一种利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法
技术领域
1.本技术实施例涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法。
背景技术：2.沃柑是坦普尔脐橙与丹西红桔的杂交种,属于宽皮柑桔类型,是一个晚熟高糖品种。近年随着广西沃柑种植规模的扩大，沃柑炭疽病爆发越来越多，这种疾病在水果生长非常快，病原体很容易从腐烂的水果中分离出来。分生孢子在果实上迅速萌发、感染，直到果实成熟。在成熟过程中，形成穿透菌丝，菌丝在下层组织中定植，导致炭疽病的发生。
3.炭疽病被认为是影响水果销路的主要因素。这与当地的环境气候可能存在联系，但有研究表明炭疽病原类型不同，危害程度也不同。该病危害范围广、侵染时期长，且具有潜伏性，不易防治。发生严重时，可造成大量落叶、枯梢、僵果、落果，导致树势衰弱，产量大幅下降。炭疽病是由真菌引起的侵染性病害，常发生在叶片、枝梢、花和果实。通常高温高湿的环境易发病，温度为主要，以菌丝体和分生孢子在病梢、病叶和病果上越冬。第二年春季，病组织上产生的分生孢子借风雨、昆虫传播，直接侵入或从气孔和伤口侵入。炭疽菌是引起炭疽病的病原菌，不仅在沃柑上这种病菌发病率极高，而且在其他柑橘，甚至大多数植物，从田间到货架均可存在，具有危害时间长以及危害范围广等特点，其造成的经济损失不容忽视。
4.传统的分子鉴定技术与菌种的培养，分离纯化及形态观察病原物鉴定等技术耗时长，且准确性低。
技术实现要素：5.本技术实施例提供了一种利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法，用于提高检测效率。
6.本技术实施例提供了一种利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法，包括：
7.s1、提取炭疽病菌叶的病株dna基因组；
8.s2、根据在genbank的尖炭疽真菌的的基因组片段设计its1和its4基因亚型的核酸序列；
9.s3、合成步骤s2中的所述核酸序列得到合成序列，通过对比所述合成序列的相对保守区域确定序列对比信息；
10.s4、根据所述序列对比信息确定简并碱基；
11.s5、通过所述简并碱基和raa设计原则设计所述合成序列的引物，所述引物包括上游引物、下游引物以及探针；
12.s6、将所述引物与所述病株dna基因组构成反应体系后通过raa技术验证所述反应体系是否得到单一扩增条带；
13.s7、若是，则根据所述反应体系设置微流控芯片的管路，所述微流控芯片包括加样区；
14.s8、将所述病株dna基因组加入所述微流控芯片的加样区后，对所述微流控芯片进行检测，得到检测结果；
15.s9、当所述检测结果为阳性，则确定所述炭疽病菌叶的核酸序列。
16.可选地，步骤s1中将所述取炭疽病菌叶进行消毒后放置于液氮预冷的研钵中研磨得到炭疽病菌叶粉末，将所述炭疽病菌叶粉末置于1.5ml的ep管中，通过核酸提取试剂盒进行dna提取，得到病株dna组并放置于-20℃保存。
17.可选地，步骤s6中所述反应体系用raa恒温扩增检测仪进行检测。
18.可选地，所述扩增产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳验证所述引物是否出现单一扩增条带。
19.可选地，所诉微流控芯片还包括反应区，在步骤s7之后所述方法还包括，将完整反应预混液a和所述引物按荧光raa反应体系加入所述微流控芯片的所诉反应区中。
20.可选地，在步骤s9之后所述方法还包括，将所述病株dna组进行灵敏度检测，所述灵敏度检测用于确定所述病株dna组的浓度最低限值。
21.可选地，按照预设浓度稀释所述病株dna组的浓度。
22.可选地，将预设浓度稀释所得的病株dna组进行raa等温扩增反应，得到扩增产物；所述扩增产物通过电泳所得的电泳条带确定所述浓度最低限值。
23.可选地，所述预设浓度包括1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
101copies/μl、1
×
100copies/μl、1
×
10-1
copies/μl。
24.可选地，步骤s5中所述合成序列通过检测软件并按照raa设计原则进行对比分析后得到引物。
25.从以上技术方案可以看出，本技术实施例具有以下优点：利用新技术快速检测导致沃柑果园产生病害的真菌性质，微流控芯片技术是在特殊材质的芯片上使用微米甚至纳米级微管道将样品制备、分散和检测等步骤进行集成的技术。具有微型化、集成化的特点，两种技术结合可提高检测效率，节省试剂成本，准确性高。
附图说明
26.图1为本技术中利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法一个示意图。
具体实施方式
27.为了更清楚地说明本技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.本技术实施例提供了一种利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法，用于提高检测效率。raa(recombinase-aid amplification，raa)技术是指重组酶介导链替换核酸扩增技术，是一种在恒温核酸快速扩增技术，利从细菌或真菌中获得的重组酶，利用荧光探针的标记，可以实现定时定量的结果分析，通常5-15min就可以得到荧光检测结果。
