1.本发明涉及生物制药领域，尤其涉及多功能内膜干细胞造血分子材料和方法。
背景技术：2.多能干细胞(pluripotent stem cells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种apsc多能细胞，多能干细胞（psc）具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，多能干细胞是当前干细胞研究的热点和焦点，它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官，因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值，2007年，美国和日本科学家发现，应用人和鼠的正常皮肤细胞，导入klf4、oct4、sox2和c-myc四种基因，即可由正常体细胞转化成多能干细胞，这种基因诱导而产生的多能干细胞称为诱导多能干细胞(ipsc)，除了皮肤细胞，像其他apsc多能细胞实验室等其他体细胞也可以产生ips，应用ips已经成功培养和分化出心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织，多能干细胞研究和应用将会成为21世纪最伟大的医学生物学成就之一。
3.但在现有干细胞分化手段大多采用导入klf4、oct4、sox2和c-myc四种基因分化诱导，不仅技术性要求高，分化费用高昂，且失败率较高，容错率较高，进而无法实现大批量的分化诱导有益于生物制药领域的稳定高质量细胞，而为解决以上的技术性问题，现提出制备多功能内膜干细胞造血分子的材料和方法。
技术实现要素：4.（一）发明目的为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，使用本发明中提供的通过在分离的培养基中独立添加原料和添加剂的方式方，能够模拟实现在恒温、正常氧气浓度情况下诱导多能造血干细胞和体细胞结合后的分化，且利用哺乳动物骨髓腔中骨内膜和骨小梁表面或商业化哺乳动物血窦中取得的壁龛诱导多能造血干细胞归巢、定位和自身复制，形成增殖apsc多能干细胞以达到修复衰老、病变的细胞，重建功能正常细胞和组织的目的，并且利用oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子作为逆转录病毒载体进一步诱导细胞分化生成，同时本发明中的化学成分稳定，生物研发成本低，安全性高，分化效率高，能够为生物制药相关领域提供质量稳定良好的细胞，具有较高的商用和药用价值。
5.（二）技术方案本发明提供了多功能内膜干细胞造血分子材料，其包含多能造血干细胞、特定基因、体细胞、壁龛、慢病毒载体和oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子，具体的如下过程：取多能造血干细胞导入特定基因中再送入置于培养皿中的体细胞中，在添加导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞，而分化的细胞在特定条件下被逆转
后，恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系或者进一步发育成新个体的过程即为细胞重编程分化形成诱导性多能干细胞，并利用壁龛调控分化后的多能造血干细胞归巢、定位和自身复制进行，将慢病毒载体引入oct4、sox2、nanog和lin28转录因子中，并转入分化后的多能造血干细胞，形成多功能干细胞分子。
6.具体的，上述特定的转录因子为tfⅱd转录因子、tfⅱa转录因子、tfⅱb转录因子、tfⅱf转录因子、tfⅱe转录因子和tfⅱh转录因子中的任意一种，且特定转录因子与体细胞的比例为1：1。
7.作为本发明一种优选的方案，特定基因采用特定基因产物，而特定基因产物采用蛋白质或类蛋白质特性产物。
8.作为本发明一种优选的方案，多能造血干细胞分化成多种apsc多能细胞，且持续增生分裂，apsc多能细胞的形成通过特定基因送入体细胞后诱导体细胞，放入试剂盒后经实验室分离、培养后，将获得的增殖apsc多能干细胞注入类人体微环境中，通过多功能活化细胞自我靶向性功能准确到达相应的受损器官和组织，以达到修复衰老、病变的细胞，重建功能正常细胞和组织的目的。
9.作为本发明一种优选的方案，取自商业化哺乳动物骨髓腔中骨内膜和骨小梁表面或商业化哺乳动物血窦的壁龛，分别由骨内膜和骨小梁表面的成骨细胞组成或血窦内皮细胞组成。
