no：01所示，所述sgrna-rictor-r的核苷酸序列如seq id no：02所示；步骤二：重组真核表达质粒的构建：将步骤一合成的两条核苷酸链经退火形成双链，并与载体质粒连接，验证正确后获得重组真核表达质粒；步骤三：将经步骤二构建的重组真核表达质粒转染df-1细胞，经筛选、验证，获得rictor基因敲除细胞株。
8.优选地，步骤二所述载体质粒为px459-puro载体。
9.本发明还另外提供所述的sgrna或上述构建方法在rictor基因敲除细胞株制备中的应用。
10.有益效果：本发明通过设计和合成rictor的sgrna，利用crsipr技术构建rictor基因敲除细胞株，rictor基因敲除细胞株df-1
δrictor
与df-1正常细胞株通过cck8实验检测，发现二者在细胞活性上没有显著的差异。在连续传代后，检测细胞的rictor基因mrna的转录以及对该段基因组测序，发现构建的细胞株十分稳定。
附图说明
12.图1是crispr-cas9系统敲除鸡源rictor基因测序结果图；图2是rictor基因敲除细胞系qrt-pcr验证结果图；图3是重组真核表达质粒px459-rictor-puro谱图。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
14.1.sgrna设计与合成。
15.根据ensembl公布的鸡源rictor(ensgalg00000002661)基因下载相应核苷酸序列，利用在线sgrna设计工具(http://crispor.tefor.net)设计rictor的sgrna(small guide rna)，引物送到生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成的引物序列如下表1所示。
16.表1：sgrictor序列。
17.2.重组真核表达质粒px459-rictor-puro的构建。
18.退火：将两条设计好的sgrna-rictor单链用无菌超纯水溶解成终浓度为100μmol/l，轻弹混匀，使用t4连接酶配成以下体系，在pcr仪中退火形成双链。
19.退火体系如下表2所示。
20.表2：退火体系。
21.酶切：用bbsi内切酶将px459-puro载体进行酶切，酶切体系如下。
22.产物胶回收：(1)使用琼脂糖凝胶电泳分离出线性化载体的dna片段，在紫外灯下迅速切下所需条带；(2)按照每1g凝胶加入1ml binding buffer的量加入适量溶胶液，在55～60℃水浴至凝胶完全溶解，溶解过程中每隔2～3min震荡1次；(3)当凝胶完全溶解后，将hibind dna柱子套在2ml收集管上，把溶胶液转移至hibind dna柱子中10 000xg离心1min，弃掉滤液，收集柱子，直至溶胶液全部转移；(4)在柱子中加入300μl binding buffer,以最大转速离心1min，弃掉滤液，收集柱子；(5)在柱子中加入700μl spw wash buffer,以最大转速离心1min，弃掉滤液，收集柱子；(6)重复步骤(5)1次；(7)最大转速离心空柱2min；(8)将柱子转移到干净的1.5ml ep管中，加入30μl预热的elution buffer，静置2min，以最大转速离心1min，洗脱出dna。
23.连接：将线性化载体的胶回收产物及sgrna的退火产物测定浓度，根据载体长度、sgrna长度以及两者的浓度，计算t4连接酶连接体系，16℃过夜连接。
24.构建的重组真核表达质粒px459-rictor-puro如图3所示。
25.转化：(1)从-80℃超低温冰箱中取出感受态细胞dh5α(100μl/管)和需要转化的质粒，置于冰上融化10min；(2)吸取50μl感受态细胞至预冷的新的灭菌1.5ml离心管中，加入1μg真核表达质粒，用移液器轻柔搅拌混匀，然后置于冰上冰浴25min；(3)将冰浴后的菌液从冰中取出，迅速置于42℃水浴锅中热冲击75s，再迅速放回冰上修复3min；(4)加入500μl无抗lb液体培养基，置于37℃摇床以150～200rpm的频率，振荡培养45min；
(5)取100μl培养好的菌液均匀涂抹于与载体抗性相应的lb固体培养基平板上，晾干后，于37℃培养箱中倒置培养12～16h；(6)待平板出现针尖样大小的单菌落时，用灭菌的镊子夹取灭菌的10μl吸头轻柔刮取单个菌落，置于2ml的灭菌离心管中，并加入1ml与载体抗性相应的lb液体培养基，置于37℃摇床以150～200rpm的频率，振荡培养4～6h；(7)待离心管中的lb液体培养基变浑浊时，置于4℃保存，并选取浑浊的送至上海生工生物有限公司测序鉴定；(8)测序正确的阳性菌液可用于扩大培养，扩大培养后进行质粒提取。