29.微流控芯片技术(microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反
应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。本方案利用微流控芯片快速检测病菌核酸序列。
30.请参阅图1，本技术提供了一种利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法，包括以下步骤：
31.s1、提取炭疽病菌叶的病株dna基因组；
32.s2、根据在genbank的尖炭疽真菌的的基因组片段设计its1和its4基因亚型的核酸序列；
33.s3、合成步骤s2中的所述核酸序列得到合成序列，通过对比所述合成序列的相对保守区域确定序列对比信息；
34.s4、根据所述序列对比信息确定简并碱基；
35.s5、通过所述简并碱基和raa设计原则设计所述合成序列的引物，所述引物包括上游引物、下游引物以及探针；
36.s6、将所述引物与所述病株dna基因组构成反应体系后通过raa技术验证所述反应体系是否得到单一扩增条带；
37.s7、若是，则根据所述反应体系设置微流控芯片的管路，所述微流控芯片包括加样区；
38.s8、将所述病株dna基因组加入所述微流控芯片的加样区后，对所述微流控芯片进行检测，得到检测结果；
39.s9、当所述检测结果为阳性，则确定所述炭疽病菌叶的核酸序列。
40.本实施例中，本实施例中，本方案通过核酸提取试剂盒对炭疽病菌叶的病株进行dna提取后，得到病株dna基因组将提取的dna组放置在-20℃保存。通过在genbank上获得的尖炭疽真菌种群及其他不同种属尖炭疽真菌的基因组片段，并根据基因组片段设计its序列，用于鉴定区分真菌的种、属。将genbank上获得核酸序列进行序列合成，采用mega x软件进行比对，得到相对保守区域，从而确定序列对比信息并标出简并碱基。采用primer premier6.0软件按荧光raa设计原则分别设计上游引物、下游引物以及探针。其中上游引物为tccgtaggtgaacctgcgg，下游引物为tcctccgcttattgatatgc，引物探针为ggaatatc。
41.将上游引物、下游引物、探针以及病株dna基因组构成反应体系后通过raa技术验证该反应体系，当验证结果为单一扩增条带，根据该反应体系设置微流控芯片的管路，将病株dna基因组加入微流控芯片的加样区后，对微流控芯片进行检测，当所述检测结果为阳性，则确定所述炭疽病菌叶的核酸序列与genbank上获得的基因组片段相同。
42.与传统检测方法相比，操作者省去了复杂的体系配制，只需一步加样品混合，便可同时进行多平行和多靶点测试，反应在镁离子存在的条件下，在39℃迅速启动，20min内实现高通量和便捷化的测试结果。芯片中预置体系是脱水状态，加样时可通过增加核酸模板的量提升测试的检测灵敏度。
43.可选的，步骤s1中将取炭疽病菌叶进行消毒后放置于液氮预冷的研钵中研磨得到炭疽病菌叶粉末，将炭疽病菌叶粉末置于1.5ml的ep管中，通过核酸提取试剂盒进行dna提取，得到病株dna组并放置于-20℃保存。
44.炭疽病菌叶的提取过程为，将病叶洗净晾干，加入液氮充分研磨至绿色粉末状，取研磨后的粉末100mg左右，加入400μl缓冲液fga和6μlrnasea(100mg/ml)置于1.5ml的ep管
中，漩涡振荡1min。室温放置10min后加入130μl缓冲液lp2，充分混匀，漩涡振荡1min。12000rpm条件下离心5min，将上清液移至新的离心管中，加入1.5倍体积的使用前已加入无水乙醇的缓冲液lp3，立即充分振荡混匀15sec后所得溶液加入一个吸附柱cb3中，以12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。向吸附柱中cb3中加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液pw。12000rpm离心30sec,倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。重复加入无水乙醇的漂洗液pw，再离心一次。30sec后倒掉废液后再放入离心机，12000rpm离心2min后倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以晾干吸附材料中残余的漂洗液。
45.可选的，步骤s6中所述反应体系用raa恒温扩增检测仪进行检测。
46.可选的，所述扩增产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳验证所述引物是否出现单一扩增条带。
47.本实施例中，raa等温扩增反应不需要高温使模板dna变性，且raa等温扩增反应的时间也较短，在15至30分钟就可以得到能检测到反应体系。基础荧光raa反应选用基础型dna恒温快速扩增试剂盒。在干粉反应管中加入反应预混液a、引物以及病株dna基因组，最后加入缓冲液配成反应体系。its1和its4基因的检测反应体系均分别独立配制。将反应体系充分混匀后，置于raa恒温扩增检测仪中39℃恒温反应20min。用raa产物纯化试剂盒纯化扩增产物，取10μl已纯化产物经质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳，置紫外成像仪内观察。以验证设计的引物为能扩增出沃柑炭疽病菌。
