一种光介导相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学检测和纳米材料领域，具体涉及一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法。
背景技术：2.前列腺癌近些年每年致死约30万人，是男性第二常见的恶性肿瘤。目前临床主流的检测手段有直肠指检和经直肠超声检查，这些技术的灵敏度不足并且取样过程痛苦。前列腺癌的早期筛查是提早精准用药的前提，其中前列腺特异性抗原(psa)血清测试，已被较广泛的应用，且被认为有效的降低了死亡率。然而血清中psa会受机体炎症反应、年龄、饮食改变影响，常出现假阳性。
3.外泌体是纳米级的细胞外囊泡，其中包裹核酸片段，负责细胞间通讯。近些年人们逐渐用它作为诊断的标记物，很多基于它分子膜上特异抗原检测的方法被提出。基于核酸扩增的 pcr方法通常比蛋白检测灵敏度高几个数量级，且数字pcr因为极高的灵敏度、改善的信噪比而被认定最新一代pcr技术。数字pcr已经被广泛应用在疾病诊断、基因表达评估、建库等多个领域。然而它的设备庞大、精密、昂贵已经限制了它的实践部署。
4.因此，在本发明中，我们从构建光响应性pcr入手，开发编程可控的激光器控制模块，实现自动化的近红外光输出，再可控开发巨有良好光热响应性的微滴群，优化该样品在特定光照控制下完成pcr热循环过程，提出一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr 技术对前列腺癌外泌体mir-375-3p和mir-574-3p的检测方法。
技术实现要素：5.本发明针对现有技术中的不足，提供一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字 pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna 的检测方法，包括如下步骤：
8.s1、开发激光器可控输出模块：
9.激光器可控输出模块包括近红外光激光器、电压线性放大器、arduino电路板、arduino ide开源平台；所述近红外光激光器具有i/o接口，近红外光激光器内部具有一号开关电源和二号开关电源，近红外光激光器外部具有激光光纤探头；所述近红外光激光器通过i/o接口与电压线性放大器、arduino电路板相接通；
10.s2、制备可相变光热响应性微球：
11.将高效光热纳米材料与纳米颗粒通过多巴胺粘合在一起，然后通过改进的反应在外部包裹sio2外涂层，形成光热复合材料；将光热复合材料混入温敏性水凝胶，形成复合水凝胶；最后通过微流控微滴形成芯片，将复合水凝胶乳化成微滴群；利用正交测试，
定量考量微滴群的升温速率受激光照射功率和纳米材料含量的影响；
12.所述复合水凝胶还包含茎环形式逆转录引物、特异性pcr引物以及taqman特异性荧光探针；
13.s3、光推动的可相变微滴数字pcr检测前列腺癌外泌体microrna标记物：
14.在arduino ide开源平台编译程序以优化光照程序，并烧录进arduino电路板；将微滴群置于激光光纤探头下方，同时实现逆转录反应和荧光探针的pcr过程；最后通过荧光拍照统计微滴群中发光微滴的比例，定量获得microrna标记物mir-375-3p和mir-574-3p的含量。
15.为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
16.进一步地，步骤s1中，所述arduino电路板的高电平引脚和接地引脚分别与电压线性放大器控制端的输入电压正负极vin+和vin-相连；arduino电路板的供电和程序烧录通过usb 接口与电脑交互。
17.进一步地，步骤s1中，所述电压线性放大器由一号开关电源供电，电压线性放大器的输出电压正极与近红外光激光器的“外控模式功率调节”端口相连。
18.进一步地，步骤s1中，电压线性放大器选用最终放大空间在0-10w、0-20w，0-30w、 0-50w、0-100w中的一种；一号开关电源和二号开关电源均选用参数为12v-1a、24v-1a、 36v-1a、12v-2a、36v-2a中的一种。
19.进一步地，步骤s2中，所述纳米颗粒为磁性fe3o4或sio2，其粒径为150～800nm。
20.进一步地，步骤s2中，所述光热纳米材料为mxene、氧化石墨烯、mos2、黑鳞中的一种。
21.进一步地，步骤s2中，所述温敏性水凝胶为琼脂糖水凝胶或在55-95℃温度范围内为溶胶态，温度小于55℃时为凝胶态的小分子明胶。
22.进一步地，步骤s2中，采用flow-focusing结构的微流控通道乳化微滴，交汇处水相通道宽度为30μm、50μm、75μm、100μm中的一种；交汇处油相通道宽度为30μm、50μm、75μm、100μm中的一种；水相通道和油相通道的深度均为60μm。
23.进一步地，步骤s2中，乳化微滴的油相流量-水相流量包括但不限于80-70μl/min、 100-70μl/min、150-80μl/min、200-100μl/min、300-120μl/min中的一种。
24.进一步地，步骤s2中，微滴群中乳化微滴的尺寸范围是80～300μm。
25.进一步地，步骤s2中，微滴群中乳化微滴的数量大于10000个。
26.进一步地，步骤s3中，荧光探针pcr温度循环对应的光照程序如下：单次反应过程为先95℃恒温30秒，再55℃恒温60秒，最后69℃恒温60秒，总计循环30～40次，pcr退火温度为55℃；该光照程序应用analogwrite函数赋值近红外光的功率强度，且二者为线性对应关系。
