一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物科技领域，具体涉及一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法。
背景技术：2.hpv感染是发生宫颈癌的必要条件，归因危险百分比超过95％，hpv阴性者几乎不会得宫颈癌。据统计，高达75％的女性在其一生中都可能感染hpv4，平均感染时间为8个月，多数可以清除，并不会发展为癌前病变或宫颈癌。间隔1年2次同一亚型的hpv持续阳性，为hpv持续感染，28％的持续感染者在2年内发展为cini，70％的持续感染者在4年内发展为ciniⅱ。因此，高危型hpv持续感染是宫颈癌前病变和宫颈癌发生的根本原因。对于持续高危型hpv感染的患者进行积极有效的抗hpv治疗，可预防宫颈癌的发生。因此，预防和清除hpv，阻断和逆转宫颈癌前病变(cini)，对于预防和治疗女性宫颈癌具有重要意义。
3.目前针对hpv病毒引起的妇科疾病的治疗技术有：针剂肌肉注射、口服药物、手术等，这些方法对人体的副作用比较大；还有的药物治疗主要通过阴道给药，常用阴道给药制剂的剂型主要有栓剂、凝胶剂、泡腾片、阴道片、洗剂、胶囊剂、膜剂等，但这些剂型或多或少存在一些缺陷，影响药物发挥作用，比如栓剂、阴道片、泡腾片、胶囊剂以及膜剂作为固体制剂，在体温下逐渐释放药物作用于阴道，接触面积小，药效发挥速度较慢，虽然固体制剂有良好的局部滞留能力，但是用药范围无法覆盖整个阴道；洗剂作为清洗阴道的药物虽然能快速清洁、滋润阴道而提高药效发挥的速度，但是局部作用时间过短且洗剂容易溢出体外，起到的护理、杀菌作用较差，而且经常用大量洗剂清洁生殖道，会破坏阴道天然的防护机制以及生态平衡。
4.妇科敷料由高分子聚合物吸水溶胀后形成一种具有三维立体网状结构的胶状物质构成，其含水量高，可保持创面的局部湿润环境，同时吸收组织分泌液，可提供利于伤口愈合的环境。含绿茶外泌体的敷料有着独特的优势，绿茶提取物作为一种天然的抗氧化剂及抑菌剂，将其载入外泌体中可以保护绿茶提取物免于遭受环境的破坏。绿茶外泌体表面由脂质和蛋白质组成，使其可以穿透许多生物膜，提高药物的运输效率和靶向性，可以稳定存在于血液中。含绿茶外泌体的敷料能够消炎杀菌、散结化瘀，能够缓解hpv病毒患者的大多病症，还能解决由于病毒侵害还存在皮肤组织受损、瘙痒、干涩等问题。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：0.5～1.5份酸酐化生物蛋白、10～15份绿茶提取物、0.7～1.5份卡波姆、0.1～0.8份壳聚糖、5～13份甘油、0.1～0.5份山梨酸、65～83份纯化水。
8.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括如下步骤：
9.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为200～500r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
10.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为800～900r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
11.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为3000～5000r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
12.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用更温和的hpv治疗方法，采用绿茶外泌体作为内源性的天然药物载体有着独特的优势，表面由脂质和蛋白质组成，使其可以穿透许多生物膜，提高药物的运输效率和靶向性，可以稳定存在于血液中。绿茶提取物作为一种天然的抗氧化剂及抑菌剂，易受ph、温度及离子浓度等因素的影响而失去生物活性。载入外泌体中作为一种行之有效的方法可以保护绿茶提取物免于遭受环境的破坏。绿茶外泌体的敷料具有强抑菌作用，因此对人乳头瘤病毒(hpv)具有较强抑制作用，并对hpv病毒感染引起的尖锐湿疣以及宫颈癌具有治疗和预防作用。不仅能促进伤口愈合，且能在阴道形成保护膜防止细菌侵袭，在治疗hpv的同时，修护阴道为生态环境，降低复发风险，避免反复治疗。
附图说明
14.图1为本发明一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料的透射电子显微镜图。
具体实施方式
15.下面结合实施例，进一步对本发明做出详细说明。
16.实施例1
17.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：0.5份酸酐化生物蛋白、10份绿茶提取物、1.5份卡波姆、0.1份壳聚糖、13份甘油、0.1份山梨酸、83份纯化水。
18.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括如下步骤：
19.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为200r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
20.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为900r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
21.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为3000r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
22.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8
～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
23.实施例2
24.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：0.7份酸酐化生物蛋白，11份绿茶提取物，1.3份卡波姆，0.2份壳聚糖，12份甘油，0.2份山梨酸，73份纯化水。
25.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
26.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为250r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
27.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为880r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
