1.本发明属于杀灭鸡皮刺螨的技术领域，具体涉及一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物及其制备方法。
背景技术：2.鸡皮刺螨，又称家禽红螨。体型较小、移动速度快、主要以吸食鸡的血液为生家禽养殖业中最严重最常见的体外寄生虫病之一。鸡皮刺螨的感染可以导致一只产蛋母鸡每晚可能会失去超过3％的血容量并且对产蛋量、产蛋大小和产蛋质量产生负面影响。鸡螨虫繁殖迅速，在不受控制的条件下，平均每只鸡身上可寄生高达50000只螨虫。鸡皮刺螨可使家禽产生应激反应，并且对产蛋量、产蛋大小和产蛋质量产生负面影响。鸡螨虫的爆发感染不仅对养禽业可造成严重危害，对人类的健康也具有一定的程度上的威胁，近年来接连有人感染鸡螨虫的报道出现。
3.除此之外，还是多种病原体的传播媒介，可通过叮咬鸡体传播鸡痘病毒，新城疫、沙门氏菌、螺旋体、巴斯德菌，立克次氏体等20多种病原，同时也是东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、黄病毒和甲病毒等多种人兽共患病病原的携带者。对养殖业的发展造成极大危害。目前，鸡皮刺螨病的控制主要靠化学药物，但是长期滥用化学药物导致的耐药性与药物残留两大问题又日趋严重。因此，需要提供一种绿色健康产品，可有效抑制杀灭螨虫，从而缓解因其以及产生的耐药性与药物残留等问题。
4.已有研究报道中草药中含有的多种生物活性化合物，如酚类、黄酮类以及β-石竹烯(β-caryophyllene)、桉油醇(eucalyptol)、β-蒎烯(β-pinene)和樟脑(camphor)等，可以抑制导致昆虫神经系统中的乙酰胆碱酯酶活性，此外它们还可以作用于神经系统中的其他靶点，如烟碱型乙酰胆碱受体(nacr)、章鱼胺受体、酪胺受体、钠通道和γ-氨基丁酸(gba)门控氯通道。中草药具有抗菌、抗病毒、增强免疫力等多种功效，在现代动物寄生虫病防治中已得到多种研发应用。
技术实现要素：5.本发明提供一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物，为临床防治鸡皮刺螨提供一种便捷、低成本、高疗效、无残留的中药组合物。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
7.一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物，包括以下成分：八角、公丁香、蒲公英、益母草、木槿花、肉桂、乙醇溶液；
8.进一步的，按照质量份数包括如下成分：八角20-70份，公丁香20-70份，蒲公英20-70份，益母草20-70份，木槿花20-70份，肉桂20-70份，90％乙醇溶液120-200份；
9.进一步的，优选的，八角50-60份，公丁香50-60份，蒲公英50-60份，益母草50-60份，木槿花50-60份，肉桂50-60份，90％乙醇溶液150-160份。
10.进一步的，一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物的制备方法，包含如下步骤：
11.s1、将八角50-60份，公丁香50-60份，蒲公英50-60份，益母草50-60份，木槿花50-60份，肉桂50-60份，粉碎至20目并研磨；
12.s2、向研磨完成的混合物中加入150-160份90％乙醇溶液，并充分搅拌制得混合物a；
13.s3、将制得的混合物a，置于避光处浸泡1周，然后将混合物a通过纱布过滤，纱布布置为六层，经六层纱布过滤后，合并2次滤液；
14.s4、将滤液经3000r/min离心10min后取上清液，然后置沸水浴中挥尽乙醇；
15.s5、然后将药剂浓缩成膏，用0.9％氯化钠注射液定容至50ml，4℃保存。
16.相对于现有技术，本发明的有益效果为：
17.(1)本发明将八角的良好抗鸡皮刺螨活性和益母草结合，发现具有抑制鸡皮刺螨虫卵孵化的作用并且对鸡皮刺螨的成虫、若虫和幼虫杀灭作用显著。
18.(2)本发明中各药材均为常用传统药材，对鸡本身未造成任何毒副组用，是一种疗效好、无公害、无残留、提高免疫力、无体重下降和造成产蛋质量低等副作用、使用方便的防治鸡皮刺螨病的药物，为替代防治鸡皮刺螨的药品提供了新选择。
附图说明
19.图1为没食子酸标准曲线图；
20.图2为芦丁的标准曲线图；
21.图3为单宁的标准曲线图。
具体实施方式
22.一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物，包括以下成分：八角、公丁香、蒲公英、益母草、木槿花、肉桂、乙醇溶液。
