一种香石竹标准化脱毒快繁方法

1.本发明属于无性繁殖技术领域，尤其涉及一种香石竹标准化脱毒快繁方法。


背景技术：

2.香石竹(dianthus caryophyllus l.)，属石竹科石竹属(dianthus)植物，是世界上生产面积和销售量较多的切花品种之一。香石竹繁殖分为有性和无性繁殖两种，前者往往由于结实率低、种子后代性状分化变异大等，在生产上基本不采用。目前生产上主要采用组织培养和扦插繁殖的无性繁殖方式。组织培养具有繁殖系数高，能脱除病毒，生长强壮，抗性好，产量高等优点，但需要一定的设备，培养期长。近年来世界上大多数香石竹育苗公司采用组织培养获得无病毒原种母本，再从母本采穗扦插繁殖育苗，这既能获得大量高品质的无菌种苗，又降低了生产成本。
3.香石竹常由于病毒病的影响，引起不同程度的植株矮化、畸形、花叶、坏死、花朵变小、开裂、花碎色等症状，造成香石竹的产量、品质不断下降。危害香石竹的病毒病种类有香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus,carmv)、香石竹潜隐病毒(carnation latent virus,clv)、香石竹蚀环病毒(carnation etchedring virus,cerv)、香石竹坏死斑点病毒(carnation necroticfleckvirus,cnfv)、香石竹脉斑驳病毒(carnation vein mottle virus,cavmv)。昆明地区是我国香石竹的主产地，其中香石竹斑驳病毒和香石竹坏死斑点病毒危害最为严重。
4.因此，提供一种香石竹标准化脱毒快繁方法，建立完整的香石竹脱毒快繁体系，以获得大量无病毒原种母本，提供无菌种苗，降低生产成本及促进香石竹产业发展，具有特殊意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种香石竹标准化脱毒快繁方法，建立完整的香石竹脱毒原种繁育体系，通过在诱导培养、扩繁培养的特定时间点进行病毒检测，保证培养诱导率高、繁殖系数高的脱毒香石竹原种。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.一种香石竹标准化脱毒快繁方法，包括以下步骤：对香石竹外植体进行病毒检测，将外植体接种到诱导培养基进行诱导培养；外植体出芽后切取芽体，根据病毒检测结果对携带病毒芽体进行脱毒，继续进行芽体培养；培养至丛生芽以后接种到扩繁培养基进行扩繁，再次进行病毒检测，淘汰携带病毒材料；脱毒材料扩繁至一定的基数后转入生根培养基进行生根培养。
8.优选的是，所述诱导培养基和扩繁培养基以ms为基础培养基，添加ba0.5-1.0mg/l+naa 0.1-0.3mg/l，ph 5.8-6.0。
9.优选的是，所述诱导和扩繁培养环境条件包括：培养温度22
±
1℃，光照强度2000-4000lux，光照时间10-12h/d。
10.优选的是，所述外植体出芽且芽长至2-3cm后切取芽体。
11.优选的是，所述病毒检测包括：
12.采用双抗体夹心酶联免疫法检测香石竹斑驳病毒，采用间接酶联免疫法检测香石竹坏死斑点病毒；或采用反转录-聚合酶链式反应法检测香石竹斑驳病毒和石竹坏死斑点病毒。
13.优选的是，所述脱毒采用高温处理结合剥茎尖法：将所述切取芽体置于38
±
1℃、光照强度1200-1500lux、光照时间14-16h/d环境下，处理30-35d，剥取至含1-2对叶原基的生长点时，置于诱导培养基上培养。
14.优选的是，所述扩繁期间，扩繁1次后取样进行病毒检测，继续扩繁后20-30d转接1次，1-2代后再检测一次病毒，连续检测2-3次，确认不带病毒后继续扩繁。
15.优选的是，所述脱毒材料扩繁10-15代后淘汰，期间不定期进行病毒检测，重新进行脱毒培养。
16.优选的是，所述生根培养基以ms为基础培养基，添加naa 0.1-0.3mg/l，ph 5.8-6.0。
17.优选的是，还包括生根培养后，炼苗移栽，2-3个月移栽成活后进行品种特性测试栽培，确认品种无变异后作为后续繁殖材料。
18.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
