1.本发明涉及血清筛选技术领域，具体为一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺。
背景技术：2.间充质干细胞具有多谱系分化的能力，产生多种间充质表型，可以分化为神经细胞、心脏细胞、肝脏细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和上皮细胞等多种细胞。这种细胞多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要基础，在基因细胞治疗、组织缺损修复等方面有较好应用前景。利用胎牛血清培养间充质干细胞已经有几十年的历史，然而作为一种天然产物，胎牛血清的组成非常复杂，且因动物个体、饲养地域和管理水平差异，导致胎牛血清产品批次间有较大差异，甚至因病毒微生物感染、生产工艺波动等，使产品中出现对细胞培养有害成分。因而，往往科研机构或企业无法直接购买使用或替换胎牛血清用于间充质干细胞培养，通常需要大量时间，从若干多个批号的胎牛血清产品中进行筛选，以确认获得适用于间充质干细胞培养的胎牛血清批号。而基于细胞学技术开展的各种为胎牛血清适用性评价的实验，常常都会遇到结果波动大，实验稳定性不好，各评价指标之间一致性不高等问题。同时因为缺乏胎牛血清适用评价的行业标准，只能进行相对不同批次胎牛血清之间的平行比较，而无法合理评价非平行比较中的不同批次胎牛血清。本发明建立了一种高效的血清筛选评价方法，通过适用度评价表和评价模型，快速准确筛选出适用于多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。
技术实现要素：3.本发明的目的在于提供一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，所述筛选工艺包括以下步骤：
6.(1)取待测血清，检测待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量；
7.(2)将步骤(1)得到的待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量，代入适用性指数计算模型计算得到适用性指数，具体计算模型为：
[0008][0009]
其中：yks_index:适用性指数；
[0010]
ds：待测血清培养后的细胞平均倍增时间；
[0011]
dc：标准血清培养后的细胞平均倍增时间；
[0012]
ps：待测血清培养后的细胞平均扩增密度；
[0013]
pc：标准血清培养后的细胞平均扩增密度；
[0014]
cs：待测血清培养后的克隆形成量；
[0015]
cc：标准血清培养后的克隆形成量；
[0016]
(3)根据步骤(2)中计算出的适用性指数进行待测血清评价，并根据评价结果进行筛选，当1≤适用性指数≤4时，其对应的待测血清评价为不适用，当5≤适用性指数≤7时，其对应的待测血清评价为合格，当8≤适用性指数≤10时，其对应的待测血清评价为优。
[0017]
进一步的，所述步骤(1)包括以下操作步骤：
[0018]
a.细胞悬液制备：
[0019]ⅰ.取间充质干细胞复苏，接种至t25细胞培养瓶中，传代扩增，当间充质干细胞长到汇合度达80-90％时，用胰酶消化，加入新鲜完全dmem培养基吹打，转移至离心管中，离心去上清，离心去上清时的工作参数为：1200rpm下离心5min，加入新鲜dmem基础培养基制备成细胞悬液；
[0020]ⅱ.取待测血清，加入dmem基础培养基中配置待测血清培养基；
[0021]
b.细胞增殖：向6孔板每孔中加入待测血清培养基，设置复孔，每孔取细胞悬液接种，晃匀置于培养箱中培养48h，用胰酶将细胞消化并计数，然后接种间充质干细胞至新的6孔板中，重复以上操作，共培养三到五代，计算待测血清培养后的细胞平均扩增密度；
[0022]
c.细胞倍增时间：取细胞悬液加入待测血清培养基，调整细胞终浓度，向24孔板的12 个孔中加入终浓度细胞悬液，设置复孔，分别在第1到7天消化细胞并计数，每天3个复孔，每隔24h用胰酶消化，将细胞记数，根据计数结果绘制生长曲线，取出现峰值前待测血清培养后的细胞数计算细胞平均倍增时间；
[0023]
d.克隆形成量：向6孔板每孔中加入待测血清培养基，每孔中加入50个细胞，第七天舍弃旧培养基，更换为新鲜待测血清培养基，第十四天舍弃更换后的培养基，加入pbs清洗细胞，多聚甲醛室温固定，再加入结晶紫染色液，室温染色后舍弃结晶紫染色液，再加入pbs 清洗细胞，清洗2-3次，计算待测血清培养后的克隆形成量。
[0024]
进一步的，步骤(2)中，标准血清的批号为11g271，待测血清的批号为11g292、11h240 和11h340。
