滴总数(阳性和阴性微滴)应大于10000，这样ddpcr读取仪读出来的阳性微滴数比较准确。
32.本研究根据ms vlha基因的保守片段序列，设计合成了1对引物和一条探针，在探针的5’端标志fam荧光基团，3’端标志bhq1淬灭基团。通过比较不同引物浓度、探针浓度、最佳退火温度、灵敏度以及检测特异性等方面进行研究，建立了微滴式数字pcr检测ms的绝对定量方法，为绝对定量检测ms提供了技术支撑。
附图说明
33.图1为ms ddpcr退火温度优化结果图。
34.图2为ms ddpcr引物浓度优化结果图。
35.图3为ms ddpcr探针浓度优化结果图。
36.图4为ms ddpcr特异性检测结果图。
37.图5为ms ddpcr灵敏性检测结果图。
38.图6为ms qpcr灵敏性检测结果图。
39.图7为ms ddpcr标准曲线图。
具体实施方式
40.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
41.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.实施例1、材料与方法
43.1.1、毒株
44.鸡滑液囊支原体毒株(ms k1415)和鸡滑液囊支原体毒株(ms 28)由本室保存，在文献“邓显文等，鸡滑液支原体lamp快速可视化检测方法的建立，中国预防兽医学报，2014,36(1)：46-49.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
45.鸡传染性支气管炎病毒(ibv mass 41)、鸡毒支原体(mg s6)、鸡新城疫病毒(ndv lasota)、禽呼肠孤病毒(reo s1133)、禽流感h9n2 066c株(aiv h9n2 066c)、由本实验室保存，禽偏肺炎病毒(apv/mn-10)由美国宾夕法尼亚州立大学lu教授惠赠，在文献“谢志勤等，鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立.中国兽医杂志，2017，53(2):6-9.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
46.1.2、主要试剂
47.ddpcr supermix for probe(no dutp(catalog#:1863024)，ddpcr droplet generation oil for probes、droplet reader oil购自美国bio-rad公司、easypure virual dna/rna kit(目录号：er201-01)购自北京全式金生物技术有限公司，pcr试剂盒、100bp dna marker购自宝生物工程(大连)有限公司。
48.1.3、主要仪器
49.px1热封仪、微滴生成仪、微滴式数字pcr仪(qx200)、梯度pcr扩增仪购自美国bio-rad公司，荧光pcr仪(quantstudio 5)购自美国thermo fisher scientific公司。
50.1.4、引物设计与合成
51.利用在线https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/软件设计ddpcr引物(ms-f和ms-r)和探针(ms-pro)，应用blast在线对设计的引物和探针序列进行比对份分析，在探针引物的5’端标志fam荧光基团，3’端标志bhq1淬灭基团。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成合成，引物和探针寡核苷酸序列如下：
52.ms-f：5
’‑
gccattgctcctgctgttat-3’(seq id no.2)；
53.ms-r：5
’‑
agcagcctctacagggtcaa-3’(seq id no.3)；
54.ms-pro：fam-aaacccaaatccaggaaacc-bhq1(seq id no.4)。
55.1.5、病毒核酸的提取
56.参照easypure virual dna/rna提取试剂盒说明书，提取ms k1415、ms 28和mg s6的dna，提取aiv h9n2 066c、ibv mass 41、ndv lasota、apv/mn-10、reo s1133的rna。提取的dna/rna保存于-80℃备用。
57.1.6、阳性标准品质粒的制备
58.用设计的引物ms上、下游引物扩增ms k1415的vlha基因，扩增的pcr产物经15g/l脂糖凝胶电泳，染色后将目的片段的凝胶切下，用凝胶回收试剂盒回收目的片段获得核苷酸序列是seq id no.1的dna分子。
59.将获得核苷酸序列是seq id no.1的dna分子与pmd18-t载体(购买于takara生物公司，货号：6011)连接，转染到大肠杆菌dh5α中。提取转染后大肠杆菌中的质粒dna，质粒dna经pcr鉴定为ms阳性，获得的阳性质粒命名为pmd18-t-ms，pmd18-t-ms含有seq id no.1所示的dna片段。
60.pmd18-t-ms为鸡滑液囊支原体阳性标准品质粒。
61.测定阳性质粒dna的od
260
/od
280
值的测定，计算阳性质粒dna的浓度，按公式换算成拷贝数，拷贝数＝(浓度
×
阿伏加德罗常数)/(一个碱基对的平均分子量
×
总长度)。
62.结果表明pmd18-t-ms质粒的浓度为75.6mg/ml。
63.1.7、ddpcr反应的建立及优化
