1.本发明涉及一种鉴别方法，具体是烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别。
背景技术：2.咖啡作为饮料有着悠久的历史，适当饮用咖啡能起到消除疲劳、振奋精神、促进血液循环、提高劳动效率和思维活动能力等多种有益的功效。咖啡和茶叶、可可并称为世界三大饮料，在国际贸易中是仅次于石油的原料产品。咖啡已成为当今人们饮食生活中的重要组成部分。咖啡还有其独特的医学疗效，具有降血压、抗氧化、抗肿瘤等作用。
3.由于干旱和农作物疾病的影响，巴西等咖啡主要产地的咖啡产量近年来显著下降，咖啡豆的短缺问题越来越突出。据国外权威媒体披露，在供不应求的情况下，不少不法商贩往咖啡中掺入莓果粉、黑玉米、大麦等物质。尽管这些成分不会造成身体伤害，但它们会影响产品的质量和口感，损害消费者利益。还有一类现象就是，虽然没有非法添加物质，但假冒品牌产品以次充好，损害品牌形象，对公平竞争的市场环境造成严重损害。
技术实现要素：4.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，可以分析各种咖啡碳水化合物组成，特别是糖的类型和构成比例，利用糖作为标记物鉴定是否掺杂了莓果粉、黑玉米、大麦等物质，可以对进口咖啡的质量把关，打击伪劣产品，净化市场竞争秩序，维护消费者权益，具有重要的现实意义。
5.为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，按照如下步骤进行检测：
6.步骤1)选取适量的烘焙咖啡豆(市售)，莓果粉(市售)，黑玉米(市售)，大麦(市售)；
7.步骤2)烘焙咖啡豆样品(编号为k)粉碎，过20目筛，反复混匀；莓果粉在105℃干燥4h；黑玉米和大麦在250℃下烘焙30min，粉碎，过20目筛，分别反复混匀，模拟掺假样品的制备：分别取一定量的莓果粉、黑玉米和大麦(编号为m,y,d),按占比5％、10％、20％、30％、50％比例加入咖啡中(咖啡与莓果粉掺假物编号分别为m1、m2、m3、m4、m5,咖啡与黑玉米掺假物编号分别为y1、 y2、y3、y4、y5,咖啡与大麦掺假物编号分别为d1、d2、d3、d4、d5)，混合均匀，制成各种比例掺假物与咖啡的模拟掺假样品，每个浓度制备6个平行；
8.步骤3)建立咖啡及其掺假物中7种糖含量的离子色谱-脉冲安培检测法；
9.步骤4)分别称取咖啡豆粉末、莓果粉、黑玉米粉末、大麦粉末及各种比例掺假物与咖啡的混合样品试样0.3g于具塞三角瓶中，加入1mol/l盐酸溶液50 ml，于85℃水浴180min，每隔30min振摇一次，取出后冷却，用氢氧化钠溶液调节至中性；
10.步骤5)溶液转移至100ml容量瓶中，用水定容，用滤纸过滤，咖啡豆样品及各种比率咖啡与掺假物的混合样品取滤液稀释25倍，莓果粉，黑玉米，大麦样品取滤液稀释50倍，
取稀释液过0.45μm水相尼龙滤膜，上机检测，测定各样品中各种糖类标记物含量；
11.步骤6)建立咖啡鉴假模型：对咖啡及掺假物7种糖含量的数据采用spss 统计软件进行计算，建立咖啡鉴假模型；
12.步骤7)利用建立咖啡鉴假模型即可识别咖啡掺假。
13.步骤5中所述咖啡及其掺假物中7种糖含量的测定是利用离子色谱仪，配置脉冲安培检测器，选用carbopac pa1色谱柱分离，氢氧化钠和乙酸钠淋洗液洗脱。
14.烘焙咖啡豆样品粉碎，过20目筛，反复混匀；莓果粉在105℃干燥4h；黑玉米和大麦在250℃下烘焙30min,粉碎，过20目筛，反复混匀。
15.称取试样0.3g于具塞三角瓶中，加入1mol/l盐酸溶液50ml，于85℃水浴 180min，每隔30min摇一次，取出后冷却，用氢氧化钠溶液调节至中性。溶液转移至100ml容量瓶中，用水定容。用滤纸过滤，咖啡豆样品及各种比率咖啡与掺假物的混合样品取滤液稀释25倍,莓果粉，黑玉米，大麦样品取滤液稀释50 倍，取稀释液过0.45μm水相尼龙滤膜，上机检测，每个平行测定6次。