23.按照质量份数包括如下成分：八角20-70份，公丁香20-70份，蒲公英20-70份，益母草20-70份，木槿花20-70份，肉桂20-70份，90％乙醇溶液120-200份。
24.其中较优的为：八角50-60份，公丁香50-60份，蒲公英50-60份，益母草50-60份，木槿花50-60份，肉桂50-60份，90％乙醇溶液150-160份。
25.一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物的制备方法,包含如下步骤：
26.s1、将八角50-60份，公丁香50-60份，蒲公英50-60份，益母草50-60份，木槿花50-60份，肉桂50-60份，粉碎至20目并研磨；
27.s2、向研磨完成的混合物中加入150-160份90％乙醇溶液，并充分搅拌制得混合物a；
28.s3、将制得的混合物a，置于避光处浸泡1周，然后将混合物a通过纱布过滤，纱布布置为六层，经六层纱布过滤后，合并2次滤液；
29.s4、将滤液经3000r/min离心10min后取上清液，然后置沸水浴中挥尽乙醇；
30.s5、然后将药剂浓缩成膏，用0.9％氯化钠注射液定容至50ml，4℃保存。
31.具体效果的对照实验为：
32.1.实验材料
33.1.1供试药物
34.公丁香、肉桂、蒲公英、八角、益母草、木槿花均购于同仁堂，详情见表1；无水乙醇分析纯(ar)购于天津市富宇精细化工有限公司；0.9％氯化钠注射液为基质，稀释备用；阳性对照伊维菌素购于河南安进生物技术股份有限公司；阴性对照0.9％氯化钠注射液购自河南科伦药业有限公司；空白对照蒸馏水由河南农业大学寄生虫学实验室自制。
35.表1.本实验所使用的6种中草药的信息表
[0036][0037][0038]
1.2鸡皮刺螨的采集
[0039]
河南省开封市某患病蛋鸡场的鸡笼、食槽、鸡体表等鸡舍设备上，用棉签轻挑螨体放入4号自封袋中，至少采取十份不同位置的样品。记录其发病时间，临床症状，用药情况等信息。之后带回实验室进行鉴定并放入4℃冰箱保存待用。试验时挑选个体大小，健康程度一致的鸡皮刺螨，实验试螨仅使用一次，之后用沸水处死。
[0040]
2实验方法
[0041]
2.1.1供试样品制备
[0042]
将八角50g，公丁香50g，蒲公英50g，益母草50g，木槿花50g，肉桂50g，粉碎至20目，加入200ml 90％乙醇溶液，浸泡1周，经六层纱布过滤，药渣加入100ml 90％乙醇溶液，再次浸泡24h，经六层纱布过滤，合并2次滤液。将滤液经3000r/min离心10min后取上清液，置沸水浴中挥尽乙醇，浓缩成膏，再用0.9％氯化钠注射液定容至50ml，即6种草药的生药含量为50g/ml。4℃保存。
[0043]
2.1.2总酚类的检测条件
[0044]
精密称取没食子酸对照品适量，加乙醇制成每1ml含0.2010mg的对照品母液，分别吸取0ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml以及2.1中制备的供试品溶液0.1ml于10ml棕色容量瓶中，加蒸馏水至5ml，充分混匀后加入1.0ml的福林酚试剂，加7.5％的碳酸钠定容，摇匀，
30℃避光反应1.5h，于760nm处测量吸光度。以没食子酸浓度(mg/ml)为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制成标准曲线。
[0045]
2.1.3黄酮类的检测条件
[0046]
精密称取芦丁对照品1.013mg，加入100ml 60％乙醇，放在55℃水浴锅中助溶，制成每1ml/1.013mg的对照品母液。吸取供试品溶液每份0.1ml以及制备好的芦丁对照品溶液0ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml于10ml棕色容量瓶中。加入0.3ml浓度为5％的亚硝酸钠溶液，摇匀后静置反应6min；再加入0.3ml浓度为10％的硝酸铝溶液，摇匀后避光反应15min；加入4％的氢氧化钠溶液4ml后在加入80％的乙醇溶液定容至刻度线，摇匀后避光放置10min后，使用酶标仪在波长510nm处测量其od值。以芦丁浓度(mg/ml)为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制成标准曲线。
[0047]
2.1.4单宁含量检测条件
[0048]
将10mg标准液用提取液稀释为0.085106、0.042553、0.021277、0.010638、0.005319mg/ml标准溶液。吸取1.2.1中提取的样品0.1ml和试剂盒中提取液1ml至2ml离心管中，于70℃水浴锅提取30min，期间每隔10min震荡一次，每次震荡5min。之后12000rpm，25℃离心10min待测。将处理好的测定管和标准管充分震荡5min，13000g离心20min(若上清仍有颗粒或浑浊，多次离心直至完全清澈)。取200μl上清液测定275nm下的吸光度。以标准曲线溶液的浓度(mg/ml)为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制成标准曲线。