64.20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，5-40μmol/μl上、下游引物各1μl，2.5-40μmol/μl探针1μl，标准模板2μl，用ddh2o补足至20μl。生成微滴：在微滴生成卡dg8的第二、三排孔分别加入上述反应液20μl和微滴生成油70μl，盖上专用胶垫，置微滴生成仪上自动生成微滴于第一排。
65.封膜：吸取生成的微滴至96孔板内，加盖铝膜置px1热封仪上，180℃10s进行封膜。
66.pcr扩增：封膜的96孔板放入pcr扩增仪上进行扩增，反应程序：95℃10min；94℃
30s，设置退火温度50-60℃1min(2℃/s变温)，40个循环；98℃10min；4℃结束。
67.数据读取及分析：反应结束后将96孔板置qx200微滴读取仪上读取信号并进行数据分析。
68.1.8、ddpcr特异性测定
69.将aiv h9n2 066c、ibv mass 41、ndv lasota、apv/mn-10、reo s1133的rna反转录为cdna，然后将ms k1415、ms 28、mg s6的dna及反转录的cdna分别加入2.3已优化好的ddpcr反应体系中进行特异性检测。
70.1.9、ddpcr灵敏性及重复性测定
71.测定pmd18-t-ms质粒dna的浓度，然后以10倍梯度稀释，浓度在10-2-10-9
，每个稀释度取2μl作为模板加入已优化好的ddpcr反应中，测定ddpcr反应的灵敏性。同时用相同的引物、探针浓度和试剂进行荧光定量pcr检测，比较两种方法的灵敏性。取10-4-10-6
三个梯度稀释的pmd18-t-ms质粒模板进行3次重复试验，以检测dd pcr的重复性。
72.1.10、临床样品检测
73.提取2020年1月份至2021年5月份采集的60份鸡病料样品的核酸，用已优化后ddpcr和荧光pcr进行检测，对比检测结果的一致性。
74.实施例2、结果
75.2.1、ddpcr反应退火温度的优化
76.ddpcr反应中，采用上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μl和10μmol/μl，模板浓度约为350copies/μl时，退火温度设为50、51、52、54、55、56、58、60℃共8个不同梯度进行ddpcr反应扩增，结果退火温度为54℃时，扩增阳性的微滴数最高，为326copies/μl。结果如图1所示，图1中，a11表示50℃、b11表示51℃、c11表示52℃、d11表示54℃、e11表示55℃、f11表示56℃、g11表示58℃、h11表示60℃。图1中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图1中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
77.当退火温度在52-55℃时，阳性微滴显示为蓝色，阴性微滴显示为黑色，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。综合这些因素，选择最佳的退火温度为54℃。
78.2.2、ddpcr反应引物及探针浓度的优化
79.ddpcr反应中，加入不同的引物浓度和探针浓度，结果当上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μl和10μmol/μl时，即终浓度分别为1μmol/μl和0.5μmol/μl时，阳性微滴信号高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。
80.2.2.1、ddpcr反应引物浓度的优化
81.上述反应体系中保持探针浓度为10μmol/μl，设置4组引物浓度的梯度实验，分别为第一组：正向引物和反向引物分别10μmol/μl，第二组：正向引物和反向引物分别15μmol/μl，第三组：正向引物和反向引物分别20μmol/μl，第四组：正向引物和反向引物分别30μmol/μl。使用等量浓度为20copies/μl的阳性标准品质粒模板及反应条件进行筛选，每组浓度检验3次。结果上、下引物分别为20μmol/μl时，扩增阳性的微滴数最高，为15.5copies/μl。
82.结果如图2所示，图2中，e06表示引物浓度为10μmol/μl、f06表示引物浓度为20μmol/μl、g06表示引物浓度为30μmol/μl、h06表示引物浓度为40μmol/μl，图2中左图的横坐
标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图2中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
83.结果表明：第三组的拷贝数平均值最高，为15.5copies。因此选取最佳引物浓度分别为20μmol/μl。
84.2.2.2、ddpcr反应探针浓度的优化
85.上述反应体系中保持引物浓度分别为20μmol/μl，设置4组探针浓度的梯度实验，分别为第一组：探针浓度为2.5μmol/μl，第二组：探针浓度为5μmol/μl，第三组：探针浓度为10μmol/μl，第四组：探针浓度为15μmol/μl。使用等量浓度为20copies/μl的阳性标准品质粒模板及反应条件进行筛选，每组浓度检验3次。
86.结果如图3所示，图3中，a06表示探针浓度为2.5μmol/μl、b06表示探针浓度为5μmol/μl、c06表示探针浓度为10μmol/μl、d06表示探针浓度为15μmol/μl，图3中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图3中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
