ctrp3与ctrp15作为生物标志物在制备早期诊断自发性脑出血产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，特别是涉及ctrp3与ctrp15作为生物标志物在制备早期诊断自发性脑出血产品中的应用。
背景技术：2.自发性脑出血(spontaneous intracerebral hemorrhage，sich)是由非外伤性脑实质血管破裂引起的常见脑血管急性疾病，发病率、致残率和死亡率均较高。脑出血后血液在脑组织中迅速聚集，导致颅内压升高，脑组织缺血缺氧，造成患者神经功能障碍，甚至威胁生命。因此临床寻找具有较高灵敏度和特异性的生物标志物，有助于预知病情的早期诊断和演变，更重要的是可以评估治疗效果和预后，并指导个体化治疗，对于判断神经功能受损程度和预测病情预后有重大意义。
3.c1q/肿瘤坏死因子相关蛋白(c1q/tumor necrosis factor-related protein，ctrp)家族有15个家族成员(ctrp 1-15)。除ctrp4外，ctrps均含有一个氨基末端的信号肽，一个短的可变结构域，一个胶原样结构域和一个与补体蛋白c1q同源的羧基末端球形结构域，此球形结构域是发挥生物学功能的重要结构域。ctrps存在不同的聚合形式，包括三聚体、六聚体、高分子量多聚体和异源多聚体。ctrps参与调控机体糖脂代谢、炎症和免疫等诸多生理和病理过程，与动脉粥样硬化、缺血性心肌病、高血压等心血管疾病以及肥胖、糖尿病等代谢性疾病密切相关。
4.目前正在研究中的血清标志物很多，但很少能直接应用于临床。本发明的ctrp3单独以及与ctrp15联合作为自发性脑出血的血清诊断标志物还未见报道。
技术实现要素：5.本发明的目的是提供ctrp3与ctrp15作为生物标志物在制备早期诊断自发性脑出血产品中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，可以高灵敏度特异性的早期诊断自发性脑出血。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供用于检测生物标志物的表达水平的产品在制备早期诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒中的应用，所述生物标志物为单独的ctrp3蛋白，或者ctrp3蛋白与ctrp15蛋白联合。
8.优选的是，所述检测生物标志物的表达水平为具体包括：
9.检测待测对象血清中ctrp3蛋白和ctrp15蛋白的表达水平；
10.将所检测的血清中的ctrp3蛋白和ctrp15蛋白的表达水平与健康人血清中的ctrp3蛋白和ctrp15蛋白的表达水平进行比对；
11.基于所述比对的结果指示所述待测对象是否为自发性脑出血。
12.优选的是，所述待测对象血清中的ctrp3≥20.49ng/ml，或者ctrp3≥20.49ng/ml
且ctrp15≥266.44ng/ml，则指示所述待测对象为自发性脑出血。
13.优选的是，所述产品包括试剂和试剂盒。
14.本发明还提供ctrp3蛋白，或者ctrp3蛋白与ctrp15蛋白联合作为生物标志物在制备早期诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒中的应用。
15.本发明还提供一种诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒，包含生物标志物ctrp3蛋白和/或ctrp15蛋白。
16.本发明公开了以下技术效果：
17.本发明通过实验检测发现自发性脑缺血病人在缺血后(6-72)h血清ctrp3、ctrp6和ctrp15水平均明显升高，说明血清ctrp3或者ctrp3和ctrp15联合对自发性脑出血更具诊断价值。通过实验验证，结果发现ctrp3以ctrp3≥20.49ng/ml为截断值，其对自发性脑出血诊断的敏感性为85.0％，特异性为70.0％；ctrp15以ctrp15≥266.44ng/ml为截断值，其对自发性脑出血诊断的敏感性为40.0％，特异性为90.0％。可见，本发明单独以ctrp3蛋白或者ctrp3和ctrp15联合作为生物标志物可以高灵敏度特异性的早期诊断自发性脑出血，为减少自发性脑出血或者其带来的相关病症的降低提供了科学依据。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为自发性脑出血患者和健康者的血清ctrp3、ctrp6和ctrp15的水平；
20.图2为ctrp3、ctrp6、ctrp15以及ctrp3和ctrp15联合诊断自发性脑出血的roc曲线，横坐标为1-特异性，纵坐标为敏感性。
具体实施方式
21.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
22.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
23.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
24.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实
施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
25.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
26.实施例1自发性脑出患者血清ctrp3、ctrp6和ctrp15的检测
27.1、样本收集
28.选取首钢水钢医院神经外科住院病例2020年10月至2021年1月住院就诊的40例自发性脑出血患者作为实验组，由经验丰富的神经外科医生进行病史采集和体格检查并最终确诊。选取本院同期健康体检者40例作为对照组。实验组男性34例，女性6例，年龄(33～74)岁，平均(57.03
±
9.42)岁。对照组男性27例，女性13例，年龄(28～75)岁，平均(51.83
±
13.61)岁。
29.纳入标准：
①
符合全国第五届脑血管病会议明确的自发性脑出血诊断标准；
②
年龄≥18岁；
③
所有患者均经过医院的头颅ct或mri检查证实有明确的出血灶；
④
伴有头痛、恶心、呕吐，且患者肢体出现不同程度的功能障碍；
⑤
出血量30～60ml；
⑥
患者或者家属知晓并愿意参加本次研究，签署知情同意书。
30.排除标准：
①
未经头颅ct或者mri检查确诊；
②
因脑外伤或脑肿瘤导致的脑出血者；
③
冠心病病例；
④
严重肾功能不全者；
⑤
深度昏迷者；
⑥
临床资料不全者。
31.在患者知情同意条件下选取病例，收集患者相关临床检查及化验数据。患者脑出血后(6-72)h，采集肘正中静脉血约4ml，4℃静置2h，以3000rpm/min离心15min，收集上层血清至冻存管，标记患者住院号或id号并保存于-80℃冰箱待检。
32.2、酶联免疫吸附试验(elisa)
