一株白酒来源微生物新种bjn0001及其在代谢葡萄糖生产乙醇和丁酸中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株白酒来源微生物新种clostridium btbubcensisbjn0001及其在小分子脂肪酸丁酸和乙醇生产中的应用。
背景技术：2.白酒中乙醇和水的含量约占白酒总量的98％，风味物质占总量的2％左右，是白酒中的微量成分，对白酒的品质起到决定性的作用。目前这些微量成分有2000多种，包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、杂环化合物、羰基化合物等。在2021年发布的gb/t 15109-2021《白酒工业术语》浓香型白酒引言中添加了酯和有机酸是白酒中重要的呈香、呈味物质，在自然条件下，有机酸和醇发生可逆的酯化反应，在一定时间内，有利于产品质量风格趋于稳定，口感更加醇厚。然而，在实际生产中，脂肪酸及其酯类物质的产生不稳定，这导致白酒发酵生产的品质不稳定，影响了优级酒的生产效率。有研究报道，在浓香型白酒中梭状芽孢杆菌属对中短链小分子脂肪酸如丁酸、己酸的产生具有重要贡献。因此研究窖泥微生物对白酒风味酸和酯类物质的产生起着重要作用。然而，由于窖泥的特殊环境，其中富含的微生物大多是厌氧或极度厌氧的微生物，培养条件较为苛刻。因此，到目前为止，窖泥中仍存在很多未分离的微生物。因此，筛选窖泥中具有合成酸类物质的功能性微生物，可以理性调控发酵过程，促进酸类、酯类物质的原位合成，从根本上保障发酵白酒品质，丰富白酒风味物质合成的微生物资源。
3.因此，本发明的目的是提供一株从白酒窖泥中分离的微生物新种clostridium btbubcensisbjn0001及其在代谢合成白酒发酵原料中的葡萄糖生产小分子脂肪酸丁酸和乙醇中的应用，具有代谢原料分解产生的葡萄糖，促进白酒中有益风味酸类和醇类物质产生的特性，为白酒发酵过程酸类物质和乙醇的合成提供优选的微生物资源。
技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一株白酒微生物新种clostridium btbubcensis bjn0001及其在小分子脂肪酸和乙醇生产中的应用。
5.本发明是通过以下技术方案来实现：
6.本发明公开了一株白酒微生物新种clostridium btbubcensis bjn0001及其在代谢葡萄糖生产小分子脂肪酸丁酸和乙醇中的应用。所述新种经全基因组测序，进行16s rrna基因序列及全基因组水平比较。结果表明，该菌株与最为相似菌株经16s rrna、基因组水平平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ani)、基因组水平dna-dna杂交(dna-dnahybridization，ddh)，序列相似度值皆在微生物新种阈值界限以外，鉴定该菌株为一株 clostridium属的微生物新种。
7.本发明还公开了一种clostridium btbubcensis bjn0001在发酵培养条件下代谢葡萄糖合成小分子脂肪酸丁酸及乙醇的应用。
8.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
9.本发明利用微生物技术，分离纯化得到一株clostridium btbubcensis bjn0001，经鉴定该菌株为一种微生物新种。本发明提供的clostridium btbubcensis bjn0001在特定发酵条件下，具有代谢葡萄糖合成小分子脂肪酸丁酸和乙醇的能力。已知的clostridium属的微生物，未见具有代谢葡萄糖同时合成丁酸和乙醇的能力。白酒发酵原料为粮食，淀粉含量丰富，在发酵过程中可以转化为葡萄糖。微生物新种资源的鉴定，为白酒源clostridium属微生物clostridiumbtbubcensis bjn0001转化葡萄糖生产乙醇和风味酸类物质提供了基础数据和微生物资源。
10.本发明所述的新种clostridium btbubcensis bjn0001，具有小分子脂肪酸代谢合成能力，为提升白酒的风味和品质提供优选资源。
11.保藏说明
12.本发明的梭菌属微生物新菌(clostridium btbubcensis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.40027，保藏日期为2021年12月24日。
附图说明
13.图1采用邻接法(mega 7.0)基于clostridium btbubcensis bjn0001及ezbiocloud数据库中与之最接近的模式菌株的16s rrna序列构建系统发育树
14.图2 clostridium btbubcensis bjn0001与三株亲缘关系最近的微生物菌种基因组序列的比较(利用ortho ani计算平均核苷酸同一性(ani)，利用ggdc v2.1确定dna-dna杂交 (ddh)值)
15.图3 clostridium btbubcensis bjn0001催化合成丁酸和乙醇的液相色谱图
16.图4不同发酵条件下clostridium btbubcensis bjn0001催化合成乙醇、丁酸的定量检测结果
17.图5基本培养基添加葡萄糖和乙酸钠条件下clostridium btbubcensis bjn0001的发酵代谢特征
具体实施方式
18.下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。
19.实施例1clostridium btbubcensis bjn0001的16s rrna系统发育分析