48.可选的，微流控芯片还包括反应区，将完整反应体系混合液和引物按荧光raa反应体系加入微流控芯片的反应区中。
49.本实施例中，微流控芯片包含4个ts-60型注射泵和1个微流控芯片。微流控芯片由4个单元组成，分别为单元a、b、c、d，圆心处为4个单元的共同废液出口。其中单元a用于检测样本中的炭疽菌，其余3个单元用于平行分析所感染病菌对3种不同真菌的敏感性。其中单元a主要由2个区域组成：
①
流体传输区域，包括分别位于芯片两端的进样孔(直径1.5mm)和废液出孔(直径3mm)及两条微通道(宽200μm、深00μm、长1cm)
②
捕获腔，为一位于微通道中央的六边形微腔(4mm
×
2mm
×
100μm)，由间隔为60μm的长方体微柱围城，腔内填充有经抗体修饰的玻璃微珠，其直径略小于腔体深度，以确保微珠以单层形式陈列于腔内(图1.b)。当样本液从进样孔注入，流经捕获腔并与腔内微珠接触时，样本液中所含的目标菌即被微珠特异性捕获/富集，随后通过免疫荧光检测技术可对被捕获的炭疽菌进行在线检测。另外3个单元(b、c、d)互为平行单元，每个单元由2个微阀和3个功能区组成(图1.c)，微阀用于在实验过程中控制通道内液体的流动，起到阀门的作用；3个主要功能区包括：
①
浓度梯度发生器，由2个位于上面的入孔(药物和空白培养液入孔；直径1.5mm，深100μm)连接5组波浪形微通道(图中蓝色通道，长100mm,宽200μm,深100μm)构成，任意初始浓度的药物在流经5组波浪形微通道后，能自动形成5个不同的浓度比，即0:1:2:3:4[21]，从而为细菌提供不同的药物培养液进行平行对照实验。
②
混合室：与浓度梯度发生器相连的5个微室，经浓度发生器形成的不同浓度药物在此与细菌混合并持续作用于细菌。
③
真菌监测区域：由五组平行的监测腔组成，分别通过外围的椭圆微通道与其上游。
[0050]
可选的，将病株dna组进行灵敏度检测，灵敏度检测用于确定病株dna组的浓度最低限值。
[0051]
可选的，按照预设浓度稀释病株dna组的浓度。
[0052]
可选的，将预设浓度稀释所得的病株dna组进行raa等温扩增反应，得到扩增产物；扩增产物通过电泳所得的电泳条带确定浓度最低限值。
[0053]
可选的，预设浓度包括1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
101copies/μl、1
×
100copies/μl、1
×
10-1
copies/μl。
[0054]
本实施例中，为了确定该基因组能够检测到的最低浓度，需要对病株dna组进行灵敏度检测。具体的，将病株dna组依次稀释为1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
101copies/μl、1
×
100copies/μl、1
×
10-1
copies/μl。5、与设计的引物构成反应体系采用微流控芯片对培养的沃柑炭疽病菌的10倍梯度系列稀释液进行检测。微流控芯片组件由聚碳酸酯材料经微注塑工艺，每张芯片有微流控结构区，每个结构区有1个加样区、和1个反应区。将完整反应预混液a、上下游引物和探针按荧光raa反应体系预先加入芯片反应区中，每个结构区中对its1和its4基因分别做4个重复测试，风干约15min后用塑封膜密封，储存于－20℃保存备用。
[0055]
每个加样区按4个5μl荧光raa反应液的反应体系，将核酸模板与缓冲液b混合，纯水。将待测混合液加入芯片中，经离心使液体进入反应区，在芯片检测仪内维持39℃孵育30min，每30s检测一次荧光信号。将炭疽菌的基因组核酸及其新鲜培养的菌体分别进行10倍梯度稀释比对，用以评价荧光raa微流控芯片方法的检测灵敏度。
[0056]
可选的，步骤s5中合成序列通过检测软件并按照raa设计原则进行对比分析后得到引物。
[0057]
本实施例中，引物包括上游引物、下游引物以及探针。设计原则为引物长度一般在25～35bp，gc含量在30％～70％之间。探针序列不与引物识别位点重叠，长度一般为46～52bp。此外，上游引物、下游引物和探针序列要避免出现回文结构、内部二级结构和连续重复碱基。核酸扩增片段也应尽量避免形成二级结构，扩增片段长度一般在150～300bp之间。其中，检测软件可以是primer 6，具体根据实际情况选择检测软件。
[0058]
所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为描述的方便和简洁，上述描述的系统，装置和单元的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。
[0059]
在本技术所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的系统，装置和方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些接口，装置或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。
[0060]
所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部单元来实现本实施例方案的目的。
[0061]
另外，在本技术各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中。上述集成的单元既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能单元的形式实现。