19.本发明提供了一种香石竹标准化脱毒快繁方法，将香石竹原种繁育技术进行了标准化，分别在诱导阶段、扩繁阶段的特定时间点对香石竹进行病毒检测，保证了培养诱导率高、繁殖系数高的脱毒香石竹原种，获得大量无病毒原种母本，提供无菌种苗，降低了生产成本及促进香石竹产业发展。
具体实施方式
20.本发明提供了一种香石竹标准化脱毒快繁方法，克服病毒病对香石竹无性繁殖的不利影响，以获得大量脱毒香石竹原种，包括以下步骤：对香石竹外植体进行病毒检测，将外植体接种到诱导培养基进行诱导培养；外植体出芽后切取芽体，根据病毒检测结果对携带病毒芽体进行脱毒，继续进行芽体培养；培养至丛生芽以后接种到扩繁培养基进行扩繁，再次进行病毒检测，淘汰携带病毒材料；脱毒材料扩繁至一定的基数后转入生根培养基进行生根培养。
21.本发明无性繁殖材料香石竹品种包括但不限于洪福、粉钻、大黄蜂、春草品种。
22.本发明优选外植体材料选择香石竹侧芽，不超过12cm；进一步优选在香石竹母本圃中选择生长健壮、性状优良、花色纯正、花型好、无病虫的植株采集外植体，要选择基部健壮的侧芽。若芽长超过12cm，中上部的芽已开始花芽分化，不能采用，否则会出现试管小苗开花现象。
23.本发明优选采集外植体后及时进行清理，逐层剥去叶片，注意不要撕破表皮，留顶部未伸展的2-3对叶，然后切留带顶茎段，在加入洗衣粉的清水内充分洗涤，并用清水漂洗，然后在超净工作台上放入浓度为0.1％-0.2％的氯化汞溶液内灭菌10-15min。为了防止灭菌不彻底，再转入2％-3％的次氯酸钠溶液内灭菌10min，取出后在无菌水内充分漂洗3-5次。在各个灭菌及漂洗程序内要不断摇动，使药剂与外植体材料充分接触，灭菌彻底。
24.本发明优选对外植体材料利用酶联免疫法或反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)法检测2个危害严重的香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus,carmv)和香石竹坏死斑点病毒(carnation necroticfleckvirus,cnfv)；进一步优选采用双抗体夹心酶联免疫法检测香石竹斑驳病毒，采用间接酶联免疫法检测香石竹坏死斑点病毒；更优选当利用酶联免疫法未检测出病毒时，再利用反转录-聚合酶链式反应检测。
25.本发明香石竹病毒抗血清从美国agdia公司购得。
26.本发明优选外植体材料消毒灭菌后，接种到诱导培养基进行诱导培养。本发明优选诱导培养基以ms为基础培养基，添加ba 0.5-1.0mg/l+naa0.1-0.3mg/l，ph 5.8-6.0；进一步优选以ms为基础培养基，添加ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，明显提升香石竹外植体的诱导率。
27.本发明优选诱导环境条件包括：培养温度22
±
1℃，光照强度2000-4000lux，光照时间10-12h/d。
28.本发明在外植体出芽后，切取芽体，根据病毒检测结果确定是否进行脱毒，继续进行芽体培养；进一步优选芽长至2至3cm后切取芽体。本发明优选脱毒采用高温处理结合剥茎尖法：将所述切取芽体置于38
±
1℃、光照强度1200-1500lux、光照时间14-16h/d环境下，处理30-35d，剥取至含1-2对叶原基的生长点时，置于诱导培养基上培养。本发明进一步优选剥取的茎尖生长点长0.2-0.4mm；更优选0.2mm。
29.本发明于诱导培养基培养脱毒外植体2-3个月后分化出新芽，待长至丛生芽以后接种至扩繁培养基扩繁增殖。本发明优选扩繁培养基以ms为基础培养基，添加ba0.5-1.0mg/l+naa 0.1-0.3mg/l，ph 5.8-6.0；进一步优选以ms为基础培养基，添加ba 0.5mg/l+naa 0.1mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，明显提升香石竹外植体的繁殖系数。
30.本发明优选扩繁环境条件包括：培养温度22
±
1℃，光照强度2000-4000lux，光照时间10-12h/d。
31.本发明在扩繁增殖期间，再次进行病毒检测，优选扩繁1次后取样进行病毒检测，继续扩繁后20-30d转接1次，1-2代后再检测一次病毒，连续检测2-3次，确认不带病毒后继续扩繁；检测带毒的无性系全部淘汰。进一步优选脱毒材料扩繁10-15代后淘汰，期间不定期进行病毒检测，重新进行脱毒培养。