[0049]
2.1.5精密度试验
[0050]
精密移取酚类，黄酮类以及单宁等标准品溶液200μl，置于96孔细胞板中，用酶标仪在规定波长下测定吸光值，分别连续测定6次。测试其相对标准偏差(rsd)值，检测仪器精密度是否良好。
[0051]
2.1.6重复性试验
[0052]
精密称取待测供试品溶液200μl，置于96孔细胞板中，使用酶标仪在规定波长下测定吸光值，每种供试品各重复6次。计算其rsd值。
[0053]
2.1.7稳定性试验
[0054]
取待测样品，于室温下放置，分别在0、2、4、6、8、12、24h进行检测，记录其吸光值，计算rsd值，检测供试品溶液在24h内稳定性是否良好。
[0055]
2.1.8加样回收率试验
[0056]
精密称取已知含量的同一样品6份，加适量的对照品，按上述方法制备供试品溶液，进样测定，计算平均加样回收率和rsd值，检验该方法的准确度。
[0057]
2.2滤纸药膜法
[0058]
2.2.1药膜的制备
[0059]
准备直径cm的培养皿，取同样大小的滤纸放置于皿底，将、分别吸取1ml待测的药液均匀的加在滤纸上，放置24h等待药液挥发制成药膜备用。
[0060]
2.2.2处理方法
[0061]
用小号毛笔刷选取10只生理状态较佳且一致的鸡皮刺螨(成虫)，放置在含有制备好药膜的培养皿中，使鸡皮刺螨成虫和药膜充分接触1h，将成虫转移至干净无药膜的培养皿中饲养，每次处理5次重复，并设不含药剂的处理组作为空白对照，含有机溶剂的处理组为阴性对照组，以及含有伊维菌素药膜(同1.1处理)的处理组为阳性对照组。
[0062]
2.2.3饲养与观察
[0063]
处理后的鸡皮刺螨成虫置于温度为25℃～30℃，相对湿度为60％～80％，光周期为l:d＝(12；12)h条件下的恒温恒湿培养箱中饲养。48h后观察并记录鸡皮刺螨成虫死亡率。
[0064]
2.2.4活性物质之间增效作用的测定方法
[0065]
采用mansour等的方法确定两种植物源物质混用是否具有增效作用：
[0066]
混剂理论死亡率(％)＝1-(1-pa)＊(1-pb)
[0067]
公式中，pa，pb分别表示各单剂的试虫死亡率。
[0068]
协同毒力指数(c
·
f)＝(实际死亡率-理论死亡)/理论死亡率＊100以c
·
f值大小来评判两种药剂混用的联合作用，其中c
·
f》20为增效作用，c
·
f《-20为拮抗作用，-20《c
·
f《20为相加作用。
[0069]
3.统计与分析
[0070]
试验数据采用excel整理,计算试验组死亡率：死亡率(％)＝死亡虫数/供试总虫数
×
100。通过spss 19.0(ibm,usa)软件计算死亡率的均值和偏差，使用probit算法计算螨的半数致死浓度(median lethal concentration,lc50)和95％置信区间(95％confidence interval,95％)；并通过线性回归计算r2(coefficient of determination)和回归方程。
[0071]
4.实验结果
[0072]
4.1.1总酚类标准曲线的建立
[0073]
由所测数据可知，1.2.1方法提取的6种中草药醇提物为得回归方程式为y＝1.9978
ⅹ
+0.046，r2＝0.9998。结果表明线性关系良好。如图1所示。
[0074]
4.1.2黄酮类标准曲线的建立
[0075]
由所测数据可知，1.2.1方法提取的6种中草药醇提物得回归方程式为y＝16.791
ⅹ
+0.088，r2＝0.9995。结果表明线性关系良好。如图2表示。
[0076]
4.1.3单宁标准曲线的建立
[0077]
由所测数据可知，1.2.1方法提取的6种中草药醇提物得回归方程式为y＝5.8881
ⅹ
+0.0224，r2＝0.9994。结果表明线性关系良好。如图3表示。
[0078]
4.1.4精密度试验
[0079]
精密移取标准品溶液测定吸光值，连续测定6次后。计算其rsd值分别为总酚类标准品1％，黄酮类标准品0.76％、单宁标准品0.42％，均在规定范围2％之内，表明该仪器精密度良好。
[0080]
4.1.5重复性试验
[0081]
取“2.1”中所致的供试品溶液每种6份，置于96孔细胞板中，使用酶标仪在510nm波长下测定吸光值。计算rsd值均在0.49％～2％之间，表明该方法重复性良好。详情见表1.