27.进一步地，步骤s3中，逆转录反应对应的光照程序如下：先25℃恒温5分钟，再50℃恒温15分钟，最后85℃恒温5分钟。
28.进一步地，步骤s3中，所述待检测的标记物mir-375-3p的序列为 uuuguucguucggcucgcguga，茎环形式逆转录引物的序列为 gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcacgc，特异性pcr 引物：f：ctcgcgtgagtcgtat；r：gtcgtatccagtgcag。
29.进一步地，步骤s3中，所述待检测的标记物mir-574-3p的序列为 cacgcucaugcacacacccaca，茎环形式逆转录引物的序列为 gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactgtggg，特异性pcr 引物：f：acacccacagtcgtat；r：gtcgtatccagtgcag。
30.进一步地，步骤s3中，所述taqman特异性荧光探针为fam、hex、rox基团中的一种，taqman的序列为cagtgcgaatacctcggacc。
31.本发明的有益效果是：
32.(1)本发明提供了一种激光器可控输出模块，包括红外光激光器、电压线性放大器、 arduino电路板、激光光纤探头以及arduino ide开源平台；在arduino ide开源平台编译程序，定义高电平引脚的模拟输出电压值和近红外光的功率强度、照射时长、循环照射过程的函数关系，将程序烧录进电路板，调试实现近红外光的可控变化输出，其中程序里模拟输出电压值与近红外光的功率强度呈线性变化规律，易于自定义化修改；该激光器可控输出模块体积小、成本低，有利于推广于各种检测场景；
33.(2)本发明提供的光响应性可相变微滴群是一种新型、智能的生化反应器，可以在光照介导下催化其它形式的生化反应；通过多巴胺黏附高效光热纳米材料与纳米颗粒，然后在其表面包裹sio2外涂层，赋予了材料良好的生物相容性，最后将复合材料添加到琼脂糖、明胶或者其他溶胶-凝胶转化温度低于50℃的水凝胶中去，通过微流控微滴形成芯片，所制备的样品体积微小能节约样本，数量庞大进而拥有高灵敏性和高通量，可逆相变与数字pcr常规的水微滴相比具有更适宜的物理稳定性；
34.本发明结合激光器可控输出模块和光响应性可相变微滴群，提供了一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法；利用arduinoide开源平台配套使用pcr温度循环过程的控制代码具有控制精准、重复性高、全自动化、代码开放、便于编辑的优点；复合光热纳米材料水凝胶中还掺杂有茎环形式逆转录引物、特异性pcr引物以及taqman特异性荧光探针，在经过激光器可控输出模块的近红外光照射后，实现光控的逆转录反应和荧光探针的pcr过程，最后通过荧光拍照统计微滴群中发光微滴的比例，定量获得microrna标记物mir-375-3p和mir-574-3p的含量；本发明提出的检测方法不依赖精密、昂贵的pcr仪器，并且普适于其它需要温度控制的生化反应。
附图说明
35.图1为包含电压线性放大器、arduino电路板的近红外激光器的实物图；
36.图2为本发明合成的光热复合材料，左图为fe3o4@mxene，右图为fe3o4@mxene@sio2；
37.图3为本发明提供的微滴群的制备图；
38.图4为本发明制备的可相变和光响应性乳化微滴阵列，以及冷却水洗后的微滴阵列；
39.图5为本发明制备的乳化微滴的扫描电镜图和掺杂有复合光热材料的细节放大图；
40.图6展示了乳化微滴升温速率与近红外光照功率和纳米材料浓度的函数关系；
41.图7为本发明提供的检测标记物所采用的pcr温度循环过程与对应的近红外光照程序；
42.图8为本发明所用的微流控微滴生成芯片和乳化微滴生成过程图；
43.图9为本发明制备的微滴群的荧光图；
44.其中，1为红外光激光器，2为电压线性放大器，3为arduino电路板，4为一号开关电源，5为二号开关电源，6为激光光纤探头。
具体实施方式
45.一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna 的检测方法，包括如下步骤：
46.s1、开发激光器可控输出模块：
47.如图1所示，激光器可控输出模块包括近红外光激光器1、电压线性放大器2、arduino 电路板3、arduino ide开源平台；所述近红外光激光器1具有i/o接口，近红外光激光器1 内部具有一号开关电源4和二号开关电源5，近红外光激光器1外部具有激光光纤探头6；所述近红外光激光器1通过i/o接口与电压线性放大器2、arduino电路板3相接通；所述arduino 电路板3的高电平引脚和接地引脚分别与电压线性放大器2控制端的输入电压正负极vin+和 vin-相连；arduino电路板3的供电和程序烧录通过usb接口与电脑交互；所述电压线性放大器2由一号开关电源4供电，电压线性放大器2的输出电压正极与近红外光激光器1的“外控模式功率调节”端口相连；
48.本实施例中，电压线性放大器2可以选用最终放大空间在0-10w、0-20w、0-30w、0-50w、 0-100w中的一种；一号开关电源4和二号开关电源5均选用参数为12v-1a、24v-1a、36v-1a、 12v-2a、36v-2a中的一种。
49.s2、制备可相变光热响应性微球：