32.根据生产实际需要扩繁至一定的基数后进行生根培养，将无毒繁殖材料接种至生根培养基进行生根培养。本发明优选生根培养基以ms为基础培养基，添加naa 0.1-0.3mg/l，ph 5.8-6.0；进一步优选以ms为基础培养基，添加naa 0.2mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，明显提升香石竹生根率。
33.本发明优选生根培养环境条件包括：培养温度22
±
1℃，光照强度2000-4000lux，光照时间10-12h/d。
34.本发明优选还包括生根培养后，炼苗移栽，2-3个月移栽成活后进行品种特性测试栽培，确认品种无变异后作为后续繁殖材料。
35.本发明通过调整培养基配方，提高香石竹无性繁殖的诱导率、繁殖倍数及生根率；通过在诱导阶段、扩繁阶段特定时间点进行病毒检测，并采用高温处理结合剥茎尖法进行脱毒，有效获得了大量脱毒香石竹原种。本发明获得的无毒种苗种植在同一温室设施内，在常规管理情况下，表现非常好，将无毒苗和带毒苗进行混种试验，无毒苗1年后开始感病，但
3年后的切花产量、优质花率仍高于带毒苗。若同一温室设施内全部种植无毒苗，并注意田间卫生管理，避免和减少各种栽培管理过程中病毒的传播途径，即使在非隔离栽培的情况下，种植2-3年的香石竹植株仍能体现由茎顶获得无毒苗的优质高产性。
36.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.实施例1
38.一种香石竹标准化脱毒快繁方法，包括以下步骤：
39.(1)材料：在香石竹母本圃中选择生长健壮、性状优良、花色纯正、花型好、无病虫的植株采集外植体，要选择基部健壮的侧芽，芽的长度一般不宜超过12cm；
40.(2)外植体消毒杀菌：采集好的外植体要及时进行清理，逐层剥去叶片，注意不要撕破表皮，留顶部未伸展的2对叶，然后切留带顶茎段，在加入洗衣粉的清水内充分洗涤，并用清水漂洗，然后在超净工作台上放入浓度为0.1％的氯化汞溶液内灭菌15min；为了防止灭菌不彻底，再转入2％的次氯酸钠溶液内灭菌10min，取出后在无菌水内充分漂洗3次；
41.(3)病毒检测：采用双抗体夹心酶联免疫法检测香石竹斑驳病毒，采用间接酶联免疫法检测香石竹坏死斑点病毒；当采用酶联免疫法未检测出病毒时，再利用反转录-聚合酶链式反应检测；
42.双抗体夹心酶联免疫法包括：在酶标板孔中加入100μl用包被缓冲液按工作浓度稀释好的抗体，将酶标板放入湿盒中，置于4℃冰箱内孵育过夜或室温(20-25℃)下孵育4h。所述包被缓冲液为0.05mol/lna2co
3-nahco3缓冲液，ph 9.6。将香石竹叶片和研磨缓冲液按1:10(w/v)的比例放入一次性自封袋中，将袋口封紧，碾压样品。所述样品研磨缓冲液为脱脂奶粉2.0g、聚乙烯吡咯烷酮(pvp,mw
24,000-40,000
)10.0g、无水亚硫酸钠1.3g、nan30.2g、tween-2010.0g溶于洗涤缓冲液(pbst)中，定容至1000ml，4℃保存。所述洗涤缓冲液(pbst)为nacl 8.0g、kh2po40.2g、na2hpo4·
12h2o 2.9g、kcl0.2g、tween-200.5ml加蒸馏水溶解至1000ml，调至ph 7.4。孵育结束后，用洗涤缓冲液清洗酶标板4-6次。每孔每次加pbst洗液400μl，每次停留1-2min。取研磨后的上清液，每孔加100μl，每个待测样品进行2次重复，同时设阴性对照和阳性对照。将酶标板放入湿盒中，4℃冰箱内孵育过夜或21-24℃下孵育2.5h。然后洗板。包被前10min准备酶标抗体，将特异性酶标抗体稀释缓冲液稀释至工作浓度，每孔加100μl。酶标板放入湿盒，21-24℃下孵育2.5h。然后洗板。所述酶标抗体稀释缓冲液为牛血清白蛋白bsa2.0g、聚乙烯吡咯烷酮(pvp,mw
24,000-40,000