[0062]
所述集成的单元如果以软件功能单元的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，可以存储在一个计算机可读取存储介质中。基于这样的理解，本技术的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分或者该技术方案的全部或部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质中，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本技术各个实施例所述方法的全部或部分步骤。而前述的存储介质包括：u盘、移动硬盘、只读存储器(rom，read-only memory)、随机存取存储器(ram，random access memory)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
技术特征：1.一种利用raa技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法，其特征在于，包括：s1、提取炭疽病菌叶的病株dna基因组；s2、根据在genbank的尖炭疽真菌的基因组片段设计its1和its4基因亚型的核酸序列；s3、合成步骤s2中的所述核酸序列得到合成序列，通过对比所述合成序列的相对保守区域确定序列对比信息；s4、根据所述序列对比信息确定简并碱基；s5、通过所述简并碱基和raa设计原则设计所述合成序列的引物，所述引物包括上游引物、下游引物以及探针；s6、将所述引物与所述病株dna基因组构成反应体系后通过raa技术验证所述反应体系是否得到单一扩增条带；s7、若得到单一扩增条带，则根据所述反应体系设置微流控芯片的管路，所述微流控芯片包括加样区；s8、将所述病株dna基因组加入所述微流控芯片的加样区后，对所述微流控芯片进行检测，得到检测结果；s9、当所述检测结果为阳性，则确定所述炭疽病菌叶的核酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中将所述取炭疽病菌叶进行消毒后放置于液氮预冷的研钵中研磨得到炭疽病菌叶粉末，将所述炭疽病菌叶粉末置于1.5ml的ep管中，通过核酸提取试剂盒进行dna提取，得到病株dna组并放置于-20℃保存。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s6中所述反应体系用raa恒温扩增检测仪进行检测。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳验证所述引物是否出现单一扩增条带。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所诉微流控芯片还包括反应区，在步骤s7之后所述方法还包括，将完整反应预混液a和所述引物按荧光raa反应体系加入所述微流控芯片的所诉反应区中。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s9之后所述方法还包括，将所述病株dna组进行灵敏度检测，所述灵敏度检测用于确定所述病株dna组的浓度最低限值。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，按照预设浓度稀释所述病株dna组的浓度。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将预设浓度稀释所得的病株dna组进行raa等温扩增反应，得到扩增产物；所述扩增产物通过电泳所得的电泳条带确定所述浓度最低限值。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述预设浓度包括1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
101copies/μl、1
×
100copies/μl、1
×
10-1
copies/μl。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s5中所述合成序列通过检测软件并按照raa设计原则进行对比分析后得到引物。
技术总结本申请实施例公开了一种利用RAA技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法，用于提高检测效率。本申请实施例方法包括：提取炭疽病菌叶的病株DNA基因组；根据在GenBank的尖炭疽真菌的ITS1和ITS4基因亚型的核酸序列；合成核酸序列得到合成序列，通过对比合成序列的相对保守区域确定序列对比信息；根据序列对比信息确定简并碱基；通过简并碱基和RAA设计原则设计合成序列的引物；将引物与病株DNA基因组构成反应体系后通过RAA技术验证反应体系是否得到单一扩增条带；若是，则根据反应体系设置微流控芯片的管路，微流控芯片包括加样区。将病株DNA基因组加入所述微流控芯片的加样区后，对微流控芯片进行检测，得到检测结果为阳性时，则确定炭疽病菌叶的核酸序列。则确定炭疽病菌叶的核酸序列。则确定炭疽病菌叶的核酸序列。
技术研发人员：卜志锋
受保护的技术使用者：广西宏廷智能科技有限公司
技术研发日：2022.04.08
技术公布日：2022/7/5
