1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术：2.近年来，大量研究表明红细胞在补体受体的介导下其免疫功能与免疫性疾病的发生发展具有显著相关性，尤其是补体受体介导的免疫细胞对机体循环免疫复合物的清除是先天免疫系统重要的防御功能。
3.目前单克隆抗体技术不仅用于免疫性疾病的治疗，而且广泛运用在了免疫性疾病的分子机制研究中，作为一种研究工具，单克隆抗体以及相关的制备技术经常被用于分析和纯化抗原、定位抗原决定簇、确定蛋白互作位点等方面。所以为了进一步阐明红细胞免疫在疾病发展过程中发挥免疫功能的分子机理，补体受体单克隆抗体的制备成为保证相关研究的重要环节。
4.目前可稳定传代的产犬cr1-l单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及犬cr1-l单克隆抗体都未有报道。
技术实现要素：5.本发明的目的之一在于提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.45006，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
6.本发明的目的之二在于提供一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
7.进一步的，所述单克隆抗体的重链为50kda，轻链为30kda。
8.本发明的目的之三在于提供上述杂交瘤细胞株在制备犬cr1-l单克隆抗体中的应用。
9.本发明的目的之四在于提供一种检测试剂，所述试剂中含有上述单克隆抗体。
10.本发明的目的之五在于提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有上述单克隆抗体。
11.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
12.本发明成功构建了可稳定生产犬cr1-lmcab的杂交瘤细胞株，并获得犬cr1-lmcab，为进一步研究动物红细胞免疫功能的分子机制奠定基础。
13.生物保藏说明：
14.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
15.保藏编号：cgmccno.45006；
16.保藏日期：2021年12月08日；
17.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
18.图1为实施例1中犬cr1-l基因片段的pcr扩增结果图。
19.图2为实施例1中蛋白诱导表达检测结果图。
20.图3为实施例1中重组蛋白frd-gst-cr1l纯化后的凝胶电泳图。
21.图4为实施例3中还原性sds-page检测犬cr-l单克隆抗体图。
22.图5为实施例3中犬cr1-lmcab免疫印迹检测结果图。
具体实施方式
23.实施例1
24.利用ncbi(national center for biotechnology information)提供的blastn在线程序，将人、黑猩猩、狒狒、穴兔等动物的补体受体mrna序列进行同源性比对，确定相对保守序列，后续步骤如下：
25.(1)提取健康比格犬血细胞总rna；
26.(2)对犬cr1-l基因cdna部分片段进行rt-pcr扩增；
27.(3)反应完毕后抽取反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中得到了约l000 bp，900bp，600bp的条带，分别命名为a、b、c，将cr1-like基因片段pcr产物a-c进行测序，并将测序结果于genbank数据库进行同源性比对，结果表明条带a与b均为非特异性扩增，条带c为606bp的犬cr1-l基因片段。条带c具体序列如下：
28.seq id no.1：