16.所述的步骤5是通过离子色谱仪-脉冲安培检测器进行光谱采集，采用外标法进行处理计算。
17.步骤5之后，还需进行样品数据集划分：收集的咖啡样品中，部分用作建立校正模型的集样品，部分作为验证集样品，部分作为掺假底物样品，部分作为空白待测样品。
18.步骤5中第一建立纯咖啡光谱数据库，作为“咖啡分类模型”；第二建立掺假物巴西莓果粉、黑玉米、大麦光谱库，作为“掺假物分类模型”。
19.步骤9中咖啡掺假的鉴别结果分析方法：经离子色谱仪-脉冲安培检测器采集的待测样品光谱图，外标法计算各种糖含量，第一基于“咖啡分类模型”，将待测样品糖含量与“咖啡分类模型”的咖啡糖含量进行比较，判断是否为咖啡；第二基于“掺假物分类模型”，将待测样品中各种糖含量与“掺假物分类模型”进行比较，说明该咖啡样品存在掺假物成分。
20.以置信度指标p值来判断掺假成分存在的可能性大小；当p《0.05时，即为最低检出限。
21.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：可以分析各种咖啡碳水化合物组成，特别是糖的类型和构成比例，利用糖作为标记物鉴定是否掺杂了莓果粉、黑玉米、大麦等物质，可以对进口咖啡的质量把关，打击伪劣产品，净化市场竞争秩序，维护消费者权益，具有重要的现实意义。
附图说明
22.图1七种糖(包括：1.甘露醇，2.阿拉伯糖，3.半乳糖，4.葡萄糖，5. 木糖，6.甘露糖，7.果糖)标准色谱图
23.图2咖啡样品色谱图
24.图3巴西莓果粉样品色谱图
25.图4黑玉米样品色谱图
26.图5大麦样品色谱图
27.图6咖啡样品叠加色谱图
28.图7咖啡样品与模拟掺假样品(50％咖啡+50％莓果粉)色谱叠加图
29.图8咖啡样品与模拟掺假样品(50％咖啡+50％黑玉米)色谱叠加图
30.图9咖啡样品与模拟掺假样品(50％咖啡+50％大麦)色谱叠加图
31.图10各种糖类标记物对主成分的贡献
32.图11各个样品两个主成分得分分布图
具体实施方式
33.下面对本发明做进一步说明。
34.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
35.本烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，按照如下步骤进行检测：
36.步骤1)选取适量的烘焙咖啡豆(市售)，莓果粉(市售)，黑玉米(市售)，大麦(市售)；
37.步骤2)烘焙咖啡豆样品(编号为k)粉碎，过20目筛，反复混匀；莓果粉在105℃干燥4h；黑玉米和大麦在250℃下烘焙30min，粉碎，过20目筛，反复混匀。模拟掺假样品的制备：分别取一定量的莓果粉、黑玉米和大麦(编号为 m,y,d)，按占比5％、10％、20％、30％、50％比例加入咖啡中(咖啡与莓果粉掺假物编号分别为m1、m2、m3、m4、m5,咖啡与黑玉米掺假物编号分别为y1、y2、 y3、y4、y5,咖啡与大麦掺假物编号分别为d1、d2、d3、d4、d5)，混合均匀，制成各种比例掺假物与咖啡的模拟掺假样品，每个浓度制备6个平行；
38.步骤3)建立咖啡及其掺假物中7种糖含量的离子色谱-脉冲安培检测法；
39.需要说明的是：分析柱：dionexcarbopacpa1(4
×
250mm)，保护柱： dionexcarbopacpa1(4
×
50mm)；淋洗液氢氧化钠浓度(300mmol/l)：量取50％～ 52％氢氧化钠溶液15.6ml，用水稀释至1l，淋洗液乙酸钠浓度(1.0mol/l): 称取无水乙酸钠82g，用水溶解并稀释至1l，淋洗程序见表1；淋洗液流速： 1.0ml/min；进样体积：25μl；色谱池温度：35℃，柱温：30℃。
40.步骤4)分别称取咖啡豆粉末、莓果粉、黑玉米粉末、大麦粉末及各种比例掺假物与咖啡的混合样品试样0.3g于具塞三角瓶中，加入1mol/l盐酸溶液50 ml，于85℃水浴180min，每隔30min振摇一次，取出后冷却，用氢氧化钠溶液调节至中性。