20.根据全基因测序结果，提取c.btbubcensis bjn0001(1503bp)的16s rrna的基因序列，提交给ezbiocloud进行初步鉴定。利用mega 7.0软件中的clustalw对新分离菌株和相似菌株的16s rrna的基因序列进行比对。采用邻接法(neighbor-jioning)构建系统发育树，对生成的拓扑树进行1000次重复计算获得自展支持率。
21.将提取c.btbubcensis bjn0001(1503bp)的16s rrna的基因序列提交给ezbiocloud进行比对，结果表明c.btbubcensis bjn0001与clostridium puniceum dsm 2619
t
(97.07％)、clostridium saccharoperbutylacetonicum n1-4(hmt)
t
(96.93％)、
clostridium saccharobutylicumdsm 13864
t
(96.93％)的16s rrna基因序列相似性最高。因此，这三个菌株被选为最近的亲缘关系进行比较分析。16s rrna基因序列的邻接法系统发育分析结果表明，菌株形成了一个单源的进化分支(图1)。
22.实施例2 clostridium btbubcensis bjn0001的全基因组比对
23.16s rrna序列相似性划分微生物新种的界限为97％，c.btbubcensis bjn0001 16s rrna 相似性最高值为97.07％。因此，利用菌株的全基因组进行更可靠的分析，以提供更可靠的分类学判定结果。ani和ddh值主要用于在全基因组水平评估物种间的亲缘关系。利用orthoani软件计算ani，利用ggdc v2.1软件计算菌株与参考菌株的ddh值。
24.将菌株bjn0001全基因组与相似性最高的几株菌进行全基因比较，菌株c.btbubcensisbjn0001与参比菌株c.puniceum dsm 2619
t
、c.saccharoperbutylacetonicum n1-4(hmt)
t
、c. saccharobutylicum dsm 13864
t
的ani值分别为73.23％、73.14％、74.01％，远低于ani物种界限阈值(95％)。与ani值类似，菌株c.btbubcensis bjn0001与参比菌株c.puniceum dsm2619
t
、c.saccharoperbutylacetonicum n1-4(hmt)
t
、c.saccharobutylicum dsm 13864
t
的ddh 值分别为20.8％、23.1％、22.9％，远低于推荐的物种划定分界点70％。
25.总之，全基因组比较结果ani值和ddh值显著支持c.btbubcensis bjn0001为一个 clostridium属的微生物新种。
26.实施例3 clostridium btbubcensis bjn0001在发酵培养条件下产丁酸和乙醇能力的测定
27.发酵培养基：kh2po
4 0.5g/l，k2hpo
4 0.5g/l，cacl
2 0.01g/l，fe2(so4)
3 3h2o 0.001g/l， (nh4)2so
4 1.0g/l，mgso
4 7h2o 0.2g/l，葡萄糖10g/l，乙酸钠10g/l，酵母浸粉5g/l，碳酸钙10g/l，刃天青钠0.1mg/l，调节ph为7.0，115℃灭菌20min，放入厌氧箱内，接种量为5％，在37℃条件下静置培养5d，发酵液通过液相色谱定量检测小分子脂肪酸和乙醇的合成量。
28.色谱柱为bio rad aminex hpx-87h。检测条件：流动相为0.006m h2so4溶液，流速为 0.9ml/min，柱温为65℃，进样量为10ul，检测器为视差折光检测器，检测时间20min。
29.结果证实，本发明提供的微生物新种c.btbubcensis bjn0001具有代谢葡萄糖同时合成小分子脂肪酸丁酸和乙醇的能力(图3)，通过比较不同条件下该菌株的发酵情况，可以看出该菌株在发酵过程中当葡萄糖和乙酸钠同时存在时可以产生丁酸和乙醇。在该条件下，丁酸产量为2.04
±
0.10g/l、乙醇产量为1.52
±
0.24g/l(图4)，而c.btbubcensis bjn0001在只添加葡萄糖或者乙酸钠的发酵培养基中生长时，不能同时代谢产生丁酸和乙醇。用添加葡萄糖和乙酸钠的发酵培养基进行了菌株产酸代谢特征的测定(图5)。结果显示，发酵过程中葡萄糖消耗彻底，这表明在发酵产生丁酸的过程中，葡萄糖是主要的原料，同时发酵培养基中的乙酸钠对菌株产丁酸起着正向促进作用。
技术特征：1.一株微生物新种clostridium btbubcensis，编号bjn0001，其特征在于，所述菌株发酵培养过程中具有代谢葡萄糖同时合成小分子脂肪酸丁酸和乙醇的特性。2.由权利要求1所述新种clostridium btbubcensis bjn0001，其特征在于，该菌株经16s rrna基因序列比对，以及全基因组水平评估物种间的亲缘关系，结果表明该菌株为一株clostridium属的微生物新种。3.如权利要求1所述clostridium btbubcensis bjn0001，具有代谢葡萄糖合成小分子脂肪酸丁酸和乙醇的能力，产量分别为2.04g/l和1.52g/l。
技术总结本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种细菌属Clostridium btbubcensis BJN0001新种的鉴定及其在代谢葡萄糖合成丁酸和乙醇中的应用。本发明公开的C.btbubcensis BJN0001，具有代谢葡萄糖同时合成丁酸和乙醇的能力，产量分别为2.04
技术研发人员：徐友强 孙宝国 张春生 杜秉昊 赵志刚 李秀婷 黄明泉 赵东瑞
受保护的技术使用者：承德乾隆醉酒业有限责任公司
技术研发日：2022.01.20
技术公布日：2022/7/5
