1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及epc1-/-epc2-/-突变体及其在构建环境易感斑马鱼模型中的应用，本发明所构建的epc1-/-epc2-/-环境易感突变体斑马鱼，可用于建立以生物体死亡为监测终点的水环境监测体系。
背景技术：2.epc1(enhancer of polycomb homolog 1)和epc2(enhancer of polycomb homolog 2)是从酵母到人高度保守的重要的染色质调控因子(doyon et al.,2004)。epc家族基因参与包括细胞分化和发育(prasad et al 2014,wang et al 2016,searle et al 2017)在内的多种生理过程。在酵母中，epl1(epc的酵母同源物)的缺失会导致细胞在g2/m的积累以及乙酰化组蛋白h4和h2a的整体缺失，epl1突变通过端粒位置效应抑制基因沉默(boud reault et al 2003)。在哺乳动物中，大多数有关epc家族基因的报道集中于其在骨骼肌分化方面的功能(kim et al 2009,kee et al 2012)。epc1是启动小鼠骨骼肌分化所必需的，可与hop蛋白(homeodomain only)、血清反应因子(serum response factor，srf)或ret指蛋白(ret finger protein，rfp)等互作以诱导相关基因的表达(kee et al 2007,kim et al 2009)。epc基因在肿瘤发生中也具有重要作用，epc1基因位于人染色体10p11，这是在各种人类肿瘤中经常基因组重排的区域，融合基因(诸如epc1-phf1、epc1-asxl2等)的形成可导致一系列肿瘤相关疾病的产生。epc1和epc2也是维持急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，aml)干细胞潜能所必需的。在斑马鱼中，有关epc1和epc2基因的研究很少，目前仅有的文献报道为哈佛大学zon实验室在2013年发表的针对425个表观调控因子的功能初步筛查结果显示，epc2基因敲降影响斑马鱼初始红细胞发育(huang et al.,2013)。
3.cox17(cytochrome c oxidase copper chaperone cox17)是细胞色素氧化酶的重要组成部分，与线粒体嵴的精密结构形成有关，还可作为线粒体内的重要铜转运蛋白将cu
+
转运到线粒体的细胞色素氧化酶，进而调控细胞色素氧化酶的铜金属化以及调节线粒体中铜的分布及含量。
4.在渔业水环境中，鱼类病害的产生与养殖环境中的致病菌感染密切相关，例如，嗜水气单胞菌可通过鱼体皮肤进入血液，然后通过血液循环进入肝脏、肾脏、脾脏等组织，侵染免疫系统，最终出现全身出血症状。另外，饮用水环境中的细菌污染也威胁着人类健康。水体中的溶解氧(dissolved oxygen，do)受到空气中氧的分压、水温、液面与空气中的氧气的接触面积、昼夜变化、耗氧沉积物、水流速度、盐度、水深深度、水生植物及藻类光合作用速率以及水生生物呼吸强度等因素的综合影响。并且，当大量的工业废水或生活污水进入水体也会造成水体严重脱氧，因此，溶解氧通常被作为环境监测和水体自净能力的主要指标。氧气对需氧生物的生存至关重要，水生需氧生物尤其是淡水鱼类，更易受到低氧胁迫。
5.在水环境监测中，生物监测技术的应用越来越广泛。生物监测是利用环境污染后，生态系统中各级生物的生理生化以及蛋白分子等指标发生相应变化为基础，综合反映环境的污染问题及其生态学影响效应等。相比传统单一的理化检测，生物监测能够通过个体展
epc2-/-双突变体斑马鱼幼鱼的致死率示意图；
16.其中a-c分别为106cfu/ml、107cfu/ml、108cfu/ml浓度的嗜水气单胞菌。
17.图3为不同浓度的嗜水气单胞菌侵染control(野生型)和cox17-/-突变体斑马鱼幼鱼的致死率示意图；
18.a、b分别为106cfu/ml和107cfu/ml的嗜水气单胞菌。
19.图4为2％低氧胁迫control(野生型)、epc1-/-、epc2-/-和epc1-/-epc2-/-双突变体斑马鱼幼鱼的存活率示意图；
20.a-c分别为2％低氧胁迫和21％常氧条件下72hpf野生型、epc1-/-、epc2-/-和epc1-/-epc2-/-突变体胚胎后12小时内幼鱼的存活率统计。
具体实施方式
21.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
22.实施例1：