41.步骤5)溶液转移至100ml容量瓶中，用水定容。用滤纸过滤，咖啡豆样品及各种比率咖啡与掺假物的混合样品取滤液稀释25倍，莓果粉，黑玉米，大麦样品取滤液稀释50倍，取稀释液过0.45μm水相尼龙滤膜，上机检测，测定各样品中各种糖类标记物含量；
42.需要说明的是：应用2.5的检测方法对进行7种糖含量的测定(6个平行)，结果以均数
±
标准差表示，咖啡样品主要含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖5种糖,不含甘露醇和果糖，其中阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖含量较高, 葡萄糖和木糖含量很低(见表2和图2、图6)。莓果粉仅含有葡萄糖,不含其他6种糖，且葡萄糖含量高达41.57％(见表2和图3)；黑玉米含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖，不含甘露醇和甘露糖,其中葡萄糖含量高达 39.26％，而黑玉米中阿拉伯糖和半乳糖含量明显低于咖啡(见表2和图4)；大麦
与咖啡一样含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖，但其阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖含量明显低于咖啡(见表2和图5)。由此可见，阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和果糖这5种糖含量在鉴别咖啡是否掺假中具有重要作用。应用2.5的检测方法对不同浓度模拟掺假样品中7种糖含量进行测定(每个浓度 6个平行)。结果见表2。咖啡与不同的掺假物以不同比例混合后，各种糖类含量都存在一定的差异.
43.步骤6)建立咖啡鉴假模型：对咖啡及掺假物7种糖含量的数据采用spss 统计软件进行计算，建立咖啡鉴假模型；
44.步骤7)利用建立咖啡鉴假模型即可识别咖啡掺假。
45.步骤5中所述咖啡及其掺假物中7种糖含量的测定是利用离子色谱仪，配置脉冲安培检测器，选用carbopac pa1色谱柱分离，氢氧化钠和乙酸钠淋洗液洗脱。
46.烘焙咖啡豆样品粉碎，过20目筛，反复混匀；莓果粉在105℃干燥4h；黑玉米和大麦在250℃下烘焙30min,粉碎，过20目筛，分别反复混匀。
47.称取试样0.3g于具塞三角瓶中，加入1mol/l盐酸溶液50ml，于85℃水浴180min，每隔30min摇一次，取出后冷却，用氢氧化钠溶液调节至中性。溶液转移至100ml容量瓶中，用水定容。用滤纸过滤，咖啡豆样品取滤液稀释25倍，莓果粉，黑玉米，大麦样品取滤液稀释50倍，取稀释液过0.45μm水相尼龙滤膜，上机检测，每个平行测定6次。
48.需要说明的是：主成分分析是利用降维的思想，在损失很少信息的前提下，把多个指标转化为几个综合指标的多元统计方法。主成分能反映绝大部分原始变量信息，每个主成分都是原始变量的线性组合，且各主成分之间互不相关，因而主成分比原始变量具有某些更优越的性能。利于揭示事物内部变量之间的规律，提高分析效率。以主成分得分作散点图，可直观的反应样品的大量信息和特征 [9-]。
[0049]
应用软件spss对表2的咖啡及模拟掺假样品糖类含量数据矩阵进行主成分分析，得到表3和表4的分析结果.表3为前两个主成分对应的方差贡献率及各原始变量在主成分中的负荷。主成分1(pc1)占总方差贡献率的72.547％，主成分2(pc2)占总方差贡献率的17.508％，两个主成分的累计方差贡献率达到 90.055％，已包含了绝大部分样本信息。因此，可用前两个主成分表示原始变量反映的信息。阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖对主成分1起主要作用，而木糖和果糖对主成分2贡献大。图10可直观的观察到各种糖类标记物对主成分的贡献。