)10.0g、nan30.2g溶于pbst中，定容至1000ml，4℃保存。每孔加入100μl的底物溶液。所述底物溶液现用现配，为1mg pnpp溶于1ml底物缓冲液中，浓度为1mg/ml。底物缓冲液为二乙醇胺97.0ml、氯化镁0.1g、nan30.2g溶于800ml蒸馏水中，用2mol/l盐酸调ph至9.8，定容至1000ml，4℃保存。酶标板放入湿盒中21-24℃下蔽光显色30-60min。每孔加入50μl终止液终止反应。所述终止液为3mol/l氢氧化钠溶液。终止反应20min内，将酶标板置于酶标仪中，在405nm下测定吸收值(od
405
)，记录反应结果。如样品的平均od值大于2倍的阴性对照od值，则判定为带有香石竹斑驳病毒；
43.间接酶联免疫法包括：将香石竹叶片和间接样品提取缓冲液按1:100(w/v)的比例放入一次性自封袋中，将袋口封紧，碾压样品。所述样品提取缓冲液为聚乙烯吡咯烷酮(pvp,mw
24,000-40,000
)20.1g、nan30.2g、nahco33.0g、na2co31.6g溶于蒸馏水中，定容至100ml，4
℃保存。取研磨后的上清液，每孔加100μl，每个待测样品进行2次重复，同时设阴性对照和阳性对照。将酶标板放入湿盒中，室温下孵育1h。孵育结束后用pbst洗液清洗酶标板8次。每孔每次加400μl，每次停留1-2min。洗板结束后控干。在酶标板孔中加入100μl用eci缓冲液按工作浓度稀释好的抗体。将酶标板放入湿盒中，室温下孵育2h。孵育结束后用pbst洗液清洗酶标板8次。每孔每次加400μl，每次停留1-2min。洗板结束后控干。所述eci缓冲液为牛血清白蛋白bsa 1.0g、聚乙二醇山梨醇单月桂酸酯0.3g、聚乙烯吡咯烷酮(pvp,mw
24,000-40,000
)10.0g、kcl 0.1g、k3po40.1g、nan30.02g、nacl 4.0g、na3po40.6g溶于蒸馏水中，定容至100ml，4℃保存。包被前10min准备酶标抗体，在酶标板孔中加入100μl用eci缓冲液按工作浓度稀释好的酶标抗体。将酶标板放入湿盒中，室温下孵育1h。孵育结束后用pbst洗液清洗酶标板8次。每孔每次加400μl，每次停留1-2min。洗板结束后控干。每孔加入100μl的pnp底物溶液。所述pnp底物溶液现用现配，为1mg pnp底物溶于1mlpnp底物缓冲液中，浓度为1mg/ml。pnp底物缓冲液为二乙醇胺40.0ml、盐酸乙醇胺12.0g、六水合氯化镁0.05g、nan30.1g溶于80ml蒸馏水中，用2mol/l盐酸调ph至9.8，定容至100ml，4℃保存。酶标板放入湿盒中室温下蔽光显色1h。将酶标板置于酶标仪中，在405nm下测定吸收值(od
405
)，记录反应结果。如样品的平均od值大于2倍的阴性对照od值，则判定为带有香石坏死斑点病毒；
44.反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)法包括：将0.05g样品组织放入灭菌研钵，加入1mltrizol溶液研成匀浆，将匀浆液移入1.5ml离心管中，室温放置5min，使组织充分裂解。加入200μl氯仿，用力颠倒离心管以混匀，静置5min后，12000r/min离心10min。吸取上层水相，移至另一个1.5ml离心管中。加入500μl异丙醇，混匀，室温放置10min。12000r/min离心5min，弃上清。加入1ml 75％乙醇，振荡片刻后，7500r/min离心5min，小心地弃上清。室温静置5-15min，使rna沉淀恰好干燥，加入50μl双蒸水，溶解后备用。在0.5μlpcr管中依次加入一下试剂进行反转录：双蒸水ddh2o 8μl，20pmol/μl随机引物0.5μl，rna模版2μl，70℃变性10min，冰上5min。然后加入5
×
m-mlv反转录缓冲液4μl，10mmol/l dntp 3μl，40u/μl核糖核酸抑制剂0.5μl，200u/μlm-mlv反转录酶1μl。将以上所有成分混匀，低速离心后，热循环仪中42℃反应1h。所述5
×
m-mlv反转录缓冲液为250mmol/ltris
·
hcl ph 8.3，375mmol/lkcl，15mmol/l mgcl2，50mmol/ldtt配制而成。结束后依次在pcr管中加入以下试剂进行pcr扩增：双蒸水32.7μl，10
×
