1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鳙鱼异源雌核发育的培育方法。
背景技术：2.鳙(aristichthys nobilis，2n＝48)是“四大家鱼”之一，属于鲤科、鲢亚科、鳙属，是我国主养的淡水品种。经多年人工繁殖和养殖，鳙发生了明显的性状退化，表现为生长速度降低、性成熟年龄提前、抗逆能力变弱等，甚至体型有向鲢转变的趋势。通过人工选育纯合的鳙种群作为繁殖亲本，可对鳙进行提纯复壮，获得具优良养殖性状的新品种。但由于鳙生长周期长，育种难度较大，关于鳙的育种和选育研究较少。兴国红鲤(cyprinus carpio var.xingguo，2n＝100)属于鲤科、鲤亚科、鲤属，生长速度快，产量高。
3.天然雌核发育(gynogenesis)是鱼类单性生殖中一种重要生殖方式。雌核发育依赖于血缘关系相近的雄性提供的精子激活卵子发育，但不发生雌雄原核的融合，是一种无融合或假配合的生殖方式。群体全部由雌性构成，或仅含少量的雄性个体，只产生雌性的后代，基因型则与母本相同或略有差异。雌鱼产出的卵子具有与母本完全相同的染色体组成。
4.人工诱导雌核发育根据天然雌核发育原理进行，必须作两个方面的技术处理。第一，在精子入卵之前人为地进行遗传物质的失活处理，第二，人工诱导二倍体的形成。一般雌核发育鱼的培育采用紫外线照射来灭活精子的遗传物质，然后用“冷休克”处理卵子，人工诱导二倍体的产生，使胚胎正常发育成仔鱼。人工诱导雌核发育可加速鱼类种群纯合，缩短育种周期。
5.由于雌核发育可以建立单性种群，提高生产性能，因此有关雌核发育培育鱼这方面的研究较多。比如，中国专利曾公开了名称为《大黄鱼雌核发育的诱导方法》，公开号cn 101574069a；公开了名称为《草鱼的雌核发育方法及其应用》，公开号cn 101669449a；以及公开了名称为《雌核发育鲤鱼的培育方法》，公开号cn 102007879a等发明专利申请。这些专利的培育方法是将经紫外线灭活的精子和成熟卵子混合，经1～2分钟激活后，再将被激活卵子置于0℃温度条件冷休克处理30～40分钟，再进行孵化。这类培育方法存在操作繁琐，操作条件要求高，不易推广等缺点，且还有可能影响后代繁殖性能。
技术实现要素：6.本发明目的是为了弥补现有技术上的不足，从远缘杂交技术层面提供一种操作方便、易于推广、后代性状优良、遗传稳定的雌核发育鳙鱼的培育方法。并对雌核发育机制进行鉴定，以期简化操作步骤，尽快获得纯合的鳙种群。
7.本发明主要是通过以下技术方案来实现的：
8.一种鳙鱼异源雌核发育的培育方法，具体步骤为：以雄性兴国红鲤和雌性原种鳙鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将人工采集的兴国红鲤精子和原种鳙鱼的成熟卵子置于同一容器中，用羽毛轻轻搅动，进行干法受精，然后转入流水孵化槽，在24℃～26℃水温下自然孵化，获得二倍体雌核发育鳙鱼。
9.所述的雄性兴国红鲤引自江西，人工繁殖选育3代以上，确认种质纯正，雄性兴国红鲤体况健康，发育良好，性成熟特征明显。
10.所述的原种鳙鱼为湖南省鱼类原种场从湘江长沙段捕捞的天然原种培育而成，雌性原种鳙鱼发育良好，性成熟特征明显。
11.所述人工催产的具体方法为：在繁殖季节，当水温稳定在25℃以后，选取性腺发育良好的雄性兴国红鲤和雌性原种鳙鱼，注射催产剂；先对原种鳙鱼注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，绒毛膜促性腺激素的用量为 1000iu/kg～1500iu/kg，促黄体素释放激素类似物的用量为30μg/kg～40μg/kg； 4h～5h后再用同样催产剂注射雄性兴国红鲤，剂量减半；注射时采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一针注射法；注射后按1：(1～1.5)的数量比将雌性原种鳙鱼和雄性兴国红鲤放入同一圆形产卵池催产。
12.本发明具有以下有益效果：
13.本发明创新性的首次选用兴国红鲤精子作为刺激源来人工诱导雌核发育鳙鱼，因为实验证明兴国红鲤精子对鳙鱼成熟卵子激发作用较好，受精率能达到 90.9％；兴国红鲤具有生长速度快、产量高的特点，通过兴国红鲤的远缘杂交产生的“异精效应”，可以使雌核发育鳙鱼在生长速度方面得到遗传改良；另外，本发明中设置了鳙鱼自交对照组，与二倍体雌核发育鳙鱼采取完全相同的催产方法和孵化方法，在相同的养殖条件下进行养殖，对比两者的遗传生物学和生长性能差异。同时，通过流式细胞仪检测细胞核dna含量、染色体计数和核型分析、线粒体dna全序列测定3种方法，有利于快速鉴定远缘杂交所得子代为二倍体雌核发育鳙鱼。