10.具体的，成骨细胞生成和分泌的多种细胞外基质成分和细胞因子，及骨内膜表面的高浓度钙离子，对多能造血干细胞归巢、定位和自身复制进行调控，且骨内膜表面的钙离子浓度是血清钙离子浓度的30倍，骨髓腔内的钙离子浓度梯度影响多能造血干细胞的迁移方向和定位。
11.作为本发明一种优选的方案，慢病毒载体为逆转录病毒载体，且慢病毒载体的滴度为101tu/ml~103tu/ml。
12.作为本发明一种优选的方案，oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或仙台病毒中的任意一种方式诱导人体细胞获得的诱导性多能干细胞。
13.作为本发明一种优选的方案，体细胞为内膜体液差速离心所得。
14.具体的，体细胞为人体或其他哺乳动物的体液经过离心和超滤得到。
15.本发明还提供了多功能内膜干细胞造血分子材料：ⅰ采取哺乳动物的体液经过离心和超滤手段提取体细胞注入添加剂a后封入培养基1号中进行培养；具体的，添加剂a为bfgf细胞增殖分化调节剂，且bfgf细胞增殖分化调节剂在培养基中的终浓度为39ng/ml。
[0016]ⅱ采用哺乳动物中的衰老或一定程度损伤的多能造血干细胞接入培养基2号中进行培养，并在培养基中注入添加剂b。
[0017]
具体的，添加剂b为l-谷氨酰胺试剂，且l-谷氨酰胺试剂在培养基2号中的终浓度为50ng/ml。
[0018]ⅲ取哺乳动物的骨内膜和骨小梁表面的成骨细胞或血窦内皮细胞注入培养基3号中，且注入添加剂c。
[0019]
具体的，添加剂c为胰岛素，且胰岛素在培养基3号中的终浓度为60ng/ml。
[0020]ⅳ将oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒转入培养基4号中，且将培养基中滴加无维生素a型b-27添加剂。
[0021]
具体的，无维生素a型b-27添加剂在培养基4号中的终浓度为30ng/ml。
[0022]
本发明还提供了多功能内膜干细胞造血分子材料的方法：步骤1：上述的培养基1号中的bfgf细胞增殖分化调节剂增加2％~5％，利用光学显微镜观察培养基1号中的体细胞存活情况，并滴加1％~3％的细胞凋亡抑制剂，并继续培养2~3天，确保体细胞的生长情况良好；步骤2：利用光学显微镜观察上述中的培养基2号内部的衰老或一定程度损伤的多能造血干细胞凋亡情况，确保凋亡率保持在30％以下时，将培养基1号中的体细胞导入培养基2号中开始诱导分化实验，获得增殖apsc多能干细胞；步骤3：将培养基3号中的壁龛以及培养基4号中的oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒依次转入培养基2号中，同时滴加4％~7％区间的营养液，并将培养基2号放入正常氧气浓度的恒温培养箱中包被培养7~10天，随后对分化出的细胞进行染色标记。
[0023]
与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：使用本发明中提供的通过在分离的培养基中独立添加原料和添加剂的方式方，能够模拟实现在恒温、正常氧气浓度情况下诱导多能造血干细胞和体细胞结合后的分化，且利用哺乳动物骨髓腔中骨内膜和骨小梁表面或商业化哺乳动物血窦中取得的壁龛诱导多能造血干细胞归巢、定位和自身复制，形成增殖apsc多能干细胞以达到修复衰老、病变的细胞，重建功能正常细胞和组织的目的，并且利用oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子作为逆转录病毒载体进一步诱导细胞分化生成，同时本发明中的化学成分稳定，生物研发成本低，安全性高，分化效率高，能够为生物制药相关领域提供质量稳定良好的细胞，具有较高的商用和药用价值。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
图1为本发明提出的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法中细胞分化数量示意图；图2为本发明提出的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法中细胞分化强度结构示意图。
具体实施方式
[0026]
下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。在本发明中，术语“分化”描述了非特化细胞通过其而获得特化细胞（例如皮肤、心脏、肌肉、造血细胞）的特征的过程，“定向分化”指操作干细胞培养条件来诱导分化成特定的细胞类型。