29.tttgtccaaatcctccggctatccttaacgggcaccacactggaacttcttggggacgcattccctatggaaaagaaattacttacatttgtgactaccagccagccagcgggatgatcttcaaactcgttggggagagcaccatcctctgcaccagtgacaatcaagggaacgggatttggagcggccctgctcctcactgtgaacctgctggtcctacagcatgcccatatccacccaagatccacaacgggcattacattggaagacatgtgtctccatatcttcctgggatgatcgtcagctatgcttgtgatccaggctacttgttggtgggaagagccttcatattctgcacctaccagggaacctggagccaatttgatcattattgcaaagagataaaatgtatcctcccagagtttatgaatggaatccagaagaagttgcacatgagaaaagtataccactatggagataatgtaacttttgagtgtgaagttggatatactctaaaaggcagtcgccagagtcagtgtcaggcagatgacacatggaaccctcctctggccgtatgtacatctcgcacacgtgattctctcaaaa；
30.将此片段与genbank收录的人、猩猩、野猪、兔的补体受体i型基因进行同源性比对，相似性分别为为83％、82％、84％和80％；
31.(4)将测序得到的目的序列交予福因德生物公司，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，合成含有bamhi(ggatcc)与xhoi(ctcgag)酶切位点以及6
×
his标签的目的基因，序列如seq id no.2所示，将目的基因与原核表达载体pfrd-gst1质粒(福因德科技(武汉)有限公司生产)连接后转化大肠杆菌工程菌；
32.seq id no.2：
33.ggatcctgccctaatccgccggcaattctgaatggtcatcataccggtacaagttggggtcgcattccgtatggcaaagaaattacctatatttgcgattatcagccggcaagcggcatgatttttaaactggttggtgaaagcaccattctgtgtaccagtgataatcagggcaatggtatttggagcggcccggccccgcattgtgaaccggcaggtccgaccgcatgtccgtatccgccgaaaattcataatggtcattatattggtcgccatgttagtccgtatctgccgggcatgattgttagctatgcatgtgatccgggctatctgctggttggtcgtgcctttattttctgtacctatcagggcacctggagccagtttgatcattattgcaaagaaattaagtgcatcctgccggagtttatgaatggcattcagaaaa
aactgcacatgcgcaaagtgtatcattatggcgataatgttacctttgaatgcgaagtgggctataccctgaaaggtagtcgccagagccagtgtcaggcagatgatacctggaatccgccgctggcagtttgtaccagccgcacccgcgatagtctgaaacaccaccaccaccaccactaactcgag。
34.(5)抽提原核表达质粒pfrd-gst-cr1l；
35.(6)双酶切鉴定原核表达质粒pfrd-gst-cr1l；
36.(7)鉴定正确的质粒pfrd-gst-cr1l转化e.coli bl21(de3)；
37.(8)从e.coli bl21(de3)中提取重组质粒pfrd-gst-cr1l，并进行双酶切鉴定；
38.(9)对鉴定正确的e.coli bl21(de3)进行诱导表达；
39.挑取e.coli bl21(de3)单菌落到20ml含有氨苄抗性的lb培养基中，37℃震摇培养，摇菌至od600＝0.6时，加入浓度为0.8mm的iptg在温度为37℃条件下进行诱导表达。同时以未诱导表达的frd-gst-cr1lbl21(de3)和诱导的frd-gst空载bl21(de3)作对比。
40.取正常表达的菌液活化后扩大培养，37℃震摇培养，摇菌至od600＝0.6时，加入浓度为0.2mm iptg在18℃160rpm条件下进行诱导表达，16h后收集菌体。超声波破菌15min，功率390w，工作2s，停4s，9000rpm，离心10min。收集上清，并以变性缓冲液溶解沉淀。通过12％sds-page检测菌液沉淀分析表达情况，结果如图2所示，其中m：marker(29.0-97.2kda)；1：经iptg诱导的frd-gst空载bl21(de3)样品；2：未经iptg诱导的frd-gst-cr1lbl21(de3)样品；3：经iptg诱导的frd-gst-cr1lbl21(de3)样品。预期目的蛋白大小约为49.5kda，相比于对照组，经iptg诱导表达的frd-gst-cr1l bl21(de3)于44.3-66.4kda之间出现明显的条带，表明frd-gst-cr1lbl21(de3)表达菌株可正常表达目的蛋白。