[0082]
表1.6种中草药醇提物的重复性试验结果(％)
[0083][0084]
4.1.6稳定性试验
[0085]
取同一供试品溶液，于室温下放置，分别在0、2、4、6、8、12、24h进行检测，记录其吸光值。计算其rsd值均在0.11％～2％之间，表明供试品溶液在24h内的稳定性良好。详情见表2.
[0086]
表2. 6种中草药醇提物的稳定性试验结果(％)
[0087][0088]
4.1.7加样回收率试验
[0089]
精密称取已知含量的6种供试品各6份，分别加0.2ml的对照品，按“2.1.2”、“2.1.3”、“2.1.4”项方法制备并进样测定，计算回收率。结果显示，蒲公英黄酮类的平均加样回收率最高为109.81％；公丁香单宁类平均加样回收率最低仅80.99％。6种供试品的平均加样回收率均在80％～120％之间，rsd值均在0％～3％之间。符合2015年《中华人民共和国药典》中质量标准分析方法验证指导原则的要求。详细回收率测定结果见表3至8。
[0090]
表3.益母草回收率测定
[0091][0092]
表4.公丁香回收率测定
[0093][0094][0095]
表5.八角回收率测定
[0096][0097][0098]
表6.蒲公英回收率测定
[0099][0100]
表7.肉桂回收率测定
[0101]
[0102][0103]
表8.木槿花回收率测定
[0104][0105][0106]
4.1.8 6种中草药醇提液活性生物含量测定结果
[0107]
取“2.1.1”方法中制备的公丁香、肉桂、益母草、八角、木槿花、蒲公英样品溶液，根据“2.1.2”、“2.1.3”、“2.1.4”方法进行总酚类、黄酮类、单宁含量测定。结果显示，公丁香活性成分含量最高，总体积为70.777mg/ml，其中总酚类占66.5mg/ml。活性成分含量最低的为木槿花，总体积为7.312mg/ml，其中酚类仅占7mg/ml。益母草则未检测到单宁含量。详细测定结果见表9。
[0108]
表9. 6种中草药醇提物中的活性成分含量(mg/ml)
[0109][0110]
4.2.1中草药醇提液杀灭鸡皮刺螨活性的初步筛选
[0111]
以体外浸渍法分别测定了6种中草药醇提液(50g/ml)对鸡皮刺螨成虫的毒杀活性并计算其lc
50
、lc
90
值。其中八角和益母草效果最好，lc
50
分别为0.159mg/ml、0.200mg/ml，lc
90
效果最好的是公丁香和益母草，分别为0.521mg/ml、0.622mg/ml。结果见表10。
[0112]
表10.中草药醇提液对鸡皮刺螨成虫的触杀毒性结果(48h)
[0113][0114]
注：lc
50
：半数致死浓度(mg/ml)；lc
90
：90％致死浓度(mg/ml)；ci95％：95％置信区间；r2：相关系数
[0115]
从表10可以看出，根据回归方程计算的lc
50
和lc
90
可知在6种中草药醇提液对鸡皮刺螨成虫的触杀毒性复筛中，八角、益母草和公丁香表现出极强的毒杀活性；其中八角、益母草和公丁香的lc
50
分别为0.159mg/ml、0.200mg/ml、0.292mg/ml，lc
90
分别为0.886mg/ml、0.622mg/ml、0.521mg/ml；而木槿花、蒲公英和肉桂的lc
50
分别为0.388mg/ml、0.410mg/ml、0.812mg/ml，lc
90
分别为1.119mg/ml、1.290mg/ml、3.163mg/ml；综合考虑生物活性和资源成
本等因素，能初步确定八角、益母草和公丁香有深一步研究的必要。
[0116]
4.2.2中草药醇提液的复配筛选
[0117]
对前期发现的八角、益母草以及公丁香等3种杀鸡皮刺螨中草药醇提液进行复配增效研究，结果见表11。
[0118]
表11. 3种中草药醇提液杀螨物质混用协同毒力指数的测定结果
[0119][0120][0121]
注：以上单剂的供试浓度分别是：八角lc
50
：0.159mg/l、八角lc
90
：0.886mg/l、益母草lc
50
：0.20mg/l、益母草lc
90
：0.622mg/l、公丁香lc
90
:0.521mg/l。
[0122]
