一种基于神经肽y5受体npy5r基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种基于神经肽y5受体npy5r基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用。
背景技术：2.饲料效率性状是畜禽生产中的重要经济性状之一，其中饲料转化率(fcr)和剩余采食量(rfi)是评估饲料效率指标之一。饲料转化效率(fcr)是指饲喂单位饲料获得多少产品(liang s,guo z,tang j,et al.genomic divergence during artificial selection by feed conversion ratio in pekin ducks[j].anim biotechnol,2021:1-9)，随着对饲料效率的深入探索研究者将畜禽某一时间段实际采食的饲料量减去其维持生长所需的饲料量所得的差值定义为剩余采食量(rfi)(koch r m,swiger l a,chambersd,et al.efficiency of feed use in beef cattle[j].journal of animal science,1963,2 2(2):486-494.)。可以使用rfi和fcr对家禽饲料效率的利用情况进行评估，然而影响饲料效率的因素众多，其中包括采食量以及遗传因素(潘韵致《猪饲料效率分化选择与全基因组关联分析》[d].吉林大学，2016；张小雪《不同剩余采食量羔羊生产性能和瘤胃微生物区系及肝脏转录组研究》[d].兰州大学，2019.)。
[0003]
研究发现神经肽y其5型受体np5yr介导动物采食行为同时还和能量代谢相关，属于g蛋白偶联受体超家族成员之一(michel m c,beck-sickinger a,cox h,et al. xvi.international union of pharmacology recommendations for the nomenclature of n europeptide y,peptide yy,and pancreatic polypeptide receptors[j].pharmacol rev,19 98,50(1):143-150.)。tang-christensen等采用与npy5r反义的寡核苷酸(odn) 来研究npy5r与npy对食物摄入影响，通过反复中央给药，发现odn显著减少自发食物摄入，导致体重显著下降(tang-christensen m,kristensen p,stidsen c e,et al. central administration of y5 receptor antisense decreases spontaneous food intake andattenuates feeding in response to exogenous neuropeptide y[j].j endocrinol,1998,15 9(2):307-12.)。通过在对不同剩余采食量(rfi)个体的鸭研究，科研人员在高rfi个体的下丘脑中检测到npy和npy5r的mrna表达量较高(zeng t,chen l,du x, et al.association analysis between feed efficiency studies and expression of hypothalamic neuropeptide genes in laying ducks[j].anim genet,2016,47(5):606-609.)。由此我们推定npy5r参与鸭饲料效率的调节，这为研究鸭饲料效率提供了关于该基因多态性与家禽饲料效率性状相关的一种猜想。
[0004]
此外，中国专利文献cn111676295a公开了一种采食量调控相关基因的研究方法，并具体公开了根据ncbi genbank中已知鸭的cck、cckar、npy以及npy5r基因设计多态性检测引物，用于基于上述基因开发与鸭采食量相关的snps位点，结果发现 cckar基因具有与鸭采食量相关的snps位点，对cck、npy以及npy5r基因的s nps位点未见报道。目前，也没有
其它文献有关于npy5r与鸭采食量相关的snps位点被开发。
[0005]
本研究为提高鸭饲料效率，从根本上较少成本的支出，增加养鸭业的收入，早期研究人员常使用常规选育但效率并不高，随着技术发展，分子标记辅助选育映入眼帘，其可以从遗传上根本改良性状，从而加速遗传进展。基于上述内容，提出一种基于神经肽 y5受体npy5r基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用。
技术实现要素：[0006]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于神经肽y5受体npy5r 基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用，针对与鸭的饲料利用率性状相关的候选基因的snp(单核苷酸多态性)分子标记，以解决常规表型育种选育进展缓慢，实现早期鉴定饲料利用率性状这一难题。
[0007]
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
[0008]
本发明提供了一种基于神经肽y5受体npy5r基因鸭饲料利用率性状的分子标记，所述npy5r基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为t或c，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第782位。
[0009]
本发明还提供了一种上述基于神经肽y5受体npy5r基因鸭饲料利用率性状的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。
[0010]
本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，包括以下步骤：
[0011]
(1)提取鸭翅静脉血液总dna；
[0012]
(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；
[0013]
(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测鸭的分子标记类型；
[0014]
(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状性状。
[0015]
