氢化链霉菌zjph2021031及其在制备抗菌剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及一株氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031及其在制备抗菌剂中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：2.由于抗生素的不规范使用和致病微生物不断增强的耐药性，导致寻找新型微生物来源的、具有抗菌活性化合物的需求与日俱增。研究发现放线菌在产生各种具有生物活性的次生代谢产物方面具有显著优势，例如抗菌药物达托霉素和抗癌分子瑞贝卡霉素等都来自于放线菌产生的。然而，人们由于长期重复从相同或相似的土壤微生物中分离天然产物时往往得到的是已知化合物，因此获取具有新颖骨架结构的抗菌天然产物的可能性大大降低。近年来，针对海洋环境中的微生物，人们的相关研究重点逐渐侧重于：(1)沿海和近海区(2)深海沉积物，且人们已经注意到，在浅海区域放线菌等微生物种群的密度要高于深海区域。本专利通过从采集自杭州湾钱塘江入海口附近的滨海盐土型土壤中分离放线菌，并从中寻找新型天然抑菌剂。
技术实现要素：3.本发明的目的是提供一株从杭州湾滨海盐土型土壤中筛选得到的，可产生具有抗菌活性物质的氢化链霉菌zjph2021031，以及由其产生的抗菌活性物质在抑菌方面的应用。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.第一方面，本发明提供一株氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m 2022490，保藏日期：2022年4月25日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
6.第二方面，本发明提供一种利用上述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株在制备具有抗细菌活性的抗菌剂中的应用。
7.进一步，本发明中用于抗菌活性评价的细菌为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、大肠杆菌(escherichia coli)或铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)。
8.在本发明的一种具体实施方案中，所述应用为：将所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031经发酵培养(30℃下培养)得到的发酵液应用于制备具有抗细菌活性的抗菌剂。
9.所述发酵培养的过程具体是：将所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031接种于ispii种子培养基中，30℃振荡培养24h后，以5％(v/v)的接种量接种到发酵培养基中，30℃振荡培养24h后，离心获得所述发酵液。
10.优选地，所述发酵培养使用的发酵培养基终浓度组成如下：甘油10.0～15.0g/l，l-酪氨酸0.2～0.8g/l，l-天冬酰胺0.8～1.3g/l，k2hpo
4 0.2～0.8g/l，mgso4·
7h2o 0.3～0.9g/l，nacl 0.2～1.0g/l，feso4·
7h2o 0.01～0.02g/l，溶剂为水，ph值为7.0-7.5。
11.优选地，所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油15g/l,l-酪氨酸0.5g/l,l-天冬酰胺1.0g/l,k2hpo
4 0.5g/l,mgso4·
7h2o 0.5g/l,nacl 0.5g/l,feso4·
7h2o 0.01g/l,溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
12.进一步，所述ispii种子培养基终浓度组成如下：酵母膏4.0g/l，麦芽汁10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
13.所述的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株，是从杭州湾滨海盐土型土壤中分离得到，该菌株的发酵液具有较强的抗菌活性。
14.本发明分离的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株，其菌落呈不透明且在培养基上隆起，菌落轮廓清晰，菌落不易挑起，显微镜下观察菌丝呈无序纤维状，属于革兰氏阳性菌，在5～40℃温度范围内均可生长，最适生长温度为26～30℃。所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的16s rrna序列如seq.no1所示。
15.本发明还提供了所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株发酵液具有的抑菌活性。所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的发酵液具有较强的抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌表现出高于50mm硫酸链霉素的抑菌活性，抗菌能力强。
16.本发明对所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的最优发酵培养基组成进行筛选，发现其经由以下组分组成的培养基发酵培养后，所得发酵液具有更高的抗菌活性。