26.质粒提取：(1)将测序正确的阳性菌液以1:100的比例加入与载体抗性相应的lb液体培养基中，置于37℃摇床以150～200rpm的频率，振荡培养12～16h；(2)取10～15ml的菌液，用15ml离心管，室温8 000g离心1min，弃去上清液；(3)加入500μl已预混了rnase a的solution i，充分振荡2min；(4)加入500μl solution ii，将离心管轻柔上下颠倒混匀10次或以上，至管中液体清亮，室温静置2～3min；(5)加入250μl已预冷至4℃的buffer n3，将离心管轻柔上下颠倒混匀10次或以上，至管中白色絮状沉淀不再增加，室温12 000g离心10min，若管中上清液中仍有少量白色沉淀，则将管中上清液转移至新的15ml离心管中再次离心；(6)吸取上清液并与等体积的etr binding buffer上下颠倒充分混匀；(7)取700μl的混合液加入hibind dna mini吸附柱中，室温10 000g离心1min，弃去滤液，直至所有混合液过滤完毕；(8)加入500μl的etr wash buffer，室温10 000g离心1min，弃去滤液；(9)加入500μl的hbc buffer，室温10 000g离心1min，弃去滤液；(10)加入700μl的dna wash buffer，室温10 000g离心1min，弃去滤液，重复1次；(11)空柱室温13 000g离心4min，弃去收集管，将吸附柱置于无菌的1.5ml离心管中，将65μl预热至65℃的elution buffer加至吸附柱的滤膜上，65℃温箱中静置2min，13000g离心1min。
27.质粒转染：在6孔细胞培养板中，每孔吸入2.5ml df-1细胞悬液，细胞培养条件同上；在贴壁密度达到40％～50％时，转染质粒，步骤如下：(1)将100μl opti-mem和2μg质粒加入1.5ml无菌ep管中制成a液，混匀室温静置3min；(2)另一个ep管中将100μl opti-mem和5μl lipofectamine 2000制成b液，轻微震荡后放置3min；(3)a和b混合为c液，室温静置15min，静置期间2ml pbs清洗细胞2次，最后1次吸干净剩余pbs；(4)细胞孔吸入c液，并用补1ml的opti-mem，反复倾斜并晃动细胞培养板，混匀后置于培养箱中4～6h，pbs洗2次后吸干净，细胞孔内吸入2ml维持培养基(2％fbs)，培养条件同上。
28.药物筛选敲除细胞株：(1)将上一步构建好的质粒转染进一个t25细胞培养瓶的df-1细胞中；经转染24h后弃去培养基，用pbs缓冲液润洗3次，加入含1μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基，39℃、5％co2细胞培养箱中培养24～48h；(2)当显微镜下观察到细胞数减少至约10 000个时，弃去培养基，用pbs缓冲液润洗3次后加入含20％fbs的dmem培养基，39℃、5％co2细胞培养箱中培养24h；(3)将细胞用胰酶消化下来，用含20％fbs的dmem培养基将细胞梯度稀释铺至24孔细胞培养板中，39℃、5％co2细胞培养箱中培养24h；(4)将1孔中只有一个细胞的孔标记出来，待细胞培养至汇合度为90％时，即可挑取细胞进行敲除验证试验。
29.敲除细胞株验证：抽提目的细胞的基因组dna作为模板，扩增rictor片段后送上海生工公司对敲除段进行序列分析，扩增引物如表3。如图1所示，rictor基因组被成功敲除掉1个碱基，表明筛选到了df-1
δrictor
细胞系。
30.表3：扩增引物表。
31.将筛选的df-1
δrictor
细胞培养后收集细胞沉淀样品，抽提rna进行qrt-pcr试验，验证rictor基因的敲除效果。结果如图2显示，df-1
δrictor
细胞系中rictor基因mrna转录水平几乎接近于0，敲低效果显著(p《0.0001)。
32.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
技术特征：1.一种用于rictor基因敲除的sgrna，其特征在于：合成所述sgrna的引物序列为sgrna-rictor-f和sgrna-rictor-r，所述sgrna-rictor-f的核苷酸序列如seq id no：01所示，所述sgrna-rictor-r的核苷酸序列如seq id no：02所示。2.基于crsipr技术构建rictor基因敲除细胞株的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：sgrna的设计与合成：设计用于rictor基因敲除的sgrna，合成sgrna-rictor-f和sgrna-rictor-r两种引物序列，所述sgrna-rictor-f的核苷酸序列如seq id no：01所示，所述sgrna-rictor-r的核苷酸序列如seq id no：02所示；步骤二：重组真核表达质粒的构建：将步骤一合成的两条核苷酸链经退火形成双链，并与载体质粒连接，验证正确后获得重组真核表达质粒；步骤三：将经步骤二构建的重组真核表达质粒转染df-1细胞，经筛选、验证，获得rictor基因敲除细胞株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤二所述载体质粒为px459-puro载体。4.权利要求1所述的sgrna序列或权利要求2-3任意一种所述的方法在rictor基因敲除细胞株制备中的应用。
技术总结本发明涉及基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法及其应用，属于生物技术领域，所述方法包括：首先设计用于RICTOR基因敲除的sgRNA，合成sgRNA-RICTOR-F和sgRNA-RICTOR-R两种引物序列；将合成的两条核苷酸链经退火形成双链，并与载体质粒连接，验证正确后获得重组真核表达质粒；将经构建的重组真核表达质粒转染DF-1细胞，经筛选、验证，获得RICTOR基因敲除细胞株。该基因敲除细胞株DF-1
技术研发人员：任涛 陈依依 蔡俊呈 陈礼斌 林秋燕
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.04.19
技术公布日：2022/7/5