[0027]
在本发明中，术语“多能干细胞”是指具有以下性质的细胞：能够在未分化状态下在体外无限增殖；通过长期培养维持正常的核型；以及即使在长时间培养后，仍保持分化为
所有三个胚胎胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的衍生物的潜力，目前可获得的多能干细胞的非限制性实施例包括胚胎干细胞（esc）和诱导多能干细胞（ipsc）。
[0028]
细胞的非限制性实施例包括：可从esi,singapore获得的hes2（也称为es02）细胞系和可从wicell,madison,wi获得的h1或h9（也称为wa01）细胞系，诱导多能干细胞是衍生自非多能细胞的人工衍生的干细胞（通常是成体体细胞），其通过诱导一种或多种干细胞特异性基因的表达而产生。
[0029]
在本发明中，术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病或病症以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质。例如，通常要求这种材料基本上是无菌的。
[0030]
在本发明中，术语“治疗”是指在伤害或干预之前、期间和/或之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病或病症的一种或多种临床症状。
[0031]
在本发明中，术语“患者”或“对象”是指用药物组合物或根据本文所述的方法治疗的动物，包括哺乳动物，例如，鼠、犬、马、牛、猿或人类，特别是人类。
[0032]
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
实施例一：根据传统的培养手段，多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，采取哺乳动物的体液经过离心和超滤手段提取体细胞注入终浓度为39ng/ml的bfgf细胞增殖分化调节剂后封入培养基1号中进行培养，采用哺乳动物中的衰老或一定程度损伤的多能造血干细胞接入培养基2号中进行培养，并在培养基中注入终浓度为50ng/ml的l-谷氨酰胺试剂，取哺乳动物的骨内膜和骨小梁表面的成骨细胞或血窦内皮细胞注入培养基3号中，且注入终浓度为60ng/ml的胰岛素，将oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒转入培养基4号中，且将培养基中滴加终浓度为30ng/ml的无维生素a型b-27添加剂，在上述的四个培养基进行恒温培养处理后，将培养基1号中的bfgf细胞增殖分化调节剂增加2％~5％，并滴加1％~3％的细胞凋亡抑制剂，继续培养2~3天，确保培养基2号内部的衰老或一定程度损伤的多能造血干细胞凋亡率保持在30％以下时，将培养基1号中的体细胞导入培养基2号中开始诱导分化实验，获得增殖apsc多能干细胞，将培养基3号中的壁龛以及培养基4号中的oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒依次转入培养基2号中，同时滴加4％~7％区间的营养液，并将培养基2号放入正常氧气浓度的恒温培养箱中包被培养7~10天，随后对分化出的细胞进行染色标记，标记的细胞为分化出的多功能内膜造血干细胞。
[0034]
实施例二：其在实施例一的基础上，在各个培养基原有材料基础上滴加终浓度为40ng/ml的丙酮酸钠溶液试剂，进而得到的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，采取哺乳动物的体液经过离心和超滤手段提取体细胞注入终浓度为39ng/ml的bfgf细胞增殖分化调节剂后封入培养基1号中进行培养，采用哺乳动物中的衰老或一定程度损伤的多能造血干细胞接入培养基2号中进行培养，并在培养基中注入终浓度为50ng/ml的l-谷氨酰胺试剂和终浓度为40ng/ml的丙酮酸钠溶液试剂，取哺乳动物的骨内膜和骨小梁表面的成骨细胞或血窦内皮细胞注入培养基3号中，且注入终浓度为60ng/ml的胰岛素和终浓度为40ng/ml