17.培养基m6：甘油15.0g/l，l-酪氨酸0.5g/l，l-天冬酰胺1.0g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，nacl 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
18.本发明所述的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株，经发酵培养后所得发酵液具有较强的抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌表现出更强的抑菌活性。因此，利用该菌株发酵可制备相应的抗菌剂。
19.与现有技术相比，本发明提供的可发酵产生抗菌活性物质的菌株，是本发明人从杭州湾滨海盐土型土壤中分离获得的一株新菌株，该菌株经鉴定后，命名为氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031，其经发酵培养所得发酵液具有较强的抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性更好，可为制备新型抗菌剂提供新的微生物菌种和新途径，并且通过对该菌株发酵培养基的优化，可显著提高其发酵液的抗菌活性。
附图说明
20.图1为氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的系统发育树(n-j法)
21.图2为氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的菌落形态
22.图3为氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的显微镜照片(400
×
)
具体实施方式
23.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步具体说明。
24.实施例1
25.本实施例中所用的滨海盐土型土壤采集自浙江省宁波市慈溪县庵东镇杭州湾附近(东经121.189
°
，北纬30.365
°
)钱塘江出海口堤坝土壤。
26.本实施例中采用的筛选培养基为含重铬酸钾高氏一号合成培养基，各组分重量配比分别为:可溶性淀粉20.0g/l，kno
3 1.0g/l，nacl 0.5g/l，fe(so4)3·
7h2o 0.01g/l，mgso
4 0.24g/l，3h2o
·
k2hpo
4 0.752g/l，琼脂粉20.0g/l，重铬酸钾0.075g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
27.本实施例的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的筛选方法：
28.将采集的杭州湾滨海盐土型土壤经120℃干燥2h后，称取5g干燥土壤，加入至0.9％(w/v)无菌生理盐水中，在30℃下振荡30min，然后用无菌水梯度稀释到10-2
～10-5
。吸取100μl菌悬液涂布于含0.0075％(w/v)重铬酸钾的高氏一号合成培养基，30℃条件下进行筛选培养7天后转接至平板培养，挑取形态各异的单菌落至高氏一号培养基平板上划线转接3-5次进行培养，直至形成单菌落纯培养物，最终获得一株放线菌菌株。该菌株的菌落形态为微隆起，与培养基紧密结合不易挑取，有白色孢子聚集于表面且呈火山口状，记为菌株zjph2021031。
29.实施例2
30.本发明的菌株zjph2021031的分子生物学鉴定，即对本发明的菌株zjph2021031采用本领域常规的方法进行16s rdna的pcr扩增。更具体的描述为利用生工生物工程(上海)股份有限公司的细菌dna提取试剂盒提取菌株的全基因组，然后利用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的通用引物27f(agtttgatcmtggctcag)，1492r(:ggttaccttgttacgactt)进行pcr，pcr程序为预变性94℃5min 1cycle；变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃1min，35cycles；延伸72℃10min 1cycle；4℃保温。pcr产物经生工生物工程(上海)股份有限公司提供的pcr产物纯化试剂盒纯化后交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果如seq.no1所示。利用blast比对将本发明的菌株zjph2021031的16s rdna序列与ezbiocloud典型菌株数据库进行同源性比对，结果表明菌株zjph2021031的16s rdna序列与氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)jcm 4771的序列相似性为98.45％，然后通过mega(v7.0)采用邻接法(neighbor-joining,nj)构建菌株zjph2021031的系统发育树，结果表明本发明zjph2021031菌株与streptomyces hydrogenans jcm 4771菌株有87％的同源性，根据基因同源性对比，确定菌株zjph2021031为链霉菌属(streptomyces sp.)，命名为氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc m 2022490，保藏日期为2022年4月25日。
31.实施例3
32.选取采用实施例1的方法筛选得到的菌株streptomyces hydrogenans zjph2021031，将其接种至高氏一号合成固体培养基中，于45度斜插入灭菌后的盖玻片，在30℃条件下倒置培养7天，观察菌落形态及菌丝体生长情况。上述菌株zjph2021031的形态学特征及生理生化特征结果表明：结合图2所示，本发明的菌株zjph2021031的菌落呈不透明且有突起和褶皱，表面粗糙，有白色孢子产生，菌落轮廓清晰，菌体不易挑起，如图3所示，显微镜下(400