[0050]
由表4的主成分组合系数矩阵可得到两个主成分的得分函数：
[0051]
pc1＝0.213x1+0.228x2-0.227x3-0.597x4+0.228x5-0.099x6
[0052]
pc2＝0.355x1+0.126x2-0.089x3+0.476x4+0.089x5+0.755x6
[0053]
根据得分函数可计算各样品的主成分得分，各个样品两个主成分得分的分布见图11，如图11所示，15个掺假样品分为3个组，分别为咖啡掺莓果粉、咖啡掺黑玉米和咖啡掺大麦。咖啡掺黑玉米出现非常明显的聚类现象。咖啡掺莓果粉、咖啡掺大麦区分度不如前者明显。
[0054]
所述的步骤5是通过离子色谱仪-脉冲安培检测器进行光谱采集，采用外标法进行处理计算。
[0055]
步骤5之后，还需进行样品数据集划分：收集的咖啡样品中，部分用作建立校正模型的集样品，部分作为验证集样品，部分作为掺假底物样品，部分作为空白待测样品。
[0056]
步骤5中第一建立纯咖啡光谱数据库，作为“咖啡分类模型”；第二建立掺假物巴西莓果粉、黑玉米、大麦光谱库，作为“掺假物分类模型”。
[0057]
步骤9中咖啡掺假的鉴别结果分析方法：经离子色谱仪-脉冲安培检测器采集的待测样品光谱图，外标法计算各种糖含量，第一基于“咖啡分类模型”，将待测样品糖含量与“咖啡分类模型”的咖啡糖含量进行比较，判断是否为咖啡；第二基于“掺假物分类模型”，将待测样品中各种糖含量与“掺假物分类模型”进行比较，说明该咖啡样品存在掺假物成分。
[0058]
以置信度指标p值来判断掺假成分存在的可能性大小；当p《0.05时，即为最低检出限。
[0059]
有益效果：可以分析各种咖啡碳水化合物组成，特别是糖的类型和构成比例，利用糖作为标记物鉴定是否掺杂了莓果粉、黑玉米、大麦等物质，可以对进口咖啡的质量把关，打击伪劣产品，净化市场竞争秩序，维护消费者权益，具有重要的现实意义。
[0060]
表1淋洗程序
[0061][0062]
表2咖啡与掺假物及模拟掺假样品中各种糖含量结果(n＝6)
[0063][0064]
nd表示未检出
[0065]
表3各变量在主成分中的负荷及方差贡献
[0066][0067]
表4主成分组合系数矩阵
[0068][0069]
表5非标准化典型判别式函数系数矩阵
[0070][0071]
表6模拟掺假样品分类结果
[0072][0073]
1代表咖啡掺莓果粉，2代表咖啡掺玉米，3代表咖啡掺大麦。
技术特征：1.烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，按照如下步骤进行检测：步骤1)选取适量的烘焙咖啡豆(市售)，莓果粉(市售)，黑玉米(市售)，大麦(市售)；步骤2)烘焙咖啡豆样品(编号为k)粉碎，过20目筛，反复混匀；莓果粉在105℃干燥4h；黑玉米和大麦在250℃下烘焙30min，粉碎，过20目筛，分别反复混匀，模拟掺假样品的制备：分别取一定量的莓果粉、黑玉米和大麦(编号为m,y,d),按占比5％、10％、20％、30％、50％比例加入咖啡中(咖啡与莓果粉掺假物编号分别为m1、m2、m3、m4、m5,咖啡与黑玉米掺假物编号分别为y1、y2、y3、y4、y5,咖啡与大麦掺假物编号分别为d1、d2、d3、d4、d5)，混合均匀，制成各种比例掺假物与咖啡的模拟掺假样品，每个浓度制备6个平行；步骤3)建立咖啡及其掺假物中7种糖含量的离子色谱-脉冲安培检测法；步骤4)分别称取咖啡豆粉末、莓果粉、黑玉米粉末、大麦粉末及各种比例掺假物与咖啡的混合样品试样0.3g于具塞三角瓶中，加入1mol/l盐酸溶液50ml，于85℃水浴180min，每隔30min振摇一次，取出后冷却，用氢氧化钠溶液调节至中性；步骤5)溶液转移至100ml容量瓶中，用水定容，用滤纸过滤，咖啡豆样品及各种比率咖啡与掺假物的混合样品取滤液稀释25倍，莓果粉，黑玉米，大麦样品取滤液稀释50倍，取稀释液过0.45μm水相尼龙滤膜，上机检测，测定各样品中各种糖类标记物含量；步骤6)建立咖啡鉴假模型：对咖啡及掺假物7种糖含量的数据采用spss统计软件进行计算，建立咖啡鉴假模型；步骤7)利用建立咖啡鉴假模型即可识别咖啡掺假。