23.获得epc1-/-epc2-/-突变体斑马鱼转基因鱼系的方法:
24.1.1实验材料
25.野生型斑马鱼(zebrafish，danio rerio)及突变体均饲养于华中农业大学水产学院鱼房，养殖条件为：28.5
±
0.5℃水温，光照和黑暗时间分别为14h和10h，每天投喂丰年虫2次。
26.1.2实验方法
27.斑马鱼epc1、epc2基因grna靶位点的选择和确认：
28.确定epc1grna靶位点为：5
’‑
ggtctggcagatcctcgcag-3’。
29.确定epc2grna靶位点为：5
’‑
gggcgtctagcgctcgcgcg-3’。
30.1.2.1利用crispr/cas9基因编辑技术分别构建epc1-/-和epc2-/-突变体
31.1.2.1.1体外合成grna
32.以pmd19-tgrna(chang et al.,2013)质粒为模板，以带有t7启动子和特异性靶位点序列的上游引物(epc1_grna-f 5'gtaatacgactcactataggtctggcagatcctcgcaggttttagagctagaaatagc 3')或(epc2_grna-f 5'gtaatacgactcactatagggcgtctagcgctcgcgcggttttagagctagaaatagc 3')与下游通用引物(grna-r 5
’‑
aaaagcaccgactcggtgcc-3’)进行pcr扩增。pcr体系为：
[0033][0034]
反应条件为：94℃预变性3min，30个循环(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s)，72℃再延伸5min。
[0035]
取1μl pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过pcr clean kit试剂盒纯化回收；
[0036]
使用thermo transcript aid t7 high yield transcription kit进行体外转录，转录体系如下：
[0037][0038]
混匀后离心，密封后置于37℃水浴锅中孵育2h；加入1μl dnase，37℃孵育15min，除去dna模板；加入1μl edta，60℃孵育10min，终止反应；加30μl depc水和30μl licl，混匀后于-80℃沉淀4h；4℃，14000g，离心10min；弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤，4℃，14000g，离心10min；重复上一步骤；弃上清后，室温下晾干，加入20μl无rna酶水溶解，取1μl用nanodrop 2000核酸定量仪测rna浓度和质量，稀释至80ng/μl，分装后置于-80℃备用，即为epc1_grna和epc2_grna。
[0039]
1.2.1.2 cas9 mrna的合成
[0040]
制备cas9 mrna：通过xbai单酶切线性化cas9质粒，取1μl酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳确认线性化完全后，使用pcr纯化试剂盒纯化回收线性化产物；
[0041]
使用ambion的maxiscript t7 kit体外转录合成cas9 mrna，转录体系如下：
[0042][0043]
以上体系混匀后离心，密封后置于37℃水浴锅中孵育2h；加入1μl dnase，37℃孵育15min，除去dna模板；加入1μl edta，60℃孵育10min，终止反应；加30μl depc水和30μl licl，混匀后于-80℃沉淀4h；4℃，14000g，10min；弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤，4℃，14000g，10min；重复上一步骤；弃上清后，室温下晾干，加入20μl无rna酶水溶解，取1μl用nanodrop 2000核酸定量仪测rna浓度和质量，稀释500ng/μl，分装后置于-80℃备用。
[0044]
1.2.1.3 f0靶点突变效率检测及可遗传筛选
[0045]
(1)将500ng/μl cas9和80ng/μl grna等体积混匀，通过显微注射到单细胞期斑马鱼胚胎中，每个靶点至少注射200颗胚胎，同时留一部分同批野生型胚胎作为注射胚胎的对照；
[0046]
(2)分别取20颗注射组和对照组胚胎，加入100μl naoh(50mm)裂解液，于95℃裂解20min后，加入10μl tris-hcl(ph 8.0 50mm)平衡，作为pcr模板于4℃保存备用；
