马铃薯stgapc基因在提高马铃薯淀粉含量上的用途
技术领域
1.本发明属于基因领域，具体涉及一种马铃薯stgapc基因在提高马铃薯淀粉含量上的用途。
背景技术：2.淀粉作为高等植物中碳水化合物主要贮藏形式，同时也是粮食作物产品的最主要成分。影响马铃薯块茎淀粉含量的因素包括光合作用、蔗糖运输、块茎中淀粉的积累、植株本身对淀粉及其代谢物的消耗，调控上述代谢途径的基因均可能对淀粉含量产生影响。马铃薯光合作用固定的碳源和能量通过蔗糖运输蛋白基因(sut1)进入块茎参与淀粉的合成。淀粉的合成和降解主要涉及腺苷二磷酸葡萄糖(adpg)焦磷酸化酶(淀粉合成的起始酶，催化葡萄糖-1-p形成adpg)、淀粉合成酶(将adpg的葡聚糖基转移到α-1,4-葡萄糖的非还原性末端)、淀粉分支酶(在直链淀粉上形成α-1,6分支点)、淀粉去分支酶(与分支酶的作用相反)、淀粉磷酸化酶和淀粉水解酶(将淀粉降解为葡萄糖单体)。马铃薯细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(stgapcs)是糖酵解反应中的关键酶，在糖酵解过程中参与第一个atp的形成，催化3-磷酸甘油醛转变为1,3-二磷酸甘油醛，同时产生nadph，从而使植物体维持较高的能荷水平而正常生长。该酶是一种多功能蛋白，除作为关键酶参与糖酵解等能量代谢外，该酶还参与基因表达的转录后调控、核trna运输、dna复制与修复、组蛋白表达调控、端粒结构调节、细胞凋亡调控等功能，在植物抗旱、抗盐、耐高温等过程中发挥功能。
技术实现要素：3.本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种与马铃薯淀粉含量相关的基因及调控方法。
4.本发明的技术方案为：马铃薯stgapc基因在调控马铃薯淀粉含量上的用途，所述马铃薯stgapc基因的cds如seq id no.1所示。
5.进一步地，通过抑制马铃薯stgapc基因表达提高块茎淀粉含量。
6.本发明还公开了一种马铃薯stgapc基因沉默载体，含有seq id no.2所示的核苷酸序列。
7.上述所述的沉默载体在提高马铃薯块茎淀粉含量上的应用。
8.一种马铃薯stgapc基因沉默载体的构建方法，包括以下步骤：
9.(1)以含有seq id no.1所示基因的质粒为模板，以seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸序列为引物进行pcr扩增；
10.(2)以步骤(1)扩增的产物为模板，以seq id no.5和seq id no.6所示的核苷酸序列为引物进行pcr扩增；
11.(3)将步骤(2)的扩增产物与phellsgate 8载体进行重组，得到含有seq id no.2所示核苷酸片段的马铃薯stgapc基因沉默载体。
12.在本发明中，通过农杆菌介导的遗传转化获得抑制表达stgapc的马铃薯材料，并
对抑制表达stgapc的马铃薯株系块茎淀粉含量鉴定，结果表明阳性植株块茎淀粉含量均显著提高。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
14.本发明通过抑制stgapc基因表达可以提高马铃薯块茎淀粉含量，为提高马铃薯的淀粉含量提供了一个新的方法。
具体实施方式
15.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
16.实施例1通过农杆菌介导的遗传转化获得抑制表达stgapc的马铃薯材料
17.①
制备含stgapc片段的转化载体，并转化农杆菌
18.根据stgapc基因cdna序列(seq id no.1)选择rnai干涉片段(seq id no.2)，以含有stgapc片段的质粒为模板，引物rnai-gapc1f：aaaaagcaggcttgtgggtgtcaacgagaatgaatac(seq id no.3)与rnai-gapc1r：agaaagctgggttcttacagtaaggtcgacaacagaa(seq id no.4)，pcr扩增(95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min)，凝胶电泳回收目的片段(373bp)。以回收的片段为模板，接头引物attb1：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct(seq id no.5)与attb2：ggggaccactttgtacaagaaagctgggt(seq id no.6)，pcr扩增(95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min)获得含有接头序列的片段，凝胶电泳回收目的片段(407bp)。配置topo克隆反应体系(pcr产物4μl，盐溶液1μl，phellsgate 8载体1μl)，轻轻混匀并室温孵育5分钟后置冰上。将dh5α感受态细胞置于冰上解冻，将反应产物加入到100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2min。加入900μl lb液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200rpm)。5,000rpm离心5min，弃上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有25mg/ml壮观霉素的lb固体培养基平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。用灭菌牙签挑取单菌落，在新的含有25mg/ml壮观霉素的lb固体培养基平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。以菌落为模板，引物rnai-gapc1f(seq id no.3)与rnai-gapc1r(seq id no.4)，pcr扩增(95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min)检测。分别挑取3个阳性克隆菌斑，接入30ml含有25mg/ml壮观霉素的lb液体培养基中，37℃200rpm培养过夜，经测序鉴定后获得含stgapc片段的转化载体。