87.结果表明：第三组的拷贝数平均值最高，为14.4copies。因此选取最佳探针浓度为10μmol/μl。
88.以上结果表明：当上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μl和10μmol/μl时，即终浓度分别为1μmol/μl和0.5μmol/μl时，阳性微滴信号高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。
89.2.3、优化后的反应体系及反应程序
90.20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，20μmol/μl上、下游引物各1μl，10μmol/μl探针1μl，dna/rna模板2μl，用ddh2o补足至20μl。反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度54℃1min(2℃/s)，40个循环；98℃10min；4℃结束。
91.2.4、ddpcr反应特异性测试结果
92.将aiv h9n2 066c、ibv mass 41、ndv lasota、apv/mn-10、reo s1133的rna反转录为cdna，然后将ms k1415、ms 28、mg s6的dna及反转录的cdna分别加入2.3所示的优化好的ddpcr反应体系中进行特异性检测，结果如图4所示，图1中a01表示ms k1415；b01表示ms 28；c01表示mg s6；d01表示aiv h9n2 066c；e01表示ibv mass 41；f01表示reo s1133；g01表示ndv lasota；h01表示apv/mn-10。
93.图4中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，右图的横坐标表示样品编号，纵坐标表示阳性微滴数。
94.图4表明各孔扩增总微滴的生成量都达1万以上，且较均衡，微滴扩增条件成立，出现阳性微滴的样品只有ms k1415和ms 28，其它样品没有出现阳性微滴，表明引物和探针具有良好的特异性。
95.2.5、ddpcr灵敏性及重复性测定结果
96.2.5.1、灵敏性测定
97.取10-2-10-9
每个稀释度2μl作为模板加入到2.3优化好的dd pcr反应体系中，结果见图2所示，图5中a09表示稀释度10-2
稀释度的ms dna；b09表示稀释度10-3
的ms dna；c09表示稀释度10-4
的ms dna；d09表示稀释度10-5
的ms dna；e09表示稀释度10-6
的ms dna；f09表示稀释度10-7
的ms dna；g09表示稀释度10-8
的ms dna；h09表示稀释度10-9
的ms dna。
98.图5中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，右图的横坐标表示样品编号，纵坐标表示阳性微滴数。
99.qrt-pcr检测结果见图6，结果只检测出10-7
稀释度，低拷贝3.5copies/μl(10-8
稀释度)没有检出。
100.结果表明：ddpcr最低检测限为3.5copies/μl(10-8
稀释度)，而qpcr只检测出10-7
稀释度，低拷贝3.5copies/μl(10-8
稀释度)没有检出。
101.分别用核酸稀释度和阳性拷贝数10的对数值绘制标准曲线，发现线性方程为y＝-0.87x+7.32，线性关系r2值为0.9933，结果见图7。图7中横坐标表示样品稀释度的对数值，纵坐标表示获得的阳性拷贝数的对数值。
102.2.5.2、重复性测定
103.采用三组不同拷贝数浓度的dna模板(10-4-10-6
三个梯度稀释的pmd18-t-ms质粒)来评估ddpcr方法的重复性，测试结果如表1所示，每个稀释度的变异系数均小于5％，说明该方法的重复性好、准确度高，检测结果稳定、可靠。
104.表1.ddpcr重复试验结果
[0105][0106]
2.6、临床样品的检测结果
[0107]
对60份鸡病料临床样品的检测，ddpcr检测结果9份为mg阳性，核酸拷贝数在7-1000copies/μl，55份样品为阴性，5份样品为阳性，阳性检出率为8.3％(5/60)。qpcr检测获得同样结果。
[0108]
进一步进行临床样品检测，保存在-70℃的临床样品按1:5加入pbs溶液进行研磨，2000rpm/min离心5min，取上清200μl，按easypure virual dna/rna提取试剂盒说明书提取核酸模板，然后进行下一步反应。
[0109]
20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，20μmol/μl引物ms-f、ms-r各1μl，10μmol/μl探针ms-probe 1μl，核酸模板2μl，用ddh2o补足至20μl。
[0110]
生成微滴：在微滴生成卡dg8的第二、三排孔分别加入上述反应液20μl和微滴生成油70μl，盖上专用胶垫，置微滴生成仪上自动生成微滴于第一排。
[0111]
封膜：吸取生成的微滴至96孔板内，加盖铝膜置px1热封仪上，180℃10s进行封膜。
[0112]
pcr扩增：封膜的96孔板放入pcr扩增仪上进行扩增，反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度54℃1min(按照每秒降低2℃的速率降至54℃进行退火，)，40个循环；98℃10min；4℃结束。