14.本发明采用远缘杂交的方式，用与鳙鱼亲缘关系较远的兴国红鲤精子诱导鳙鱼卵子进行雌核发育，成功获得三批二倍体雌核发育鳙鱼。本发明大大简化雌核发育中人工遗传灭活的操作，节省人力物力。同时，利用鳙受精卵自发的染色体加倍，获得雌核二倍体苗，可避免人工加倍染色体所造成的染色体断裂、丢失等问题，保证所得子代具有常规自交子代相同的繁殖性能。本发明获得的雌核发育鳙鱼不仅存活率高，生长速度快，而且在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。
附图说明
15.图1为本发明具体实施方式中，通过流式细胞仪检测两种鳙鱼苗的dna含量峰值分析图；其中的a图表示远缘杂交雌核发育鳙鱼苗的dna含量峰值分析图，b图为自交对照组鳙鱼苗的dna含量峰值分析图；
16.图2为本发明具体实施方式中雌核发育鳙鱼染色体图(2n＝48)；a图为雌核发育鳙鱼染色体图，b图为自交对照鳙鱼染色体图；
17.图3为本发明具体实施方式中微卫星引物扩增的雌核发育鳙鱼和自交对照组图谱；a图为微卫星引物bl58扩增的雌核发育鳙鱼和自交对照组电泳图谱，b 图为微卫星引物bl6扩增的雌核发育鳙鱼和自交对照组电泳图谱。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
19.在繁殖期前2～3个月挑选性成熟特征明显、体型好、体质健壮的雄性兴国红鲤和雌性鳙鱼个体作为亲鱼进行专池精养，投喂亲鱼配合饲料，提供充足营养，促进亲鱼性腺发育。
20.到繁殖季节4～5月份，当水温稳定在25℃左右，挑选体征健康、性腺发育良好的亲鱼进行人工催产。先对原种鳙鱼注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，绒毛膜促性腺激素的用量为1000iu/kg～1500iu/kg，促黄体素释放激素类似物的用量为30μg/kg～40μg/kg；4h～5h后再用同样催产剂注射雄性兴国红鲤，剂量减半；注射时采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一针注射法，尽量避免对亲鱼伤害，减少产后死亡率；注射后按1：1.2的数量比将雌性原种鳙鱼和雄性兴国红鲤放入同一圆形产卵池催产，水面吊一束棕榈网片，方便观察亲鱼发情产卵情况；当发现亲鱼在产卵池中追逐并激起水花声响时，且棕榈网片上沾有白色卵粒后，开始拉网打捞亲鱼并在水中初步检查亲鱼发情情况，当轻触雄性兴国红鲤腹部有乳白色精液流出，轻按雌性鳙鱼腹部有大量卵粒流出表明催产效果良好，可以进行人工授精；按一比一配对原则挑选2组亲鱼进行后续的人工授精操作。
21.对上述挑选出的亲鱼进行人工干法授精，先将原种鳙鱼的成熟卵子挤入脸盆等容器中，注意刚开始挤出和最后挤出的卵子弃之不用，取中间挤出的卵子。同时注意如果卵中带血、卵粒成团不散开表示性腺发育不好，不能选用。马上将兴国红鲤精子挤入同一容器中，用羽毛轻轻搅动，充分混匀，然后转入流水孵化槽，在24℃～26℃水温下自然孵化。
22.鱼苗全部脱膜后，在孵化槽中培育1～2天，待鱼苗出现腰点、卵黄囊消失、平游可以开口摄食后，转入池塘。用豆浆喂养1个星期，换次粉投喂1个星期，直到鱼苗长到能正常摄食，即得到雌核发育鳙鱼。
23.上述鳙鱼卵子在雌核发育过程中，胚胎的受精率为82.2％～90.9％，孵化率为0.14％～0.22％。用紫外线灭活兴国红鲤精子诱导鳙鱼雌核发育的孵化率为 0.2％，同本发明孵化率相近。
24.取雌核发育鳙鱼苗和自交对照鳙鱼苗各3尾，用德国partec gmbh公司生产的流式细胞仪(ploidy analyser)检测dna含量；具体操作如下：用经肝素钠润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2ml，注入装有0.8％生理盐水的eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1ml细胞核提取液 dapi-a(nuclei extractionsolution，德国partec gmbh提供)，处理时间 10～15min；样品经过20μm尼龙滤器(德国partecgmbh提供)过滤；dna染色液(dapi-b，德国partec gmbh提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测dna含量。检测结果如图1所示，从图中可以看出，雌核发育鳙鱼的dna含量平均为54.80，与对照组鳙鱼的dna含量54.37无显著性差异。说明远缘杂交的雌核发育子代为二倍体。