pcr缓冲液5μl，20pmol/μl上游引物1μl，20pmol/μl下游引物1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.3μl，反转录产物10μl。充分混匀，按如下程序进行pcr扩增：94℃10min，然后按94℃变性30s、60℃退火60s、72℃延伸60s进行35个循环，再72℃延伸10min。所述10
×
pcr缓冲液为100mmol/ltris
·
hcl ph 8.3，500mmol/lkcl，15mmol/lmgcl2配制而成。扩增产物检测方法如下：将5
×
tbe以1:5稀释成1
×
tbe工作液，与琼脂糖配制成1.5％(w/v)的溶液，加热使琼脂糖完全熔化。待凝胶冷却至50-60℃时，加入适量的花青素，灌制平台，冷却。将pcr产物按6:1混合加样缓冲液，点样。按1-10v/cm电泳，至溴酚蓝迁移超过胶板长度的1/2以上，停止电泳。把胶板取出后，用凝胶成像系统进行观察、照相。所述5
×
tbe缓冲液为tris 54g、硼酸27.5g、0.5mol/l edta(ph 8.0)20ml定容至1000ml，4℃保存。加样缓冲液为0.25％溴酚蓝溶解于40％(w/v)蔗糖水溶液，4℃保存；
45.该方法所用的香石竹斑驳病毒引物序列为：
[0046]5′‑
引物，5
′‑
cggatagtcttgtcaacatacgg-3
′
,3
′‑
引物，5
′‑
ccttatcgttgcttgcctgt-3
′
；
[0047]
香石竹坏死斑点病毒引物序列为：
[0048]5′‑
引物，5
′‑
aaggtatcatcggcagacag-3
′
,3
′‑
引物，5
′
gaagaatctcgtgaagtggc3＇；
[0049]
(4)诱导培养：将消毒杀菌后的外植体接种到诱导培养基，诱导培养基以ms为基础培养基，添加ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；诱导培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度3000lux，光照时间11h/d；
[0050]
(5)脱毒处理：待外植体出芽且芽长至3cm后切取芽体，进行脱毒处理；采用高温处理结合剥茎尖法：将所述切取芽体置于38
±
1℃、光照强度1300lux、光照时间15h/d环境下，处理34d，剥取至含1-2对叶原基的生长点时，再次置于诱导培养基上培养；剥取的茎尖生长点长0.2mm；
[0051]
(6)扩繁培养：培养2-3个月后分化出新芽，待长至丛生芽以后接种至扩繁培养基，扩繁培养基以ms为基础培养基，添加ba 0.5mg/l+naa0.1mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；扩繁培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度3000lux，光照时间11h/d；
[0052]
(7)再次病毒检测：扩繁1次后取样进行病毒检测；继续扩繁后25d转接1次，1代后再检测一次病毒，连续检测3次，确认不带病毒后继续扩繁；检测带毒的无性系全部淘汰；
[0053]
(8)生根培养：根据生产实际需要扩繁至一定的基数后进行生根培养，将无毒繁殖材料接种至生根培养基，生根培养基以ms为基础培养基，添加naa 0.2mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；扩繁培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度3000lux，光照时间11h/d；
[0054]
(9)炼苗移栽：将生好根的瓶苗置于强光下晒4d，洗净根部黏附的培养基后，置于50％百菌清可湿性粉剂10000倍液浸10秒后拿出，移栽至泥炭：珍珠岩(1:1)的基质中培养，浇透定根水，盖上塑料薄膜保湿并盖一层遮阳网遮阴，14d后逐渐通风透光，每周浇一次1/8ms溶液促进生长；2-3个月移栽成活后进行品种特性测试栽培，确认品种无变异后可作为原种繁殖和保存，同时进行母本圃的扦插苗繁殖材料。
[0055]
实施例2
[0056]
(1)材料：在香石竹母本圃中选择生长健壮、性状优良、花色纯正、花型好、无病虫的植株采集外植体，要选择基部健壮的侧芽，芽的长度一般不宜超过12cm；