50.如图2所示，将高效光热纳米材料mxene与纳米颗粒fe3o4通过多巴胺粘合在一起，然后通过改进的反应在外部包裹sio2外涂层，形成光热复合材料；将光热复合材料混入琼脂糖水凝胶，形成复合水凝胶；如图3-4所示，最后通过flow-focusing结构的微流控通道乳化微滴，将复合水凝胶乳化成微滴群(图8)；微流控通道交汇处水相通道宽度为30μm，油相通道宽度为30μm，水相通道和油相通道的深度均为60μm；乳化微滴的油相流量-水相流量为80-70μl/min；如图5所示，微滴群中乳化微滴的尺寸范围是80～300μm；微滴群中乳化微滴的数量大于10000个；如图6所示，利用正交测试，定量考量微滴群的升温速率受激光照射功率和纳米材料含量的影响；所述复合水凝胶还包含茎环形式逆转录引物、特异性pcr 引物以及taqman特异性荧光探针；
51.本实施例中，纳米颗粒的粒径为150～800nm，纳米颗粒还可以替换为sio2；光热纳米材料可以替换为氧化石墨烯、mos2或黑鳞；温敏性水凝胶可以替换为在55-95℃温度范围内为溶胶态，温度小于55℃时为凝胶态的小分子明胶；微流控通道交汇处水相通道宽度为50μm、 75μm、100μm中的一种；交汇处油相通道宽度为50μm、75μm、100μm中的一种；乳化微滴的油相流量-水相流量可以替换为100-70μl/min、150-80μl/min、200-100μl/min、 300-120μl/min中的一种。
52.s3、光推动的可相变微滴数字pcr检测前列腺癌外泌体microrna标记物：
53.在arduino ide开源平台编译程序以优化光照程序，并烧录进arduino电路板3；如图7 所示，荧光探针pcr温度循环对应的光照程序如下：单次反应过程为先95℃恒温30秒，
再 55℃恒温60秒，最后69℃恒温60秒，总计循环30～40次，pcr退火温度为55℃；逆转录反应对应的光照程序如下：单次反应过程为先25℃恒温5分钟，再50℃恒温15分钟，最后 85℃恒温5分钟；将微滴群置于激光光纤探头6下方，同时实现逆转录反应和荧光探针的pcr 过程；如图9所示，最后通过荧光拍照统计微滴群中发光微滴的比例，定量获得microrna 标记物mir-375-3p和mir-574-3p的含量。
54.待检测的标记物mir-375-3p、茎环形式逆转录引物、特异性pcr引物的序列依次为：
55.uuuguucguucggcucgcguga；
56.gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcacgc；
57.f：ctcgcgtgagtcgtat；r：gtcgtatccagtgcag；
58.待检测的标记物mir-574-3p、茎环形式逆转录引物、特异性pcr引物的序列依次为
59.cacgcucaugcacacacccaca；
60.gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactgtggg；
61.f：acacccacagtcgtat；r：gtcgtatccagtgcag；
62.taqman特异性荧光探针为fam、hex、rox基团中的一种；
63.taqman的序列为cagtgcgaatacctcggacc。
64.以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
技术特征：1.一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、开发激光器可控输出模块：激光器可控输出模块包括近红外光激光器(1)、电压线性放大器(2)、arduino电路板(3)、arduino ide开源平台；所述近红外光激光器(1)具有i/o接口，近红外光激光器(1)内部具有一号开关电源(4)和二号开关电源(5)，近红外光激光器(1)外部具有激光光纤探头(6)；所述近红外光激光器(1)通过i/o接口与电压线性放大器(2)、arduino电路板(3)相接通；s2、制备可相变光热响应性微球：将高效光热纳米材料与纳米颗粒通过多巴胺粘合在一起，然后通过改进的反应在外部包裹sio2外涂层，形成光热复合材料；将光热复合材料混入温敏性水凝胶，形成复合水凝胶；最后通过微流控微滴形成芯片，将复合水凝胶乳化成微滴群；所述复合水凝胶还包含茎环形式逆转录引物、特异性pcr引物以及taqman特异性荧光探针；s3、光推动的可相变微滴数字pcr检测前列腺癌外泌体microrna标记物：利用正交测试，定量考量微滴群的升温速率受激光照射功率和纳米材料含量的影响，在arduino ide开源平台编译程序以优化光照程序，并烧录进arduino电路板(3)；将微滴群置于激光光纤探头(6)下方，同时实现逆转录反应和荧光探针的pcr过程；最后通过荧光拍照统计微滴群中发光微滴的比例，定量获得microrna标记物mir-375-3p和mir-574-3p的含量。2.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s1中，所述arduino电路板(3)的高电平引脚和接地引脚分别与电压线性放大器(2)控制端的输入电压正负极vin+和vin-相连；arduino电路板(3)的供电和程序烧录通过usb接口与电脑交互。3.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s1中，所述电压线性放大器(2)由一号开关电源(4)供电，电压线性放大器(2)的输出电压正极与近红外光激光器(1)的“外控模式功率调节”端口相连。4.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s1中，电压线性放大器(2)选用最终放大空间在0-10w、0-20w，0-30w、0-50w、0-100w中的一种；一号开关电源(4)和二号开关电源(5)均选用参数为12v-1a、24v-1a、36v-1a、12v-2a、36v-2a中的一种。5.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s2中，所述纳米颗粒为磁性fe3o4或sio2，其粒径为150～800nm。6.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，