41.(10)对重组蛋白frd-gst-cr1l进行纯化；
42.将表达上清过ni-ntaresin柱进行纯化，同时使用0.3mol/lnacl、0.05mol/lnah2po4、0.01mol/l imidazole、0.01mol/ltris-hcl(ph＝8.0)的平衡液平衡镍柱。将样品配置成与平衡液成分一致的缓冲液，并使用0.45μm滤膜抽滤后，通过平衡后的镍柱，之后使用平衡液对其进行洗涤，收集8管(washing)，最后将与ni-ntaresin结合的带有6
×
his标签的重组蛋白用含有0.3mol/lnacl，0.05mol/lnah2po4，0.5mol/l imidazole，0.01mol/l tris-hcl的洗脱液洗脱到8个管中(elution)，从而分离重组蛋白，通过sds-page验证纯化结果，结果如图3所示，其中m：marker(14.3-97.2kda)；1：纯化后的蛋白缓冲液。
43.将纯化后收集的含有重组蛋白的溶液在4℃，4000r/min条件下离心浓缩，浓缩后所收集的重组蛋白装入透析袋中透析8h，每4h换液一次。
44.(11)对诱导表达的重组蛋白frd-gst-cr1l进行sds-page分析。
45.实施例2
46.选取6周龄balb/c小鼠3只，背部皮下多点注射。首次免疫用弗氏完全佐剂，将弗氏佐剂与纯化后的犬frd-gst-cr1l蛋白按照体积比1∶1混合乳化，对每只小鼠免疫注射100ug。在第三周与第五周用弗氏不完全佐剂与纯化后的犬frd-gst-cr1l蛋白按照体积比1∶1混合乳化，分别进行2免与3免，免疫注射量为100μg/只。在第三次免疫一周后，分别对每只小鼠采血30μl，elisa检测血清效价。
47.elisa检测步骤如下：
48.(1)包被：对应抗原按1ug/ml浓度用包被缓冲液cbs稀释，100ul/孔加入酶标板中，覆膜密封，4℃包被过夜。
49.(2)封闭：次日弃液，加入封闭液(1％bsain tbst)150ul/孔，37℃孵育60min。
50.(3)一抗：弃液，tbst洗涤液350ul/孔，洗3次，拍干，加入待检测血清100ul/孔，37℃孵育60min。
51.(4)二抗：弃液，tbst洗涤液350ul/孔，洗3次，拍干，加入羊抗小鼠hrp 1:5000100ul/孔，37℃孵育60min。
52.(5)显色：弃液，tbst洗涤液350ul/孔，洗3次，拍干，加入单底物tmb 100ul/孔，显色3-5min。
53.(6)终止：加入终止液50ul/孔，酶标仪双波长(od450/od630)读数，具体结果参见表1。
54.表1融合前血清效价测定表
[0055][0056]
由表1可知，融合蛋白作为抗原能够引起明显的小鼠免疫反应，小鼠免疫模型制备成功，可用于后续脾脏细胞的分离及瘤细胞的制备。
[0057]
实施例3
[0058]
犬cr1-l单克隆抗体的制备与纯化，步骤如下：
[0059]
(1)杂交瘤细胞制备
[0060]
以cr1-l为候选抗原，按照实施例2中“动物免疫”的操作步骤重新免疫小鼠。于第3次免疫后的第7天，无菌分离免疫鼠的脾脏，按照实验室常规方法制备脾细胞悬液，并将脾细胞浓度调为7
×
108/ml，备用。将细胞样品送至福因德科技有限公司制备、筛选杂交瘤细胞。
[0061]
(2)犬cr1-l单克隆抗体生产及纯化
[0062]
①
瘤细胞复苏
[0063]
a.液氮中取出杂交瘤细胞，快速解冻，常规消毒后转移入超净台中备用。解冻的瘤细胞悬液吸入1.5ml ep管中，室温下1000r/min、离心5min，弃上清。加入1ml imdm完全培养基重悬细胞，轻柔吹打洗涤，900r/min离心3min，弃上清。
[0064]
b.重新加入1ml imdm培养基重悬细胞，轻柔吹打。吸取1ml imdm培养基润洗6孔培养板，向各孔中分别加入0.5ml杂交瘤细胞悬液，每孔再加入2ml imdm培养基，将6孔板放于细胞倒置显微镜下。仔细观察瘤细胞的状态是否正常。然后于细胞培养箱中37℃、5％co2条件下培养细胞。
[0065]
②
瘤细胞传代培养
[0066]
a.瘤细胞培养36h后，于倒置显微镜下观察细胞状态。若细胞状态良好则继续后续操作以传代培养瘤细胞。
[0067]
b.首先沿培养孔上缘吸取1.5ml的培养液，再轻柔吹打孔底的杂交瘤细胞，使杂交瘤细胞与培养板底彻底分离形成悬液，吹打过程中力度要适中，速度要缓慢，避免产生泡