[0057]
(2)外植体消毒杀菌：采集好的外植体要及时进行清理，逐层剥去叶片，注意不要撕破表皮，留顶部未伸展的3对叶，然后切留带顶茎段，在加入洗衣粉的清水内充分洗涤，并用清水漂洗，然后在超净工作台上放入浓度为0.2％的氯化汞溶液内灭菌10min；为了防止灭菌不彻底，再转入3％的次氯酸钠溶液内灭菌10min，取出后在无菌水内充分漂洗5次；
[0058]
(3)病毒检测：同实施例1；
[0059]
(4)诱导培养：将消毒杀菌后的外植体接种到诱导培养基，诱导培养基以ms为基础培养基，添加ba 0.5mg/l+naa 0.2mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；诱导培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度4000lux，光照时间10h/d；
[0060]
(5)脱毒处理：待外植体出芽且芽长至2cm后切取芽体，进行脱毒处理；采用高温处理结合剥茎尖法：将所述切取芽体置于38
±
1℃、光照强度1200lux、光照时间16h/d环境下，处理35d，剥取至含1-2对叶原基的生长点时，再次置于诱导培养基上培养；剥取的茎尖生长点长0.3mm；
[0061]
(6)扩繁培养：培养2-3个月后分化出新芽，待长至丛生芽以后接种至扩繁培养基，
扩繁培养基以ms为基础培养基，添加ba 1.0mg/l+naa0.1mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；扩繁培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度4000lux，光照时间10h/d；
[0062]
(7)再次病毒检测：扩繁1次后取样进行病毒检测；继续扩繁后20d转接1次，1代后再检测一次病毒，连续检测2次，确认不带病毒后继续扩繁；检测带毒的无性系全部淘汰；
[0063]
(8)生根培养：根据生产实际需要扩繁至一定的基数后进行生根培养，将无毒繁殖材料接种至生根培养基，生根培养基以ms为基础培养基，添加naa 0.1mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；扩繁培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度4000lux，光照时间10h/d；
[0064]
(9)炼苗移栽：同实施例1。
[0065]
实施例3
[0066]
(1)材料：在香石竹母本圃中选择生长健壮、性状优良、花色纯正、花型好、无病虫的植株采集外植体，要选择基部健壮的侧芽，芽的长度一般不宜超过12cm；
[0067]
(2)外植体消毒杀菌：采集好的外植体要及时进行清理，逐层剥去叶片，注意不要撕破表皮，留顶部未伸展的3对叶，然后切留带顶茎段，在加入洗衣粉的清水内充分洗涤，并用清水漂洗，然后在超净工作台上放入浓度为0.2％的氯化汞溶液内灭菌12min；为了防止灭菌不彻底，再转入3％的次氯酸钠溶液内灭菌10min，取出后在无菌水内充分漂洗4次；
[0068]
(3)病毒检测：同实施例1；
[0069]
(4)诱导培养：将消毒杀菌后的外植体接种到诱导培养基，诱导培养基以ms为基础培养基，添加ba 1.0mg/l+naa 0.3mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；诱导培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度2000lux，光照时间12h/d；
[0070]
(5)脱毒处理：待外植体出芽且芽长至3cm后切取芽体，进行脱毒处理；采用高温处理结合剥茎尖法：将所述切取芽体置于38
±
1℃、光照强度1500lux、光照时间14h/d环境下，处理30d，剥取至含1-2对叶原基的生长点时，再次置于诱导培养基上培养；剥取的茎尖生长点长0.4mm；
[0071]