28.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为3500r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
29.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
30.实施例3
31.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：0.9份酸酐化生物蛋白，12份绿茶提取物，1.1份卡波姆，0.3份壳聚糖，11份甘油，0.3份山梨酸，70份纯化水。
32.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
33.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为300r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
34.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为860r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
35.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为4000r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
36.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
37.实施例4
38.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：1.1份酸酐化生物蛋白，13份绿茶提取物，0.9份卡波姆，0.4份壳聚糖，7份甘油，0.4份山梨酸，76份纯化水。
39.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下
步骤：
40.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为350r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
41.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为840r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
42.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为4500/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
43.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
44.实施例5
45.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：1.3份酸酐化生物蛋白，14份绿茶提取物，0.7份卡波姆，0.5份壳聚糖，5份甘油，0.5份山梨酸，79份纯化水。
46.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
47.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为400r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
48.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为820r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
49.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为5000r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
50.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
51.实施例6
52.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：1.5份酸酐化生物蛋白，15份绿茶提取物，0.7份卡波姆，0.8份壳聚糖，5份甘油，0.5份山梨酸，65份纯化水。
53.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
54.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为500r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
55.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为800r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
56.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为5000r/min的条件下，
绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
57.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
58.实施例7
59.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：1.5份酸酐化生物蛋白，10份绿茶提取物，1.5份卡波姆，0.1份壳聚糖，13份甘油，0.1份山梨酸，79份纯化水。
60.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
61.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为450r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
62.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为820r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
63.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为4500r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
64.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
65.实施例8
66.本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，包括以下重量配比的组分：1.2份酸酐化生物蛋白，14份绿茶提取物，1.0份卡波姆，0.6份壳聚糖，8份甘油，0.3份山梨酸，74份纯化水。