[0025]
进一步的，步骤a中，所述待测血清培养基的配方为：10％待测血清、质量浓度10％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10μg/l碱性成纤维细胞生长因子和dmem基础培养基；所述 dmem基础培养基为dmem低糖基础培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的基础培养基，其中葡萄糖含量为1000mg/l。
[0026]
进一步的，所述步骤b中，细胞悬液接种量为每孔接种1.5
×
105个间充质干细胞，培养箱的工作参数为：37℃，5％co2条件下培养，新的6孔板中每孔接种量为1.5
×
105个间充质干细胞。
[0027]
进一步的，所述步骤c中，调整细胞的终浓度为1.8
×
104/ml，步骤d中，多聚甲醛的质量浓度为4％。
[0028]
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明建立了一种高效的胎牛血清评价标准，通过对大量数据的统计分析，建立了数学模型，对基于细胞学研究技术，复杂且不稳定的血清评价方法进行了模型化地归纳，可稳定、准确地对不同批次胎牛血清的适用性进行评价，快速准确筛选出适用于多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清；确定了采用细胞增殖、细胞倍增时间以及克隆形成量等参数来综合评价干细胞专用血清的细胞学筛选实验路线，系统地提供了筛选间充质干细胞培养的胎牛血清的流程，较好地解决了科研
机构或企业花费大量时间从若干多个批号的胎牛血清产品中进行筛选适用胎牛血清的问题，为基于细胞学技术开展的各种为胎牛血清适用性评价的实验提供了有效参考，该方法简单高效，实用性强，适合应用推广。
附图说明
[0029]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0030]
图1是本发明根据细胞倍增时间绘制的生长曲线示意图。图2是本发明实施例中采用标准血清培养间充质干细胞后于100倍的显微成像图一；图3是本发明实施例中采用标准血清培养间充质干细胞后于100倍的显微成像图二。
具体实施方式
[0031]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
实施例
[0033]
(1)本实验中标准血清为依科赛生物科技(太仓)有限公司的fetal bovine serum(defined) (fnd500)/澳洲胎牛血清，批号为11g271，三支待测血清分别为：依科赛生物科技(太仓) 有限公司的fetal bovine serum(defined)(fnd500)/澳洲胎牛血清，批号11g292，依科赛生物科技(太仓)有限公司的fetal bovine serum(defined)(fnd500)/澳洲胎牛血清，批号11h240，依科赛生物科技(太仓)有限公司的fetal bovine serum(prime)(fsp500)/高级胎牛血清，批号11h340；
[0034]
a.细胞悬液制备：取间充质干细胞复苏，接种至t25细胞培养瓶中，传代扩增，当间充质干细胞长到汇合度达80-90％时，用胰酶消化，加入新鲜完全dmem低糖培养基吹打，转移至离心管中，1200rpm下离心5min，去上清；
[0035]
ⅰ
加入新鲜dmem低糖基础培养基制备成细胞悬液；
[0036]
ⅱ
取一支标准血清加入新鲜dmem低糖基础培养基中配置标准血清培养基，标准血清培养基配方为：10％标准血清、hepes(质量浓度10％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、10μg/l b-fgf (碱性成纤维细胞生长因子)和低糖dmem基础培养基；
[0037]
ⅲ
取3支待测血清，各加入新鲜dmem低糖基础培养基中配置三支待测血清培养基，待测血清培养基配方为：10％待测血清、hepes(质量浓度10％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、 10μg/l b-fgf(碱性成纤维细胞生长因子)和低糖dmem基础培养基；
[0038]
b.细胞增殖：向6孔板中每孔加入2ml标准血清培养基，另取3个6孔板，一种待测血清培养基对应一个6孔板，向6孔板中每孔加入2ml待测血清培养基，均设置复孔，取细胞悬液接种至复孔，其中每孔接种量均为1.5
×
105个，晃匀置于培养箱中在37℃，5％co2条件下培养48h，48h后计数并传代扩增五代，标准血清和待测血清细胞增殖的计数结果如下表 1
所示：
[0039]