19.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中，至处于冰水混合状态。每100μ1感受态加入1μg质粒dna，轻轻混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。6000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含25mg/ml壮观霉素的yeb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。以菌落为模板，引物rnai-gapc1f(seq id no.3)与rnai-gapc1r(seq id no.3)，pcr扩增(95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min)检测。挑取1个阳性克隆菌斑，接入30ml含有25mg/ml壮观霉素的yeb液体培养基中，28℃200rpm培养48h，取菌液加入25％灭菌甘油，于-80℃保存备用。
20.②
获得马铃薯试管薯
21.将试管苗ac142(马铃薯野生二倍体材料ac142，该材料是在现有技术中广泛使用
的一个马铃薯野生种，如在文献“马铃薯高效染色体加倍方法建立与抗寒资源创制，作物学报，2020，46(11)：1659-1666”中公开使用，申请人保证从申请日起20年内向公众发放。)接入蔗糖8％和含活性炭的ms培养基中，培养至试管薯直径约0.5cm。培养条件为温度18～20℃，光强2000lx，光照8h+黑暗16h。
22.③
获得稳定遗传转化的材料
23.将含有遗传转化载体的农杆菌接种于20-25ml yeb培养基(含转化载体对应抗生素和利福平)中，于28℃、240r/min摇床上培养20-24h，取2ml培养物至50ml yeb培养基中(含转化载体对应抗生素)于28℃、240r/min摇床上培养od
600
约0.5。5000g离心6min，其沉淀用20ml ms液体培养基(蔗糖浓度3％)重新悬浮。
24.将试管薯切成厚度1-2mm的薄片，在前述农杆菌菌液中浸泡约5-10min。将薯片转移至无菌滤纸上，吸干表面菌液，转入共培养培养基(ms基本培养基+3％蔗糖(w/v)+0.2mg/liaa+0.2mg/l ga3+0.5mg/l 6-ba+2mg/l zt)中，置于24-26℃暗培箱中暗培养养2d。
25.转移含转化载体对应抗生素和400mg/l羧苄青霉素的芽分化培养基上，置于光照强度2000lx、光周期16h光照/8h黑暗、温度23
±
1℃的条件下培养。一周后将其侧芽剪掉以避免营养消耗而不利于抗性芽分化。21-28d后，从试管薯薄片中央长出抗性芽，当抗性芽长达1cm-2cm时，将其切下转入含转化载体对应抗生素和200mg/l羧苄青霉素的ms培养基上生根筛选培养，进而获得完整植株，每个抗性芽作为一个株系单独编号。
26.④
抑制表达stgapc的马铃薯株系的鉴定
27.将获得的株系分别扩繁，抽提基因组dna作为模板，通过pcr扩增及测序，确定转基因株系。获得3个转基因株系，分别记为：ri-4、ri-6和ri-8。
28.实施例2抑制表达stgapc的马铃薯株系块茎淀粉含量鉴定
29.将鉴定为阳性的转基因株系扩繁，待试管苗生长到4-5叶后移栽到隔离大棚。待马铃薯成熟后，收获块茎黑暗储藏。待块茎休眠期结束后，选择薯重10-20g，芽长在1cm左右的块茎大棚盆栽。栽培基质为每5kg椰砖加水泡发后，与10kg商品有机肥、0.5kg复合肥(n:p:k＝15:15:15)混匀，分装到直径30cm的塑料花盆中。每盆种植1株，每个材料18株。待马铃薯成熟后，收获块茎，选择无病虫害与机械损伤的块茎，测定其淀粉含量变化，结果如表1所示。
30.表1马铃薯株系淀粉含量
31.32.从表1看出，抑制stgapc基因表达后，3个转基因株系块茎淀粉含量提高了17.6％、26.1％与34.52。
技术特征：1.马铃薯stgapc基因在调控马铃薯淀粉含量上的用途，所述马铃薯stgapc基因的cds如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，通过抑制马铃薯stgapc基因表达来提高马铃薯块茎淀粉含量。3.一种马铃薯stgapc基因沉默载体，含有seq id no.2所示的核苷酸序列。4.权利要求3所述的一种马铃薯stgapc基因沉默载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以含有seq id no.1所示基因的质粒为模板，以seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸序列为引物进行pcr扩增；(2)以步骤(1)扩增的产物为模板，以seq id no.5和seq id no.6所示的核苷酸序列为引物进行pcr扩增；(3)将步骤(2)的扩增产物与phellsgate 8载体进行重组，得到含有seq id no.2所示核苷酸片段的马铃薯stgapc基因沉默载体。5.权利要求3所述的沉默载体在提高马铃薯块茎淀粉含量上的应用。
技术总结本发明公开了马铃薯StGAPC基因在调控马铃薯淀粉含量上的用途，所述马铃薯StGAPC基因的CDS如SEQ ID No.1所示。通过抑制马铃薯StGAPC基因表达提高马铃薯块茎淀粉含量。本发明通过抑制StGAPC基因表达可以提高马铃薯块茎淀粉含量，为提高马铃薯的淀粉含量提供了一个新的方法。个新的方法。
技术研发人员：何天久 刘腾飞 吴巧玉 夏军辉 宋波涛
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.01.21
技术公布日：2022/7/5