步骤s2中，所述光热纳米材料为mxene、氧化石墨烯、mos2、黑鳞中的一种。7.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s2中，所述温敏性水凝胶为琼脂糖水凝胶或在55-95℃温度范围内为溶胶态，温度小于55℃时为凝胶态的小分子明胶。8.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s2中，采用flow-focusing结构的微流控通道乳化微滴，交汇处水相通道宽度为30μm、50μm、75μm、100μm中的一种；交汇处油相通道宽度为30μm、50μm、75μm、100μm中的一种；水相通道和油相通道的深度均为60μm。9.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s2中，乳化微滴的油相流量-水相流量包括但不限于80-70μl/min、100-70μl/min、150-80μl/min、200-100μl/min、300-120μl/min中的一种。10.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s2中，微滴群中乳化微滴的尺寸范围是80～300μm。11.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s2中，微滴群中乳化微滴的数量大于10000个。12.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s3中，荧光探针pcr温度循环对应的光照程序如下：单次反应过程为先95℃恒温30秒，再55℃恒温60秒，最后69℃恒温60秒，总计循环30～40次，pcr退火温度为55℃；该光照程序应用analogwrite函数赋值近红外光的功率强度，且二者为线性对应关系。13.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s3中，逆转录反应对应的光照程序如下：先25℃恒温5分钟，再50℃恒温15分钟，最后85℃恒温5分钟。14.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述待检测的标记物mir-375-3p的序列为uuuguucguucggcucgcguga，茎环形式逆转录引物的序列为gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcacgc，特异性pcr引物：f：ctcgcgtgagtcgtat；r：gtcgtatccagtgcag。15.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述待检测的标记物mir-574-3p的序列为cacgcucaugcacacacccaca，茎环形式逆转录引物的序列为gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactgtggg，特异性pcr引物：f：acacccacagtcgtat；r：gtcgtatccagtgcag。
16.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字pcr技术对前列腺癌外泌体microrna的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述taqman特异性荧光探针为fam、hex、rox基团中的一种，taqman的序列为cagtgcgaatacctcggacc。
技术总结本发明提供一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对前列腺癌外泌体microRNA的检测方法，包括如下步骤：S1、激光器可控输出模块包括近红外光激光器、电压线性放大器、Arduino电路板、Arduino IDE开源平台；近红外光激光器具有I/O接口，近红外光激光器内部具开关电源，外部具有激光光纤探头；S2、制备光热纳米材料、纳米颗粒和SiO2的光热复合材料；将光热复合材料混入温敏性水凝胶，最后通过微流控微滴形成芯片；所复合水凝胶还包含茎环形式逆转录引物、特异性PCR引物以及taqman特异性荧光探针；S3、将微滴群置于激光光纤探头下方，同时实现逆转录反应和荧光探针的PCR过程；通过荧光拍照统计微滴群中发光微滴的比例，获得microRNA标记物miR-375-3p和miR-574-3p的含量。3p的含量。3p的含量。
技术研发人员：赵远锦 张乐翔 叶方富 商珞然 余筠如
受保护的技术使用者：国科温州研究院（温州生物材料与工程研究所）
技术研发日：2022.05.10
技术公布日：2022/7/5