表1：细胞增殖实验细胞的计数结果
[0040][0041]
c.细胞倍增时间：向标准血清培养基和待测血清培养基中各加入14ml细胞悬液，调整细胞终浓度为1.8
×
104/ml，向24孔板每孔加入1ml该细胞悬液，即每孔1.8
×
104个细胞，每天消化收集3个孔并计数，标准血清和待测血清细胞平均倍增时间和细胞浓度峰值如下表 2所示：
[0042]
表2：实验细胞的细胞平均倍增时间和细胞浓度峰值
[0043][0044]
d.克隆形成量：向6孔板每孔中加入标准血清培养基和待测血清培养基，每孔中加入50 个细胞，第七天舍弃旧培养基，加入2ml新鲜的标准血清培养基和待测血清培养基，第十四天舍弃更换后的培养基，沿壁轻轻加入2ml pbs清洗细胞、1ml质量浓度为4％的多聚甲醛，室温固定0.5h，再加入1ml结晶紫染色液，室温染色15min后舍弃结晶紫染色液，再加入pbs清洗细胞，清洗3次，计算标准血清和待测血清培养后的克隆形成量，标准血清和待测血清细胞克隆形成量和克隆率如下表3所示：
[0045]
表3：实验细胞克隆形成量和克隆率
[0046]
批号克隆形成量克隆率11g2711632％11g2921734％11h2401938％11h3401122％
[0047]
(2)根据步骤(1)中的检测结果，对三种不同批号的待测血清的数据进行适用性指数计算和适用性评价，适用性指数计算评价模型的具体公式为：
[0048]
[0049]
由以上所述可知，
[0050]
批号为11g271的标准血清，标准血清培养后的细胞平均倍增时间dc为23h，标准血清培养后的细胞平均扩增密度pc为6.54
×
105/ml，标准血清培养后的克隆形成量cc为16(每孔接种50个细胞-六孔板)；
[0051]
批号为11g292的待测血清，待测血清培养后的细胞平均倍增时间ds为22.5h，待测血清培养后的细胞平均扩增密度ps为6.91
×
105/ml，待测血清培养后的克隆形成量cs为17(每孔接种50个细胞-六孔板)，根据适用性计算评价模型计算得到的适用性指数为6，故11g292 批号的胎牛血清适合用于间充质干细胞培养；
[0052]
批号为11h240的待测血清，待测血清培养后的细胞平均倍增时间ds为23.5h，待测血清培养后的细胞平均扩增密度ps为6.08
×
105/ml，待测血清培养后的克隆形成量cs为19(每孔接种50个细胞-六孔板)，根据适用性计算评价模型计算得到的适用性指数为5，故11h240 批号的胎牛血清适合用于间充质干细胞培养；
[0053]
批号为11h340的待测血清，待测血清培养后的细胞平均倍增时间ds为25.1h，待测血清培养后的细胞平均扩增密度ps为5.67
×
105/ml，待测血清培养后的克隆形成量cs为11(每孔接种50个细胞-六孔板)，根据适用性计算评价模型计算得到的适用性指数为4，故11h340 批号的胎牛血清不适合用于间充质干细胞培养；
[0054]
三种批次待测血清适用性指数及适用性评价结果如下表所示：
[0055]
表4待测血清适用性指数及评价结果
[0056]
批号yks_index评价结果11g2926合格11h2405合格11h3404不适用
[0057]
综上得出结论：11g292，11h240两批号胎牛血清适合于间充质干细胞培养，而11h340 批号，则表现不佳，不适合用于干细胞培养。
[0058]
本发明中标准血清的选择条件为：
[0059]
①
理化指标如下表所示：
[0060]
表5标准血清的理化指标
[0061]
检测指标接受范围方法外观浅黄色液体目测ph7.0-8.0ph计总蛋白35-50g/l双缩脲法血红蛋白≤200mg/l4-aap法渗透压280-360mosm/kg冰点法内毒素≤10eu/ml凝胶法
[0062]
②
根据步骤(1)中的培养方法获得的间充质干细胞培养结果如下表所示：
[0063]
表6标准血清对应获得的间充质干细胞培养结果
[0064]
检测指标接受范围倍增时间≤24小时
细胞浓度峰值＞1
×
106/ml
[0065]
③
间充质干细胞呈现典型的纺锤状细胞形态，具体如图2、图3所示。
[0066]
本发明的工作原理：通过对大量数据的统计分析，建立的数学模型，确定了采用细胞增殖，细胞倍增时间以及克隆率来综合评价干细胞专用血清的细胞学筛选实验路线，对基于细胞学研究技术复杂且不稳定的血清评价方法进行了模型化地归纳，稳定、准确地对不同批次胎牛血清的适用性进行评价。