a,b,c,d,e,f,同一列内后不同字母代表具有统计学意义(p《0.01)
[0123]
lsm，最小二乘均值；sem，平均值的标准误差。
[0124]
从表11可以看出，通过对八角等3种中草药醇提液杀鸡皮刺螨活性物质6个组合间的协同毒力指数的测定表明：八角lc
50
+益母草lc
50
、八角lc
50
+益母草lc
90
为拮抗作用；八角lc
90
+益母草lc
50
、八角lc
90
+益母草lc
90
为相加作用。综合考虑，能初步确定八角lc
90
+益母草
lc
90
有进一步研究的必要。
[0125]
4.2.3复配中草药醇提液对不同生长阶段鸡皮刺螨的触杀毒性
[0126]
根据表3的试验结果，使用体外浸渍法对3种中草药醇提液的复配对鸡皮刺螨触杀毒性，其中八角lc
90
+益母草lc
90
效果最好，因此进一步测试其对不同生长阶段的鸡皮刺螨的触杀毒性。结果表明八角lc
90
+益母草lc
90
鸡皮刺螨若虫和幼虫的杀灭效果最佳，死亡率为100.00％，详情见表12。
[0127]
表12.复配草药醇提液对不同阶段鸡皮刺螨的触杀毒性
[0128][0129]
注：a,b,c,同一列内后不同字母代表具有统计学意义(p《0.01)
[0130]
死亡率均表示为平均数
±
标准差
[0131]
从表12可以看出，通过对八角lc
90
+益母草lc
90
草药醇提液杀不同生长阶段的鸡皮刺螨触杀毒性表明：八角lc
90
+益母草lc
90
对成虫阶段的鸡皮刺螨校正死亡率为78.16％，对若虫和幼虫阶段的鸡皮刺螨的校正死亡率均为100％，对虫卵阶段的抑制孵化率为53.69％。根据以上结果，能初步确定八角lc
90
+益母草lc
90
对各个生长阶段的鸡皮刺螨具有良好的触杀毒性，可作为潜在的杀灭鸡皮刺螨中草药物复方药物。
技术特征：1.一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物，其特征在于：包括以下成分：八角、公丁香、蒲公英、益母草、木槿花、肉桂、乙醇溶液。2.根据权利要求1所述的一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物，其特征在于：按照质量份数包括如下成分：八角20-70份，公丁香20-70份，蒲公英20-70份，益母草20-70份，木槿花20-70份，肉桂20-70份，90％乙醇溶液120-200份。3.根据权利要求2所述的一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物，其特征在于：其中较优的为：八角50-60份，公丁香50-60份，蒲公英50-60份，益母草50-60份，木槿花50-60份，肉桂50-60份，90％乙醇溶液150-160份。4.一种如权利要求1-3任一所述的一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：s1、将八角50-60份，公丁香50-60份，蒲公英50-60份，益母草50-60份，木槿花50-60份，肉桂50-60份，粉碎至20目并研磨；s2、向研磨完成的混合物中加入150-160份90％乙醇溶液，并充分搅拌制得混合物a；s3、将制得的混合物a，置于避光处浸泡1周，然后将混合物a通过纱布过滤，纱布布置为六层，经六层纱布过滤后，合并2次滤液；s4、将滤液经3000r/min离心10min后取上清液，然后置沸水浴中挥尽乙醇；s5、然后将药剂浓缩成膏，用0.9％氯化钠注射液定容至50ml，4℃保存。
技术总结本发明公开了一种用于杀灭鸡皮刺螨的中药组合物，包括以下成分：八角、公丁香、蒲公英、益母草、木槿花、肉桂、乙醇溶液。本发明的有益效果为：对鸡本身未造成任何毒副组用，是一种疗效好、无公害、无残留、提高免疫力、无体重下降和造成产蛋质量低等副作用、使用方便的防治鸡皮刺螨病的药物，为替代防治鸡皮刺螨的药品提供了新选择。提供了新选择。提供了新选择。
技术研发人员：菅复春 菅忆晨 张龙现 宁长申 郭庆 张素梅 王荣军 李晓迎 李俊强
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2022.03.28
技术公布日：2022/7/5