沫。
[0068]
c.吸取瘤细胞悬液，移入ep(1.5ml)管中，每管体积为1ml。室温下900r/min离心3min，弃上清。于倒置显微镜下观察；以37℃预热的生理盐水将细胞重悬，调整细胞浓度为1
×
108/ml，备用。
[0069]
③
含犬cr1-l单克隆抗体腹水的诱生
[0070]
a.取9周龄的balb/c小鼠于腹腔注射液体石蜡，剂量为0.5ml/只，正常饲养备用。抽取上述备用的杂交瘤细胞悬液3ml，按1ml/只的剂量腹腔分点注射入小鼠体内。注射后每天观察小鼠状态，详细记录瘤变症状。
[0071]
b.小鼠出现明显瘤变后1周，小鼠断颈处死。腹部用酒精棉球擦拭并轻柔按压。倒提小鼠，以2ml注射器从腹腔远心端抽取腹水，抽取过程中调整针头，避免刺伤脏器而被血液污染或被大块组织堵塞针头。
[0072]
c.用pvdf膜过滤抽取的腹水并将腹水分装，4℃下2500r/min离心20min。取上清经滤器(0.45μm)过滤，于4℃、10500r/min，离心20min，收集上清。取ep管加入10％硫酸右旋葡糖酐45μl、1m cacl2溶液1ml，再将上清加入，充分混匀，室温静置20min。4℃下10500r/min离心10min，收集上清，用0.2mm磷酸钠缓冲液稀释腹水至2ml，用于后续纯化。
[0073]
④
犬cr1-l单克隆抗体的纯化
[0074]
根据实验室前期建立的aktapurifier中压蛋白纯化仪实验方法，对含有犬cr1-l单抗的腹水进行纯化，流程如下：
[0075]
a.打开仪器的unicorn(5.31)软件，管道a1中加入ph为7.0、20mm磷酸钠缓冲液，管道b1则为ph为3.0、0.1m甘氨酸-盐酸缓冲液。点击manual按钮，选择pump
→
pump wash purifier功能，开始管道、泵的清洗。
[0076]
b.灭菌的ep管安置于收集器转盘杯槽内，每管加入ph为9.0的1m tris-hcl溶液20μl，参数选择及操作按照实验室前期方法进行。
[0077]
c.在3号注样口缓慢推入犬cr1-l mcab腹水，参数依次选择hitrap-protein g hp 1ml、0.962ml、0.3mpa-0.00mpa、1ml/min。常规平衡管道，开启b泵，设置pump wash basic on，体积12ml；设置流速为1ml/min，体积为12ml。设置end method结束收集程序为收集体积为1ml/管，收集10管后结束收集。结束后将收集管中的犬cr1-lmcab加入超滤离心管中，4℃、6000r/min离心90min，重复洗涤3次。bradford法测定抗体浓度并调整至2.0mg/ml，无菌ep管分装，-80℃备用。
[0078]
⑤
还原性sds-page检测犬cr-l单克隆抗体；
[0079]
制备2块凝胶对犬cr-l单克隆抗体进行电泳检测。电泳结束后扫描凝胶，采集图像，结果如图4所示，其中m：marker(14.3-97.2kda)；1：cr1-lmcab，结果可见，无杂带蛋白，且轻重链分别在约50kda与30kda处出现条带符合预期大小。单抗分子量符合理论值为152kda(参照ge healthcare抗体纯化手册)。
[0080]
⑥
犬cr1-l单克隆抗体的wb检测；
[0081]
取另一块凝胶，于60v下电转印2.5h。转印完毕，转印膜浸入封闭液中，室温封闭2h。将膜转入杂交袋中，以本实验表达的frd-gst-cr1l为第一检验蛋白，以1:850稀释得gst抗体，4℃孵育过夜。洗膜2次，每次5min。将pvdf膜移入新杂交袋中，加入tbst1:8500稀释的goat anti-mouse igg-hrp，37℃孵育60min，洗膜2次，常规曝光、保存胶片，结果参见图5，
其中1泳道出现杂交条带，表明gst抗体检测为阳性。2列为空泳道，无杂交印迹条带出现。
[0082]
本实验中，通过综合运用cdna克隆技术，原核表达技术获得目标抗原，首次对犬补体受体抗原片段的体外获得技术开展研究，并在此基础上成功构建杂交瘤细胞。细胞培养观察发现，所建立的瘤细胞系生长状态良好，且生长周期短，18-20h即可传代培养，表明外源构建抗原表位无生物副作用，安全性高。此外，相比传统技术，本研究抗原获取采取原核表达的方法，抗原蛋白片段获得率有极大提高。但是，相比传统的天然分离技术，所获得的抗原蛋白分子小，活性受保守序列的特异性影响及分子量影响，抗原性及后期诱导抗体水平不稳定。为此，本实验依托前期研究技术，对序列的筛查进行了相关鉴定，比较保守序列的同时借鉴前期研究的技术支持，进行了多次重复的序列鉴定分析、抗血清效价的摸索实验，最终确定了本研究结果中的序列及抗原分子。