[0067]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0068]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：筛选工艺包括以下步骤：(1)取待测血清，检测待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量；(2)将步骤(1)得到的待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量，代入适用性指数计算模型计算得到适用性指数，具体计算模型为：其中：yks_index:适用性指数；ds：待测血清培养后的细胞平均倍增时间；dc：标准血清培养后的细胞平均倍增时间；ps：待测血清培养后的细胞平均扩增密度；pc：标准血清培养后的细胞平均扩增密度；cs：待测血清培养后的克隆形成量；cc：标准血清培养后的克隆形成量；(3)根据步骤(2)中计算出的适用性指数进行待测血清评价，并根据评价结果进行筛选。2.根据权利要求1所述的一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：步骤(1)包括以下步骤：a.细胞悬液制备：ⅰ.取间充质干细胞复苏，接种至t25细胞培养瓶中，传代扩增，当间充质干细胞长到汇合度达80-90％时，用胰酶消化，加入新鲜完全dmem培养基吹打，转移至离心管中，离心去上清，离心去上清时的工作参数为：1200rpm下离心5min，加入新鲜dmem基础培养基制备成细胞悬液；ⅱ.取待测血清，加入dmem基础培养基中配置待测血清培养基；b.细胞增殖：向6孔板每孔中加入待测血清培养基，设置复孔，每孔取细胞悬液接种，晃匀置于培养箱中培养48h，用胰酶将细胞消化并计数，然后接种间充质干细胞至新的6孔板中，重复以上操作，共培养三到五代，计算待测血清培养后的细胞平均扩增密度；c.细胞倍增时间：取细胞悬液加入待测血清培养基，调整细胞终浓度，向24孔板的12个孔中加入终浓度细胞悬液，设置复孔，分别在第1到7天消化细胞并计数，每天3个复孔，每隔24h用胰酶消化，将细胞记数，根据计数结果绘制生长曲线，取出现峰值前待测血清培养后的细胞数计算细胞平均倍增时间；d.克隆形成量：向6孔板每孔中加入待测血清培养基，每孔中加入50个细胞，第七天舍弃旧培养基，更换为新鲜待测血清培养基，第十四天舍弃更换后的培养基，加入pbs清洗细胞，多聚甲醛室温固定，再加入结晶紫染色液，室温染色后再加入pbs清洗细胞，清洗2-3次，计算待测血清培养后的克隆形成量。3.根据权利要求1所述的一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：步骤(3)中，当1≤适用性指数≤4时，其对应的待测血清评价为不适用，当5≤适用性指数≤7时，其对应的待测血清评价为合格，当8≤适用性指数≤10时，其对应的待测血清评价为优。4.根据权利要求2所述的一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：步骤a中，所述待测血清培养基的配方为：10％待测血清、质量浓度10％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10μ
g/l碱性成纤维细胞生长因子和dmem基础培养基。5.根据权利要求2所述的一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：步骤b中，细胞悬液接种量为每孔接种1.5
×
105个间充质干细胞，培养箱的工作参数为：37℃，5％co2条件下培养，新的6孔板中每孔接种量为1.5
×
105个间充质干细胞。6.根据权利要求2所述的一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：步骤c中，调整细胞的终浓度为1.8
×
104/ml，每孔接种1.8
×
104个细胞。7.根据权利要求2所述的一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：步骤d中，多聚甲醛的质量浓度为4％。
技术总结本发明提供了一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺。该方法基于细胞学实验技术获得了细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量等检测参数综合评价筛选适用于间充质干细胞培养的胎牛血清，建立了一个间充质干细胞培养用胎牛血清评价模型和适用度评价表。通过适用度评价表和评价模型，快速准确筛选出适用于多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。
技术研发人员：商春华 陈文峻 王玉洁 陈旭 陈刚
受保护的技术使用者：依科赛生物科技(太仓)有限公司
技术研发日：2022.05.10
技术公布日：2022/7/5