的丙酮酸钠溶液试剂，将oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒转入培养基4号中，且将培养基中滴加终浓度为30ng/ml的无维生素a型b-27添加剂和终浓度为40ng/ml的丙酮酸钠溶液试剂，在上述的四个培养基进行恒温培养处理后，将培养基1号中的bfgf细胞增殖分化调节剂增加2％~5％，并滴加1％~3％的细胞凋亡抑制剂，继续培养2~3天，确保培养基2号内部的衰老或一定程度损伤的多能造血干细胞凋亡率保持在30％以下时，将培养基1号中的体细胞导入培养基2号中开始诱导分化实验，获得增殖apsc多能干细胞，将培养基3号中的壁龛以及培养基4号中的oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒依次转入培养基2号中，同时滴加4％~7％区间的营养液，并将培养基2号放入正常氧气浓度的恒温培养箱中包被培养7~10天，随后对分化出的细胞进行染色标记，标记的细胞为分化出的多功能内膜造血干细胞。
[0035]
具体的，结合以上两个实施例中提供的事件，实施例1中分化的多功能内膜造血干细胞活化数量以及活化强度要优于实施例2中的多功能内膜造血干细胞活化数量以及活化强度。
[0036]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：1.多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，其特征在于，具有如下的步骤：s1：取多能造血干细胞导入特定基因中再送入体细胞中，分化形成诱导性多能干细胞；s2：利用壁龛调控分化后的多能造血干细胞归巢、定位和自身复制进行；s3：将慢病毒载体引入oct4、sox2、nanog和lin28转录因子中，并转入分化后的多能造血干细胞，形成多功能干细胞分子。2.根据权利要求1所述的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，其特征在于，所述步骤s1中的特定基因采用特定基因产物；优选的方案，特定基因产物采用蛋白质或类蛋白质特性产物。3.根据权利要求1所述的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，其特征在于，所述步骤s1中的多能造血干细胞分化成多种apsc多能细胞，且持续增生分裂。4.根据权利要求1所述的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，其特征在于，所述步骤s2中的壁龛取自商业化哺乳动物骨髓腔中骨内膜和骨小梁表面或商业化哺乳动物血窦；优选的方案，骨内膜和骨小梁表面取得的壁龛为由成骨细胞组成，由血窦处取得的壁龛为血窦内皮细胞。5.根据权利要求1所述的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，其特征在于，所述步骤s3中的慢病毒载体为逆转录病毒载体，且慢病毒载体的滴度为101tu/ml~103tu/ml。6.根据权利要求1所述的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，其特征在于，所述步骤s3中的oct4、sox2、nanog和lin28四种转录因子的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或仙台病毒中的任意一种方式诱导人体细胞获得的诱导性多能干细胞。7.根据权利要求1所述的多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，其特征在于，所述步骤s1中的体细胞为内膜体液差速离心所得。
技术总结本发明公开了多功能内膜干细胞造血分子材料和方法，涉及生物制药领域，针对现有细胞分化诱导效率低，细胞的功能性差等问题，现提出如下方案，其包含多能造血干细胞、特定基因、体细胞、壁龛、慢病毒载体和Oct4、Sox2、Nanog和LIN28四种转录因子。本发明使用本发明中提供的通过在分离的培养基中独立添加原料和添加剂的方式方，能够模拟实现在恒温、正常氧气浓度情况下诱导多能造血干细胞和体细胞结合后的分化，且利用哺乳动物骨髓腔中骨内膜和骨小梁表面或商业化哺乳动物血窦中取得的壁龛诱导多能造血干细胞归巢、定位和自身复制，形成增殖APSC多能干细胞以达到修复衰老、病变的细胞，重建功能正常细胞和组织的目的。重建功能正常细胞和组织的目的。重建功能正常细胞和组织的目的。
技术研发人员：卓成柳 李丁
受保护的技术使用者：深圳医爱健康管理有限公司
技术研发日：2022.04.08
技术公布日：2022/7/5