(6)扩繁培养：培养2-3个月后分化出新芽，待长至丛生芽以后接种至扩繁培养基，扩繁培养基以ms为基础培养基，添加ba 1.0mg/l+naa0.3mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；扩繁培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度2000lux，光照时间12h/d；
[0072]
(7)再次病毒检测：扩繁1次后取样进行病毒检测；继续扩繁后30d转接1次，2代后再检测一次病毒，连续检测2次，确认不带病毒后继续扩繁；检测带毒的无性系全部淘汰；
[0073]
(8)生根培养：根据生产实际需要扩繁至一定的基数后进行生根培养，将无毒繁殖材料接种至生根培养基，生根培养基以ms为基础培养基，添加naa 0.3mg/l+a琼脂6.0g/l+3％蔗糖，ph 5.8-6.0；扩繁培养环境条件：培养温度22
±
1℃，光照强度2000lux，光照时间12h/d；
[0074]
(9)炼苗移栽：同实施例1。
[0075]
实施例4
[0076]
不同诱导培养基对香石竹诱导效果的影响
[0077]
取消毒后的香石竹外植体，进行诱导培养基筛选试验。诱导培养基采用ms+ba0.5-1.0mg/l+naa 0.1-0.3mg/l+a琼脂6.0g/l，3％蔗糖，ph 5.8-6.0；培养温度22℃
±
1℃，光照2000-4000lux，每天照10-12h。筛选结果如表1：
[0078]
表1不同诱导培养基对香石竹诱导率和芽生长情况的影响
[0079][0080]
根据表1可以看出，当ms+ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l更有利于香石竹外植体的诱导。
[0081]
实施例5
[0082]
不同脱毒方法对香石竹脱毒效果的影响
[0083]
待外植体出芽且芽长至2至3cm后切取芽体，进行脱毒培养，采用3种脱毒方法，筛选最适宜香石竹脱毒方法。
[0084]
(1)直接剥茎尖法：将上述材料放在超净工作台上，肉眼下用镊子及解剖刀剥去嫩叶，露出生长锥，然后用镊子将芽的基部固定，在25-50倍的解剖镜下继续剥取茎尖，剥取至含1-2对叶原基的生长点时用刀尖挑取至培养基上；
[0085]
(2)高温处理结合剥茎尖法：将上述材料置于kbwf720人工气候箱中，每天38℃
±
1℃下光照培养14-16h，光照强度约为1200-1500lux，黑暗培养8-10h，处理30-35d，然后在25-50倍的解剖镜下继续剥取茎尖，剥取至含1-2对叶原基的生长点时用刀尖挑取至培养基上；
[0086]
(3)病毒唑结合剥茎尖法：将上述材料接种于含病毒唑的培养基上培养，即ms+ba0.5-1.5mg/l+naa 0.1-0.3mg/l+3-5mg/l病毒唑+a琼脂6.0g/l，3％蔗糖，ph 5.8-6.0；培养30-40d后剥茎尖；
[0087]
将上述剥取的茎尖接种至ms+ba 0.5-1.0mg/l+naa 0.1-0.3mg/l+a琼脂6.0g/l，3％蔗糖，ph 5.8-6.0培养基上培养；每个茎尖单独进行培养，单独编号；培养温度22℃
±
1℃，光照2000-4000lux，每天照10-12h。筛选结果如表2：
[0088]
表2不同脱毒方法对香石竹脱毒效果的影响
[0089][0090]
根据表2可以看出，高温结合剥取茎尖生长点的方法脱毒效果是最好的，且剥取的生长点控制在0.2mm最佳。
[0091]
实施例6
[0092]
不同扩繁培养基对香石竹扩繁效果的影响
[0093]
脱毒后的香石竹材料培养2-3个月后分化出新芽，待长至丛生芽以后接种至扩繁培养基，进行扩繁培养基筛选试验，每个处理30瓶，每10瓶一个重复，3次重复，20天统计结果。扩繁培养基采用ms+ba 0.5-1.0mg/l+naa0.1-0.3mg/l+a琼脂6.0g/l，3％蔗糖，ph 5.8-6.0；培养温度22℃
±
1℃，光照2000-4000lux，每天照10-12h。筛选结果如表3：
[0094]
表3不同扩繁培养基对香石竹繁殖系数和生长情况的影响
[0095][0096]
根据表3可以看出，当ms+ba0.5mg/l+naa 0.1mg/l更有利于香石竹扩繁。
[0097]
实施例7
[0098]
不同生根培养基对香石竹生根效果的影响
[0099]