[0083]
瘤细胞培养过程中可分泌产生犬cr1-l mcab，但是在细胞培养环境下犬cr1-l mcab丰度不高，其产量对于后续相关研究的供应有限。在借鉴课题组前期抗体制备的基础上，本实验通过小鼠腹腔注射瘤细胞进行在体扩大，结果可收获大量含犬cr1-lmcab的小鼠腹水，极大地提高了收获率。本实验中将细胞处于生长对数期的瘤细胞接种于9周龄的经产后的balb/c雌鼠腹腔中，使其以腹水瘤的形式在小鼠腹腔内大量增殖，有效地提升了cr1-like mcab的产量。本实验中，balb/c雌鼠在经过腹腔注射瘤细胞后，每天观察护理保证正常饮食饮水，并控制室温、湿度。接种8d后，实验小鼠可见腹部膨胀，至接种后第17d，小鼠出现休克频死状态，此时收集腹水。
[0084]
课题组前期技术经验表明诱生的腹水含有多种杂质，不能直接进行后续中压蛋白纯化及相关实验。本实验按照课题组前期实验技术以pvdf滤膜过滤、低速冷冻离心等技术方法对阳性腹水进行除杂，在除去大组织及其他颗粒性杂质后选择层析柱及0.45μm滤器进一步过滤除菌。然后以硫酸右旋葡糖酐法除脂蛋白等杂质，这一步骤重复至少3-6次，尽量将腹水中脂蛋白完全除掉。最后以100kda超滤离心管截留100kda以上的蛋白分子，以20mm磷酸钠缓冲液为溶媒，进入下一步中压蛋白纯化。
[0085]
纯化单克隆抗体的方法很多，例如亲和层析法、盐析、离子交换、辛酸-硫酸铵盐析、硫酸-铵盐析法、中压蛋白纯化、高压液相层析等多种技术。本实验选择atkapurifier upc10中压蛋白纯化仪进行抗体纯化在对前期实验条件进行比较和总结的基础上，设置了适合犬cr1-lmcab纯化的工艺参数，应用aktapurifier upc10中压蛋白纯化仪unicorn
tm 5.31成功纯化出犬cr1-lmcab，经还原性sds-page检测、western blot验证发现凝胶中无可见杂质条带且分子量大小符合预期，抗体纯化效果良好；免疫印迹结果表明gst抗体能够结合与蛋白条带，表明所分泌的犬cr1-lmcab具有良好的特异性。
[0086]
综上所述，本实验综合利用pcr、原核表达以及单克隆抗体制备等技术，获得了之前未有报道的可稳定传代的产犬cr1-l单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并成功制备了犬cr1-l单克隆抗体，对后续的相关研究提供奠定了理论基础。
[0087]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术特征：1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45006，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。3.如权利2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链为50kda，轻链为30kda。4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备犬cr1-l单克隆抗体中的应用。5.一种检测试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求2所述的单克隆抗体。6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2所述的单克隆抗体。
技术总结本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其应用，属于生物医学技术领域。该杂交瘤细胞株已于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.45006，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该杂交瘤细胞株不但可以稳定传代，而且其分泌的犬CR1-L单克隆抗体具有良好的特异性。本发明成功构建了可稳定生产犬CR1-L McAb的杂交瘤细胞株，并获得犬CR1-L McAb，为进一步研究动物红细胞免疫功能的分子机制奠定基础。础。础。
技术研发人员：侯震 李宏全 尹伟 范阔海 孙娜 孙盼盼
受保护的技术使用者：山西农业大学
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2022/7/5