25.再用外周血细胞培养法制备染色体对雌核发育鳙鱼的血细胞染色体数目进行抽样检测。血细胞分裂中期染色体制备过程为：用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，实验鱼尾部用碘酒消毒后，从尾静脉取血制成抗凝血，将抗凝血加入培养液中，每10ml培养液(培养基配方为rpmi-1640，84ml；小牛血清15ml；pha 2支；0.1肝素钠1ml；加双抗到终浓度为100单位/ml)中约加入0.2ml 抗凝血。在24℃，5％二氧化碳浓度的培养箱中培养，时间为68～72小时；培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。终止培养前2～4小时，在培养液中用1ml注射器滴加入10ug/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05-0.07μg/ml；将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心5分钟，弃上清液；向刻度离心管中加入低渗液9ml，用滴管混
匀，低渗25～30分钟；低渗后加入1ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心5分钟，弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心5分钟，弃上清液，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液；吸取细胞悬液自20～30cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，空气中自然干燥；1:10giemsa染液染色20～40分钟，细水冲洗背面去多余染液，气干；低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。由图2可见，远缘杂交得到的雌核发育鳙鱼为二倍体(2n＝4 8)，自交对照鳙鱼的染色体数目同样也为2n＝48，而研究表明鲤的染色体数目为2n＝100，所以实验得到的子代染色体构成与母本鳙鱼相同。
26.(8)选取步骤(5)检测的含有交配型基因mat1-1-1和mat1-1-2却不含有mat1-2-1的单孢子形成的菌落，与含有交配型基因mat1-2-1却不含有mat1-1-1和mat1-1-2的单孢子形成的菌落分别取2～5％大小的菌丝体块接种于步骤(7)制好的营养液中，置于震荡摇床中，设置19℃、避光、转速150rpm摇瓶培养4-5天；
27.采用微卫星技术，研究鳙异源雌核发育子代与对照子代间遗传结果差异。剪取雌核发育鳙鱼和自交对照鳙鱼的鳍条，无水乙醇保存于-20℃，备用；采用经典酚氯仿方法提取dna，0.8％琼脂糖电泳检测纯度和浓度；设计微卫星 dna引物22对(见下表1)。pcr扩增反应体系包括：30ng模板dna，上下游引物各10μm，1
×
taq buffer，200μm dntp，1unit taq酶，mg2+随各引物而定，加ddh2o至25μl。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、50-56℃退火30s、72℃延伸1.5min，40个循环；最后72℃延伸8min。
28.表1微卫星引物及序列：
29.[0030][0031]
微卫星扩增产物首先在2.0％琼脂糖凝胶中电泳(5v/cm)，goldview染色，检测产物的有无和强弱。再根据琼脂糖电泳的结果进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染。银染具体步骤为：电泳结束后切断电源，从电泳槽中倒出缓冲液，然后取下胶板，将凝胶从玻板中取出放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗2次；加入染色液(0.2％的agno3、1％的冰醋酸、10％的无水乙醇)进行银染；加入显影液(3％的无水naoh，每200ml溶液加1ml甲醛) 进行显色。注意银染和显影后均用蒸馏水漂洗2次；用数码相机对凝胶进行照相。将dna条带转换成矩阵，用popgene3.2软件统计各群体的等位基因组成，计算各群体的杂合度、多态信息含量等指标，计算两两群体间nei氏标准遗传距离。
[0032]