香石竹材料扩繁至一定的基数后进行生根培养，每个处理30瓶，每10瓶一个重复，3次重复，20天统计结果。将无毒繁殖材料接种至生根培养基ms+naa 0.1-0.3mg/l+a琼脂6.0g/l，3％蔗糖，ph 5.8-6.0上诱导生根；培养温度22℃
±
1℃，光照2000-4000lux，每天照10-12h。筛选结果如表4：
[0100]
表4不同生根培养基对于香石竹生根率的影响
[0101][0102]
根据表4可以看出，ms+naa 0.2mg/l为香石竹为最佳生根培养基。
[0103]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：对香石竹外植体进行病毒检测，同时将外植体接种到诱导培养基进行诱导培养；外植体出芽后切取芽体，根据病毒检测结果确定对携带病毒芽体进行脱毒，继续进行芽体培养；培养至丛生芽以后接种到扩繁培养基进行扩繁，再次进行病毒检测，淘汰携带病毒材料；脱毒材料扩繁至一定的基数后转入生根培养基进行生根培养。2.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述诱导培养基和扩繁培养基以ms为基础培养基，添加ba 0.5-1.0mg/l+naa 0.1-0.3mg/l，ph 5.8-6.0。3.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述诱导和扩繁培养环境条件包括：培养温度22
±
1℃，光照强度2000-4000lux，光照时间10-12h/d。4.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述外植体出芽且芽长至2-3cm后切取芽体。5.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述病毒检测包括：采用双抗体夹心酶联免疫法检测香石竹斑驳病毒，采用间接酶联免疫法检测香石竹坏死斑点病毒；或采用反转录-聚合酶链式反应法检测香石竹斑驳病毒和香石竹坏死斑点病毒。6.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述脱毒采用高温处理结合剥茎尖法：将所述切取芽体置于38
±
1℃、光照强度1200-1500lux、光照时间14-16h/d环境下，处理30-35d，剥取至含1-2对叶原基的生长点时，置于诱导培养基上培养。7.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述扩繁期间，扩繁1次后取样进行病毒检测，继续扩繁后20-30d转接1次，1-2代后再检测一次病毒，连续检测2-3次，确认不带病毒后继续扩繁。8.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述脱毒材料扩繁10-15代后淘汰，期间不定期进行病毒检测，重新进行脱毒培养。9.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，所述生根培养基以ms为基础培养基，添加naa 0.1-0.3mg/l，ph 5.8-6.0。10.根据权利要求1所述的一种香石竹标准化脱毒快繁方法，其特征在于，还包括生根培养后，炼苗移栽，2-3个月移栽成活后进行品种特性测试栽培，确认品种无变异后作为后续繁殖材料。

技术总结
本发明提供了一种香石竹标准化脱毒快繁方法，属于无性繁殖技术领域。本发明包括以下步骤：对香石竹外植体进行病毒检测，将外植体接种到诱导培养基进行诱导培养；外植体出芽后切取芽体，根据病毒检测结果确定是否进行脱毒，继续进行芽体培养；培养至丛生芽以后接种到扩繁培养基进行扩繁，再次进行病毒检测，淘汰携带病毒材料；脱毒材料扩繁至一定的基数后转入生根培养基进行生根培养。本发明建立了完整的香石竹脱毒原种繁育体系，通过在诱导培养、扩繁培养的特定时间点进行病毒检测，保证培养诱导率高、繁殖系数高的脱毒香石竹原种。繁殖系数高的脱毒香石竹原种。


技术研发人员：张艺萍 屈云慧 苏艳 蒋亚莲 许凤 王继华 瞿素萍 王丽花 张丽芳 杨秀梅 赵阿香
受保护的技术使用者：云南省农业科学院花卉研究所
技术研发日：2022.05.10
技术公布日：2022/7/5