×
)观察其菌丝生长形态，气生菌丝粗而疏、基内菌丝细而密。另外本发明的
氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株属于革兰氏阳性菌，在5℃～40℃温度范围内均能够生长，最适生长温度为26℃～30℃。
33.实施例4
34.本发明所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株发酵液的抗菌活性
35.本实施例中所述的抑菌活性指示菌株选择金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，大肠杆菌(escherichia coli)，铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)。
36.本实施例中所采用的种子培养基ispii的重量配比如下：酵母膏4.0g/l，麦芽汁10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
37.本实施例中所采用的发酵培养基m1的重量配比如下：酵母膏4.0g/l，麦芽汁10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
38.将分离得到的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株接种至ispii种子培养基中，30℃振荡培养24h后，以5％(v/v)的接种量接种至100ml的m1发酵培养基中，于30℃振荡培养24h，离心获得发酵液，经离心除去菌体后，取10μl过滤除菌的发酵液样品滴加在滤纸片上，分别以10μl经过滤除菌的50mm硫酸链霉素水溶液和无菌水作为阳性对照和阴性对照，放置在37℃恒温培养箱中静置培养24h后，观察并测量抑菌圈大小，从而获得菌株streptomyces hydrogenans zjph2021031发酵液的抗菌活性。
39.具体描述为：
40.a.将经平板活化培养后的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株接种至ispii种子培养基中，30℃振荡培养24h后以5％(v/v)的接种量接种至100ml的m1发酵培养基中，于30℃振荡培养24h后离心获得发酵液，经离心除去菌体后4℃保存备用；
41.b.将经平板活化培养后的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌接种于50ml的lb液体培养基，在37℃，180rpm摇床振荡培养12h；
42.c.取2ml经步骤b制得的培养液，采用分光光度计测定相应培养液的od
600
数值，并用无菌水稀释菌液浓度至od
600
值为0.7-0.8范围(确保后续重复实验接入的实验菌株数量一致)；
43.d.取100μl菌悬液加到固体lb平板上，用涂布棒均匀涂布。置于37℃恒温培养箱培养30min。取出平板，向每个平板中均匀放入5片灭菌的圆形滤纸片，轻压滤纸片使得滤纸片与固体培养基完全接触。
44.e.根据设定的加样顺序，各取10μl经步骤a制得的发酵液过滤除菌后滴加到圆形滤纸片(滤纸片直径为6mm)的中间部分，同时每个含lb培养基的固体平板中分别设置加有与发酵液等体积的无菌水和经过滤除菌的50mm硫酸链霉素水溶液的两个滤纸片作为阴性对照和阳性对照。
45.f.随后将固体平板在37℃下培养24h，观察并测量抑菌圈大小，评价所述菌株氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031发酵液的抗菌活性。
46.实施例5
47.本实施例产生具有抗菌活性物质的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的培养及发酵方法与实施例4一致，区别仅在于：
48.本实施例中所用的发酵培养基为m2培养基，该培养基各组分的配比为：胰蛋白胨10.0g/l，酵母浸膏5.0g/l，nacl 10.0g/l，溶剂为水，ph值为7.0-7.4。
49.其他操作步骤同实施例4，这里不再赘述。
50.实施例6
51.本实施例产生具有抗菌活性物质的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的培养及发酵方法与实施例4一致，区别仅在于：
52.本实施例中所用的发酵培养基为m3培养基，该培养基各组分的配比为：葡萄糖40.0g/l，蛋白胨10.0g/l，溶剂为水，ph值为5.8-6.2。
53.其他操作步骤同实施例4，这里不再赘述。
54.实施例7
55.本实施例产生具有抗菌活性物质的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的培养及发酵方法与实施例4一致，区别仅在于：
56.本实施例中所用的发酵培养基为m4培养基，该培养基各组分的配比为：m4:k2hpo
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 2.0g/l，nacl 2.0g/l，(nh4)2so
4 4.0g/l，caco
3 4.0g/l，溶剂为水，ph值为7.0-7.4。
57.其他操作步骤同实施例4，这里不再赘述。
58.实施例8
59.本实施例产生具有抗菌活性物质的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的培养及发酵方法与实施例4一致，区别仅在于：