33.elisa试验检测血清ctrp1、ctrp2、ctrp3、ctrp5、ctrp6、ctrp9、ctrp12和ctrp15等共8个蛋白的浓度，elisa试剂盒均购于武汉华美生物工程有限公司，严格按照试剂盒的说明书进行操作。将各种试剂移至室温(18-25)℃平衡至少30分钟，配制各种试剂备用。设置标准品孔和待测样品孔。将标准品、实验组和对照组受试者血清样本直接以100μl/孔加入到96孔酶标板中，轻轻晃动均匀，覆上板帖，37℃温育2小时。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl，覆上新的板帖，37℃温育1小时。弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200μl/孔，甩干。每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，覆上新的板帖，37℃温育1小时。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200μl/孔，甩干。依次每孔加入底物溶液90μl，37℃避光显色(15-30)分钟。依次每孔加入终止液50μl，终止反应。在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od值)。以标准品的浓度为纵坐标，od值为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线进行ctrp相关蛋白浓度分析，采用两样本t检验比较组间变量差异，结果如图1所示。其他蛋白与对照组比对后均无统计学差异。
34.使用elisa试验分析自发性脑出血患者和健康个体的血清样品的ctrp相关蛋白表达水平。结果表明：自发性脑出血患者(实验组)血清ctrp3蛋白浓度为(20.88
±
2.17)ng/ml，血清ctrp6蛋白浓度为(2.01
±
1.46)ng/ml，血清ctrp15蛋白浓度为(269.99
±
239.29)ng/ml，n＝40。健康体检者(对照组)血清ctrp3蛋白浓度为(15.95
±
5.89)ng/ml，血清ctrp6蛋白浓度为(1.35
±
0.78)ng/ml，血清ctrp15蛋白浓度为(129.76
±
112.10)ng/ml，n＝40。
35.实施例2评估ctrp3、ctrp6、ctrp15以及ctrp3和ctrp15联合对自发性脑出血的诊
断价值
36.利用spss 20.0数据统计软件通过roc曲线下面积(auc-roc)评估ctrp3、ctrp6、ctrp15以及ctrp3和ctrp15联合对自发性脑出血的诊断价值，通过roc曲线确定诊断阈值，p《0.05认为有显著统计学意义，结果如图2和表1。
37.表1 roc曲线分析ctrp3和ctrp的曲线下面积
[0038] aucyouden’index95％cip值ctrp30.8130.5500.719-0.9050.000ctrp60.5700.2500.442-0.6980.281ctrp150.6930.3000.579-0.8070.003ctrp3+ctrp150.8120.5500.719-0.9050.000
[0039]
auc-roc分析表明：ctrp3和ctrp15具有诊断价值。根据roc曲线坐标分析显示：ctrp3以ctrp3≥20.49ng/ml为截断值，其对自发性脑出血诊断的敏感性为85.0％，特异性为70.0％。ctrp15以ctrp15≥266.44ng/ml为截断值，其对自发性脑出血诊断的敏感性为40.0％，特异性为90.0％。以血清ctrp3、ctrp15水平为自变量，自发性脑出血发生情况为因变量(不出血＝0，出血＝1)，进行logistic线性回归拟合，得到回归方程为logit(p)＝-0.376+0.042ctrp3+0.001ctrp15，概率值变量公式pre-1＝1/[1+exp(-logit(p))]。根据回归模型中的概率值pre-1拟合联合roc曲线结果显示，ctrp3和ctrp15联合诊断的敏感性、特异性以及95％ci高于ctrp15单独检测，接近于ctrp3单独检测。结果表明ctrp3单独以及与ctrp15联合作为自发性脑出血的标志物应用于临床是可行的。
[0040]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术特征：1.用于检测生物标志物的表达水平的产品在制备早期诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物为单独的ctrp3蛋白，或者ctrp3蛋白与ctrp15蛋白联合。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测生物标志物的表达水平为具体包括：检测待测对象血清中ctrp3蛋白和ctrp15蛋白的表达水平；将所检测的血清中的ctrp3蛋白和ctrp15蛋白的表达水平与健康人血清中的ctrp3蛋白和ctrp15蛋白的表达水平进行比对；基于所述比对的结果指示所述待测对象是否为自发性脑出血。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述待测对象血清中的ctrp3≥20.49ng/ml，或者ctrp3≥20.49ng/ml且ctrp15≥266.44ng/ml，则指示所述待测对象为自发性脑出血。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂和试剂盒。5.ctrp3蛋白，或者ctrp3蛋白与ctrp15蛋白联合作为生物标志物在制备早期诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒中的应用。6.一种诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含生物标志物ctrp3蛋白和/或ctrp15蛋白。
技术总结本发明公开了CTRP3与CTRP15作为生物标志物在制备早期诊断自发性脑出血产品中的应用，属于生物医学领域。具体公开了：用于检测生物标志物的表达水平的产品在制备早期诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒中的应用，所述生物标志物为单独的CTRP3蛋白，或者CTRP3蛋白与CTRP15蛋白联合。以及CTRP3蛋白，或者CTRP3蛋白与CTRP15蛋白联合作为生物标志物在制备早期诊断自发性脑出血的试剂或者试剂盒中的应用。本发明通过临床数据验证CTRP3或者CTRP3和CTRP15联合作为生物标志物可以高灵敏度特异性的早期诊断自发性脑出血，为减少自发性脑出血或者其带来的相关病症的降低提供了科学依据。据。据。
技术研发人员：张方博 潘文 杨洪军
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：2022.04.07
技术公布日：2022/7/5