2.根据权利要求1所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，步骤5中所述咖啡及其掺假物中7种糖含量的测定是利用离子色谱仪，配置脉冲安培检测器，选用carbopac pa1色谱柱分离，氢氧化钠和乙酸钠淋洗液洗脱。3.根据权利要求2所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，烘焙咖啡豆样品粉碎，过20目筛，反复混匀；莓果粉在105℃干燥4h；黑玉米和大麦在250℃下烘焙30min,粉碎，过20目筛，反复混匀。4.根据权利要求1所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，称取试样0.3g于具塞三角瓶中，加入1mol/l盐酸溶液50ml，于85℃水浴180min，每隔30min摇一次，取出后冷却，用氢氧化钠溶液调节至中性。溶液转移至100ml容量瓶中，用水定容。用滤纸过滤，咖啡豆样品及各种比率咖啡与掺假物的混合样品取滤液稀释25倍,莓果粉，黑玉米，大麦样品取滤液稀释50倍，取稀释液过0.45μm水相尼龙滤膜，上机检测，每个平行测定6次。5.根据权利要求2所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，所述的步骤5是通过离子色谱仪-脉冲安培检测器进行光谱采集，采用外标法进行处理计算。6.根据权利要求2所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，步骤5之后，还需进行样品数据集划分：收集的咖啡样品中，部分用作建立校正模型的集样品，部分作为验证集样品，部分作为掺假底物样品，部分作为空白待测样品。7.根据权利要求2所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，步骤5中第一建立纯咖啡光谱数据库，作为“咖啡分类模型”；第二建立掺假物巴西莓果粉、
黑玉米、大麦光谱库，作为“掺假物分类模型”。8.根据权利要求2所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，步骤9中咖啡掺假的鉴别结果分析方法：经离子色谱仪-脉冲安培检测器采集的待测样品光谱图，外标法计算各种糖含量，第一基于“咖啡分类模型”，将待测样品糖含量与“咖啡分类模型”的咖啡糖含量进行比较，判断是否为咖啡；第二基于“掺假物分类模型”，将待测样品中各种糖含量与“掺假物分类模型”进行比较，说明该咖啡样品存在掺假物成分。9.根据权利要求2所述的烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，其特征在于，以置信度指标p值来判断掺假成分存在的可能性大小；当p<0.05时，即为最低检出限。
技术总结本发明涉及烘焙咖啡豆糖类标记物含量测定及其掺假鉴别，称取试样0.3g于具塞三角瓶中，加入1mol/L盐酸溶液50mL，于恒温水浴箱85℃水浴180min，每隔30min摇一次，水浴结束后取出并冷却，用30％氢氧化钠溶液调节至中性；溶液转移至100mL容量瓶中，用水定容。经滤纸过滤，咖啡豆样品及各种比率咖啡与掺假物的混合样品取滤液稀释25倍，莓果粉、黑玉米和大麦样品取滤液稀释50倍，取稀释液过0.45μm水相尼龙滤膜，上机检测；以外标法计算各样品中各种糖含量，结果以均数
技术研发人员：潘丙珍 奚星林 卢丽 陈秀明 梁瑞婷 刘朝霞
受保护的技术使用者：广州海关技术中心
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2022/7/5