进一步改进在于，所述分子标记所在位点的上下游扩增产物长度介于200～250bp 之间。
[0016]
进一步改进在于，所述特异性扩增引物序列为：
[0017]
seq id no.2:forward primer：attcttcttt gagttaggca；
[0018]
seq id no.3:reverse primer：gcagacagac agggtccgag。
[0019]
进一步改进在于，所述基因分型检测方法为将pcr扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染获得图像，根据图像进行基因分型：
[0020]
(1)包含2条条带间距较近的条带，则为cc型；
[0021]
(2)包含2条条带间距较远的条带，则为tt型；
[0022]
(3)包含4条条带，则为tc型。
[0023]
进一步改进在于，所述步骤(4)中根据分子标记类型判断肉鸭饲料利用率性状的具体步骤为：
[0024]
(1)若待测鸭分子标记类型为cc型，该鸭饲料利用率性状极高；
[0025]
(2)若待测鸭分子标记类型为tt型，该鸭饲料利用率性状较差；
[0026]
(3)若待测鸭分子标记类型为tc型，该鸭饲料利用率性状中等。
[0027]
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种基于神经肽y5受体npy5r基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用，利用pcr-sscp的方法来检测npy5r 基因的突变，根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择，建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法，该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器，适合实验的需要。
附图说明
[0028]
图1为部分样品dna的琼脂糖凝胶电泳图；
[0029]
图2为部分样品pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]
图3为部分样品pcr扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0031]
图4为鸭npy5r基因组第782位不同基因型个体的测序图。
具体实施方式
[0032]
下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
[0033]
1、材料
[0034]
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0035]
2、方法
[0036]
2.1获得鸭npy5r基因多态位点
[0037]
2.1.1基因组dna提取与检测
[0038]
选取白羽肉鸭388只，翅静脉采血，利用大连宝生物公司生产的血液dna提取试剂盒提取鸭翅静脉血样中总dna，具体参照试剂盒使用说明书进行。
[0039]
用nanodrop2000测量dna浓度及od值。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测dna，结果如图1所示，提取的基因组dna质量较好，主带单一、清晰。
[0040]
2.1.2引物设计
[0041]
从鸭基因组数据库中找到seq id no.1所示的基因npy5r对应的dna序列，以 seq id no.1所示基因npy5r的部分dna序列为模板，在引物设计的过程中注意尽量将snp位点设于中间位置，避免发夹结构、引物二聚体和错配等情况的发生，使引物序列最优化，引物序列如下所示：
[0042]
seq id no.2:forward primer：attcttcttt gagttaggca；
[0043]
seq id no.3:reverse primer：gcagacagac agggtccgag。
[0044]
该引物的扩增片段长度为237bp，序列如seq id no.4所示，其中包含t/c突变的分子标记位点。
[0045]
2.1.3 pcr扩增
[0046]
利用上海生工生物工程有限公司生产的mix，通过已合成的测序特异性引物对npy5r基因的目的片段，进行pcr扩增反应，pcr扩增体系为：
[0047][0048][0049]
pcr扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，共34个循环；然后72℃延伸10min；最后4℃保存。
[0050]
2.1.4 pcr扩增产物检测
[0051]
利用1％质量比的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，在凝胶成像仪成像后获得一条长度介于200～250bp的条带，与预测的长度一致，说明获得了目的片段。将pcr产物送到上海生工生物工程测序，序列如seq id no.4所示，与预测结果一致。
[0052]
2.1.5 pcr产物变性及sscp检测
[0053]
对pcr扩增后的产物首先变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶检测，最终根据不同的带型结果判定其突变，具体步骤如下：
[0054]
(1)根据说明配置非变性聚丙烯酰胺胶体，非变性丙烯酰胺凝胶体系如下：
[0055][0056]
(2)temed最后加入，加入后立即倒入模具中(浇灌前要确保模具封闭，防止灌胶时漏胶，以及胶条和孔梳的尺寸要一致)，倾斜约45
°
角，胶液从垂直板中间(可有效避免气泡产生)缓慢倒入，当浇灌至约离模具上沿时停止灌胶，插入事先准备好的梳子，室温聚合40分钟，多余的丙烯酰胺4℃保存，随时观察玻璃板凝胶聚合情况，并且补加适量非变性丙烯酰胺凝胶体系混合液。
[0057]
(3)在凝胶聚合等待过程时准备电泳卡槽，等聚合完成后安装好玻璃板向电泳卡槽中加入1
×
tbe，致tbe溶液超过加样孔约3cm，并赶走其中气泡。
[0058]
(4)取3μl的pcr扩增产物置于pcr管中，加入7μl变性试剂，短暂离心混匀， 98℃变性10min，迅速取出放入-20℃冰盒10min，用10μl移液管点样。
[0059]
(5)打开电源，先220伏电泳10min，然后将电压调制120伏，电泳21h。
[0060]
(6)电泳结束后关上电泳仪，拿出玻璃板，小心取出凝胶，放入盛有清水的白瓷盘中清洗1-2次。
[0061]
(7)将凝胶放入染色液中避光轻摇15min。染色液：由硝酸银和纯水组成，硝酸银浓度为0.2％。
[0062]