60.本实施例中所用的发酵培养基为m5培养基，该培养基各组分的配比为：l-天冬酰胺1.0g/l，甘油10.0g/l，k2hpo
4 1.0g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.5。其他操作步骤同实施例4，这里不再赘述。
61.实施例9
62.本实施例产生具有抗菌活性物质的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031菌株的培养方及发酵法与实施例4一致，区别仅在于：
63.本实施例中所用的发酵培养基为m6培养基，该培养基各组分的配比为：甘油15g/l，l-酪氨酸0.5g/l，l-天冬酰胺1.0g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，nacl 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
64.其他操作步骤同实施例4，这里不再赘述
65.表2氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031经不同发酵培养基培养后所得发酵液的抑菌活性
66.[0067][0068]
以硫酸链霉素作为阳性对照；无菌水作为阴性对照；抑菌圈单位为毫米(mm)
[0069]
如表2所示，本发明菌株streptomyces hydrogenans zjph2021031经培养后所得发酵液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及大肠杆菌具有明显的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌表现出最优的抑菌活性，表明streptomyces hydrogenans zjph2021031菌株的发酵液中产生了具有明显抑制金黄色葡萄球菌的天然化合物，该菌株具有开发针对耐药金黄色葡萄球菌的新型抗菌剂的应用价值。从表2也可知，相对于初始发酵培养基m1(isp ii)，菌株zjph2021031在m6发酵培养基中对革兰氏阳性菌展现出更高的抑菌活性，因此用于生产抗菌剂的最佳发酵培养基种类为m6。由此可得出，streptomyces hydrogenans zjph2021031菌株在单纯以氨基酸做为氮源，并且含多种金属离子的培养基中培养后得到的发酵液的抗菌活性更强。
[0070]
技术特征：1.一种氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m 2022490，保藏日期：2022年4月25日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。2.如权利要求1所述的氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031在制备具有抗细菌活性的抗菌剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或铜绿假单胞杆菌。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述细菌为金黄色葡萄球菌。5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031经发酵培养得到的发酵液应用于制备抗菌剂。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵培养的温度为30℃。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养按如下步骤操作：将所述氢化链霉菌(streptomyces hydrogenans)zjph2021031接种在ispii种子培养基中，30℃振荡培养24h后，以5％的体积接种量接种到发酵培养基中，30℃振荡培养24h后离心获得所述发酵液。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油10.0～15.0g/l，l-酪氨酸0.2～0.8g/l，l-天冬酰胺0.8～1.3g/l，k2hpo
4 0.2～0.8g/l，mgso4·
7h2o 0.3～0.9g/l，nacl 0.2～1.0g/l，feso4·
7h2o 0.01～0.02g/l，溶剂为水，ph值为7.0-7.5。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油15g/l,l-酪氨酸0.5g/l,l-天冬酰胺1.0g/l,k2hpo
4 0.5g/l,mgso4·
7h2o 0.5g/l,nacl 0.5g/l,feso4·
7h2o 0.01g/l,溶剂为水，ph值为7.2-7.4。10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述ispii种子培养基终浓度组成如下：酵母膏4.0g/l，麦芽汁10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，溶剂为水，ph值为7.2-7.4。
技术总结本发明涉及氢化链霉菌ZJPH2021031及其在制备抗菌剂中的应用，该菌株具有较强的抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强，为抗菌剂的制备提供了新的微生物来源和新的途径。且本发明通过发酵培养基的优化进一步显著提高获得菌株的发酵液的抗菌活性。提高获得菌株的发酵液的抗菌活性。
技术研发人员：王普 刘汉宇 施宣任 金炜炜
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2022.05.11
技术公布日：2022/7/5