67.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
68.(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为400r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；
69.(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为840r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；
70.(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为4000r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；
71.(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。
72.为研究实施例6制备的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料的相关性能与功效，进行如下实验：
73.一、形态实验
74.采用差速超高速离心的方法从本发明的妇科敷料中分离出一定浓度的微小囊泡颗粒。为确定这些颗粒是否为所需外泌体，因此对所得外泌体进行了如下鉴定。通过透射电镜，可以观察到一定数量的由脂双层包被的囊泡状结构，具有典型的杯状形态(见图1)。进一步确定所提制剂中囊泡的大小，进行粒径分析。分析结果显示，样品中小囊泡的粒径范围是20-200nm，其中直径为127.7纳米的小囊泡的富集程度较高，占总量的50％，且该条件符合公认的对外泌体的定义。
75.二、体外透皮渗透实验
76.采用franz扩散池法进行体外透皮渗透实验，将猪皮肤置于给药池底部，本发明的妇科敷料以及(碧凯)保妇康栓对照组适量分别均匀涂于给药池的皮肤表面，以5％吐温80的pbs缓冲液(ph7.4)作为接收液，24h后取下皮肤组织，剪切后用80％乙醇沸水浴萃取30min，取萃取液进行液相色谱分析，测定皮肤中滞留样品含量，计算皮肤滞留量，实验结果见表1。
77.表1体外透皮渗透实验的皮肤滞留量
[0078][0079]
体外透皮渗透实验研究表明本发明的妇科敷料可显著提高药物的皮肤滞留量，达到局部外用抗hpv病毒的效果，有利于延长药物发挥局部治疗作用时间。
[0080]
三、动物实验
[0081]
1.实验动物
[0082]
将120只感染hpv的模型雌性sd大鼠作为研究对象，按随机数字表法分为观察组(40只)、空白组(40只)与对照组(40只)。
[0083]
2.实验方法
[0084]
对照组使用(碧凯)保妇康栓治疗，观察组使用本发明的妇科敷料，空白组使用生理盐水治疗。每天给药1次，连续用药1个月。
[0085]
3.观察指标
[0086]
(1)观察三组治疗前后的血清nkts、vegf水平。血清nkts、vegf水平通过采取免疫磁珠法及酶联免疫法进行测定。
[0087]
(2)观察三组用药后hpv转阴率。
[0088]
4.统计学分析
[0089]
数据采用spss 23.0软件处理，计量资料以(x
±
s表示，行t检验，计数资料以n(％)表示，行x2检验，p＜0.05为差异具有统计学意义。
[0090]
5.实验结果
[0091]
(1)治疗前后血清nkts、vegf水平比较。
[0092]
治疗前血清nkts、vegf水平，无明显差异(p＞0.05)；治疗后对照组和观察组的血清nkts、vegf水平均有明显升高，而空白组无明显升高，观察组高于对照组(p＜0.05)。实验结果见表2。
[0093]
表2两组治疗前后血清nkts、vegf水平比较(x
±
s)
[0094][0095]
(2)三组hpv转阴率比较
[0096]
对照组和观察组用药后hpv转阴率均较空白组高，观察组用药后hpv转阴率又远高于对照组(p＜0.05)。实验结果见表3。
[0097]
表3三组hpv转阴率比较n(％)
[0098][0099]
综上所述，使用本发明一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料治疗hpv有较好转阴率，使血清nkts、vegf水平提升，具有较好的调节免疫功能，可减轻炎症反应，疗效确切，产品温和无刺激、稳定性好，可用于hpv的防治。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括以下重量配比的组分：0.5～1.5份酸酐化生物蛋白、10～15份绿茶提取物、0.7～1.5份卡波姆、0.1～0.8份壳聚糖、5～13份甘油、0.1～0.5份山梨酸、65～83份纯化水。2.根据权利要求1所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于：绿茶外泌体由所述的酸酐化生物蛋白和绿茶提取物制备而成。3.根据权利要求1所述的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将卡波姆、甘油加入纯化水，溶胀24h，在速度为200～500r/min的条件下匀质搅拌，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液调节ph至5.0～6.5，加入壳聚糖、山梨酸，搅拌，即得凝胶敷料基质，备用；(2)酸酐化生物蛋白经过0.45μm膜过滤后，在速度为800～900r/min的条件下分散均匀，得到富含空腔的外泌体；(3)在上述富含空腔的外泌体中加入绿茶提取物，在速度为3000～5000r/min的条件下，绿茶提取物装载入外泌体中，得到绿茶外泌体；(4)将上述的绿茶外泌体溶于凝胶敷料基质，加入磷酸盐缓冲溶液将ph调节到4.8～6.8之间，混合均匀，移至密封罐中杀菌消泡，灌入推进器中，得到一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料。4.权利要求1至3任意一项所述方法制得的一种含绿茶外泌体的抗hpv功能性妇科敷料在抗hpv病毒所致的阴道炎引起的分泌物增多、瘙痒、疼痛、鱼腥味的应用。
技术总结本发明属于生物科技领域，具体涉及一种含绿茶外泌体的抗HPV功能性妇科敷料及其制备方法,其成分包括以下重量配比的组分：0.5～1.5份酸酐化生物蛋白、10～15份绿茶提取物、0.7～1.5份卡波姆、0.1～0.8份壳聚糖、5～13份甘油、0.1～0.5份山梨酸、65～83份纯化水。本发明所述的一种含绿茶外泌体的抗HPV功能性妇科敷料可以阻断生殖道HPV感染，通过绿茶外泌体与HPV病毒颗粒衣壳蛋白Ll蛋白上带正电荷氨基酸的富集区有效结合，抑制HPV病毒癌细胞分泌毒性外泌体，影响其介导的细胞通讯，能够起到良好的治疗效果。本发明一种含绿茶外泌体的抗HPV功能性妇科敷料以绿茶外泌体为主要成分，对皮肤刺激性小，不易引发过敏反应，无毒，无残留，安全有效，适用于HPV病毒所致的阴道炎引起的分泌物增多、瘙痒、疼痛、鱼腥味等多种症状。鱼腥味等多种症状。
技术研发人员：戈欣 蔡少红
受保护的技术使用者：湖南有美生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5