[0113]
数据读取及分析：反应结束后将96孔板置qx200微滴读取仪上读取信号并进行数据分析。检测临床样品5份ms阳性结果见表2。
[0114]
表2.检测临床样品5份ms阳性结果
[0115][0116]
本试验建立了一种绝对定量检测ms的ddpcr方法，并对方法中的引物和探针浓度、退火温度进行优化，发现引物终浓度为1μmol/μl、探针浓度为0.5μmol/μl的情况下，反应具有最低的负荧光幅度(灰色)，阳性微滴信号(蓝色)高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。退火温度为54℃，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。
[0117]
本试验建立的ddpcr方法，与qpcr检测方法在灵敏性检测方面进行了比较。在定量检测相同稀释度的ms质粒dna 时，且ddpcr方法比qpcr方法检测的拷贝数更低1个滴度，更为灵敏。
[0118]
本方法中，阳性模板浓度过高，ddpcr扩增的阳性产物超出10000copies/μl时，系统会读不出拷贝数，在这种情况下，为更准确获取扩增阳性的阳性拷贝数，应对模板浓度进行一定浓度的稀释后才能成功获得检测的拷贝数。而对临床样品的检测，往往由于样品中的目的模板含量低，因而本方法更适合于临床样品的检测。
[0119]
本方法中，由于对操作的要求较高，在操作过程中所吸取的液体不能有气泡，而且扩增后读取的微滴总数(阳性和阴性微滴)应大于10000，这样ddpcr读取仪读出来的阳性微滴数比较准确。
[0120]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
技术特征：1.检测或辅助检测鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于：所述方法包括利用试剂或试剂盒对待测样品进行数字pcr，根据数字pcr产物确定或辅助确定待测样品是否为鸡滑液囊支原体或，是否含有鸡滑液囊支原体或，是否感染鸡滑液囊支原体，所述试剂或试剂盒为检测或辅助检测鸡滑液囊支原体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括鸡滑液囊支原体引物探针，所述鸡滑液囊支原体引物探针包括引物ms-f和引物ms-r、探针ms-probe，所述引物ms-f为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna；所述引物ms-r为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna；所述探针ms-probe的核苷酸序列是seq id no.4。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ms-f、ms-r、ms-probe的物质的量比值为2:2:1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述数字pcr试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。4.根据权利要求3所述的的方法，其特征在于：所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如seq id no.1所示的dna分子。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述数字pcr中采用的pcr体系中所述ms-f的含量为1μmol/μl，所述ms-r的含量为1μmol/μl，所述ms-probe的含量为0.5μmol/μl。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述数字pcr中采用的引物退火条件为54℃1分钟。7.权利要求1-6中任一项所述的试剂或试剂盒。8.权利要求7所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测鸡滑液囊支原体中的应用。9.权利要求7所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染鸡滑液囊支原体的应用。10.权利要求7所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测病原是否为鸡滑液囊支原体的应用。
技术总结本发明公开了检测鸡滑液囊支原体的方法及其所用试剂，属于核酸或微生物的测定或检验方法技术领域。本发明公开了检测或辅助检测鸡滑液囊支原体的方法，所述方法包括利用试剂或试剂盒对待测样品进行数字PCR，根据数字PCR产物确定待测样品是否为鸡滑液囊支原体或，是否含有鸡滑液囊支原体或，是否感染鸡滑液囊支原体，所述试剂或试剂盒包括鸡滑液囊支原体引物探针，所述鸡滑液囊支原体引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段在内的鸡滑液囊支原体基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段特异结合的探针组成。该方法可用于检测环境样品和食品。该方法可用于检测环境样品和食品。
技术研发人员：谢芝勋 谢志勤 张艳芳 范晴 谢丽基 万丽军 罗思思 李孟
受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5