(8)染色结束，回收agno3,去离子水清洗1-3遍，每次2min，洗去多余的染色液。
[0063]
(9)显色液显色，使条带清晰，背景淡黄，染色时间使得条带清晰可见为止，显色后立即倒掉显色液。显色液：500ml，其中2％naoh+0.04％na2co3+420μl甲醛。
[0064]
(10)拍照，保存。
[0065]
2.1.6基因分型
[0066]
pcr-sscp图片如图2所示。不同的带型表示不同的基因型，从图2中可以看出 npy5r基因第782位存在三种基因型，即tt、tc、cc，其中cc基因型为2条间距较近的条带，tt基因型有2条间距较远的条带，tc基因型有4条带。
[0067]
2.1.7 dna验证测序
[0068]
将显色的基因分型胶图进行统计，获得tt、tc、cc三种分型，对这三种分型分别挑选一个个体进行测序比对，测序比对图如图3所示；测序结果中t突变成c，箭头标出了突变位置，与pcr-sscp结果一致。
[0069]
2.2 npy5r基因t782c突变位点与鸭饲料利用率性状的关联分析
[0070]
2.2.1基因分型
[0071]
为确定npy5r基因782位的t/c多态性与鸭重要性状关联性，以388只白羽肉鸭为试验材料，从出雏时记录，戴翅号，正常饲养。统计388只白羽肉鸭21～42日龄对应的rfi(剩余采食量)、fi(个体日采食量)、adg(日增重)、fcr(料重比)、mbw (代谢体增重)。采用2.1.6的基因分型方法，对388只鸭，进行基因分型，结果如表1。
[0072]
表1不同表型个体基因型检测结果
[0073][0074]
卡方检验结果显示，实验鸭群体基因型处于hardy-weinberg平衡。
[0075]
2.2.2统计分析
[0076]
通过胶图统计tt、tc、cc基因型个数，采用spss20.0中one-wayanova分析三种基因型与屠宰性能之间的差异，不同基因型与各性状间的关联分析结果见如表2所示：
[0077]
表2鸭npy5r基因型与鸭饲料利用率性状关联分析
[0078]
[0079]
注：同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，无字母表示差异不显著(p＞0.05)。
[0080]
从表中可以看出，通过不同基因型个体饲料效率性状比较得出，在rfi(剩余采食量)方面cc个体显著低于tt个体(p＜0.05)；而在fi、bw42、bwg和fcr上三种基因型无显著差异。由于rfi是一个负向选择性状，得出结论，cc基因型个体饲料转化性状极高，tc基因型个体饲料转化性状中等，tt基因型个体饲料转化性状较差。
[0081]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
技术特征：1.一种基于神经肽y5受体npy5r基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记，其特征在于，所述npy5r基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为t或c，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第782位。2.一种如权利要求1所述的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。3.一种利用如权利要求1所述的分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取鸭翅静脉血液总dna；(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测鸭的分子标记类型；(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状。4.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述分子标记所在位点的上下游扩增产物长度介于200～250bp之间。5.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物序列为：seq id no.2:forward primer：attcttcttt gagttaggca；seq id no.3:reverse primer：gcagacagac agggtccgag。6.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述基因分型检测方法为将pcr扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染获得图像，根据图像进行基因分型：(1)包含2条间距较近的条带，则为cc型；(2)包含2条间距较远的条带，则为tt型；(3)包含4条条带，则为tc型。7.根据权利要求6所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述步骤(4)中根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状的具体步骤为：(1)若待测鸭分子标记类型为cc型，该鸭饲料利用率性状极高；(2)若待测鸭分子标记类型为tt型，该鸭饲料利用率性状较差；(3)若待测鸭分子标记类型为tc型，该鸭饲料利用率性状中等。
技术总结本发明公开了一种基于神经肽Y5受体NPY5R基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用，所述NPY5R基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为T或C，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第782位。本发明利用PCR-SSCP的方法来检测NPY5R基因的突变，根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择，建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法，该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器，适合实验的需要。合实验的需要。合实验的需要。
技术研发人员：金四华 江洪峰 耿照玉 夏晶晶 贾羽晴 税斐 张泰康 曹程程 丁元飞 姜丽君
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2022.05.09
技术公布日：2022/7/5