研究用22对引物扩增结果显示，其中21对引物有扩增产物，但只有7对引物扩增产物呈现多态性，其余15对引物均无多态。在呈多态的7对引物扩增结果中，雌核发育组子代比对照组子代遗传结构纯度更高，表现在群体、个体水平。从图3的a图可以看出，引物bl58扩增结果表明在群体水平上，雌核发育组子代群体呈现更高的纯合性，而对照组杂合度更高；b图则显示引物bl6 扩增结果表明在个体水平上，雌核发育组子代群体呈现更高的纯合性，而对照组个体均呈现杂合。
[0033]
将获得的二倍体雌核发育鳙鱼苗和自交对照组鳙鱼苗放养于同一池塘中，进行生长对比实验。为便于区分，在鳙鱼下颌部采用荧光标记，其中有绿色的荧光标记为雌核发育鳙鱼，有黄色的荧光标记为自交对照组鳙鱼。养殖周期从5月20日到11月23日，定期采样，检查生长情况。整个养殖周期中共采样4次，研究结果显示，雌核发育组生长速度快于对照组。
具体数据见表2。
[0034]
表2雌核发育组和对照组鳙体重变化：
[0035][0036]
将雌核发育鳙鱼饲养到成鱼后，比较雌核发育子代与父母本间形态学的差异，目测发现在外部形态方面没有明显差异。为避免因鱼体大小规格差异造成的误差，采用测定形态学参数进行比较，结果见表3。
[0037]
表3三组实验鱼可量性状的框架系数：
[0038][0039]
从表3中可以看出，雌核发育子代形态仍然与母本鳙接近，远离于父本兴国红鲤，说明鳙雌核发育子代仍保持鳙主要性状，这将有助于在保持鳙稳定性状的基础上，选育具更优性状的鳙新品种。
[0040]
本实施例方法获得大量的雌核发育鳙鱼，经过二年重复实验，证明方法成功可靠。不仅鳙鱼性状得到进一步改良，而且大大简化了人工雌核发育的操作难度，表明兴国红鲤精子是进行远缘杂交雌核发育的理想材料，在生物进化研究和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。
[0041]
尽管已经详细描述了本发明的实施方式，但是应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施方式做出各种改变、替换和变更。
技术特征：1.一种鳙鱼异源雌核发育的培育方法，其特征在于，具体步骤为：以雄性兴国红鲤和雌性原种鳙鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将人工采集的兴国红鲤精子和原种鳙鱼的成熟卵子置于同一容器中，用羽毛轻轻搅动，进行干法受精，然后转入流水孵化槽，在24℃～26℃水温下自然孵化，获得二倍体雌核发育鳙鱼。2.根据权利要求1所述的一种鳙鱼异源雌核发育的培育方法，其特征在于，所述的雄性兴国红鲤引自江西，人工繁殖选育3代以上，确认种质纯正；雄性兴国红鲤体况健康，发育良好，性成熟特征明显。3.根据权利要求1所述的一种鳙鱼异源雌核发育的培育方法，其特征在于，所述的原种鳙鱼为湖南省鱼类原种场从湘江长沙段捕捞的天然原种培育而成；雌性原种鳙鱼发育良好，性成熟特征明显。4.根据权利要求1所述的一种鳙鱼异源雌核发育的培育方法，其特征在于，所述人工催产的具体方法为：在繁殖季节，当水温稳定在25℃以后，选取性腺发育良好的雄性兴国红鲤和雌性原种鳙鱼，注射催产剂；先对原种鳙鱼注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，绒毛膜促性腺激素的用量为1000iu/kg～1500iu/kg，促黄体素释放激素类似物的用量为30μg/kg～40μg/kg；4h～5h后再用同样催产剂注射雄性兴国红鲤，剂量减半；注射时采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一针注射法；注射后按1：(1～1.5)的数量比将雌性原种鳙鱼和雄性兴国红鲤放入同一圆形产卵池催产。
技术总结本发明公开了一种鳙鱼异源雌核发育的培育方法，具体步骤为：以雄性兴国红鲤和雌性原种鳙鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将人工采集的兴国红鲤精子和原种鳙鱼的成熟卵子置于同一容器中，用羽毛轻轻搅动，进行干法受精，然后转入流水孵化槽，在24℃～26℃水温下自然孵化，获得二倍体雌核发育鳙鱼。本发明方法培育雌核发育鳙鱼，可获得与人工遗传灭活父本精子同样的效果，可大大简化常规雌核发育中人工遗传灭活的操作，节省人力物力。同时，利用鳙受精卵自发的染色体加倍，保证雌核发育子代具有常规自交子代相同的繁殖性能。本发明方法对生物学遗传育种研究具有重要意义。法对生物学遗传育种研究具有重要意义。法对生物学遗传育种研究具有重要意义。
技术研发人员：王金龙 何志刚 邹利 曾鸣 刘明求 丁德明 李传武
受保护的技术使用者：湖南文理学院
技术研发日：2022.05.10
技术公布日：2022/7/5