[0047]
(3)使用检测引物(epc1-det-f:5
’‑
tttctcattctccacctcc-3’,epc1-det-r:5
’‑
acaaaataaatcccagca-3’；epc2-det-f:5
’‑
tcagagatgcctttaaccgtc-3’,epc2-det-r:5
’‑
gccagtgattcagaagggct-3’)，以上述产物为模板进行普通pcr扩增；
[0048]
(4)取1μl pcr产物进行琼脂糖凝胶检测后送测序；
[0049]
(5)根据测序结果鉴定有效靶点，并将有效靶点对应的同批次注射的f0胚胎养至成鱼。
[0050]
(6)剪取f0成鱼尾鳍，加入50μl naoh(50mm)裂解液，在95℃裂解20min后，加入5μl tris-hcl(50mm ph 8.0)平衡，作为pcr模板于4℃保存备用；
[0051]
(7)使用检测引物，以上述产物为模板进行普通pcr扩增；
[0052]
(8)取1μl pcr产物进行琼脂糖凝胶检测后送测序；
[0053]
(9)根据测序结果选择有突变的f0与野生型斑马鱼交配，收集f1胚胎，取其中20颗胚胎，加入100μl naoh裂解液，在95℃裂解20min后，加入10μl tris-hcl平衡，以上述产物为模板进行普通pcr扩增，电泳检测后送测序；
[0054]
(8)根据测序结果，选择突变可遗传的f1(f0与野生型斑马鱼交配后代)胚胎，并将其养大(至少养60条f1成鱼，用于筛选有突变的f1成鱼)。
[0055]
1.2.1.4携带靶位点突变的f1成鱼筛选
[0056]
(1)将f1饲养至足够大(1-2个月即可)，剪尾鳍；
[0057]
(2)加入naoh裂解液，于95℃裂解20min，加入5μltris-hcl平衡后，作为pcr模板进行普通pcr扩增；
[0058]
(3)电泳检测后测序，筛选出有突变的f1成鱼；
[0059]
(4)将剩余pcr产物通过pcr纯化试剂盒纯化回收后，连接至pm18-t载体中，转化，挑选单菌落，进行菌落pcr扩增，并将扩增产物送至擎科生物公司测序；
[0060]
(5)根据测序结果，选择1-2个突变型，每个突变型保证雌雄均有，将相同突变类型的雌雄交配，获得f2胚胎。
[0061]
1.2.1.5携带靶位点突变的f2成鱼筛选
[0062]
(2)将f2胚胎饲养至足够大，剪尾鳍；
[0063]
(2)加入50μl naoh裂解液，于95℃裂解20min，加入5μl tris-hcl平衡后，作为pcr模板进行普通pcr扩增；
[0064]
(3)电泳检测后测序，筛选出有突变的f2成鱼，保证雌雄均有，用于后续实验。
[0065]
1.2.2epc1-/-epc2-/-双突变体的获得
[0066]
将epc1-/-与epc2-/-纯合突变体斑马鱼交配得到杂合的f
1 epc1
+/-epc2
+/-，将f1的雌雄交配得到f2群体，利用筛选引物(epc1-122bp-f4:5
’‑
tgaaaccgctgcccatattc-3’,epc1-122bp-r4:5
’‑
at ggtgttccagttcctcgt-3’；epc2-147-f:5
’‑
ccgaatgatccgtgttctgtg-3’,epc2-147-r:5
’‑
gttgatggagacgcagtcgg-3’)，通过dna电泳检测以及dna测序鉴定获得纯合双突变型epc1-/-epc2-/-。
[0067]
通过以上实验，我们可获得能够稳定遗传的epc1-/-epc2-/-双突变体。与野生型(epc1-targetseq id no.1和epc2-target seq id no.2)相比，epc1-/-epc2-/-双突变体中的靶序列分别突变为epc1-mutant seq id no.3和epc2-mutant seq id no.4所示序列，导致移码突变。epc1基因编码796个氨基酸，敲除其第1个外显子中的11个碱基对后基因表达提前终止，只编码66个氨基酸；epc2基因编码751个氨基酸，敲除其第1个外显子中的4个碱基对后基因表达提前终止，只编码10个氨基酸(图1中a-b)。
[0068]
》epc1-target seq id no.1
[0069]
ggtctggcagatcctcgcagcgg
[0070]
》epc2-target seq id no.2
[0071]
cggcgtctagcgctcgcgcgcgg
[0072]
》epc1-mutant seq id no.3
[0073]
ggtctgcagcgg
[0074]
》epc2-mutant seq id no.4
[0075]
cggcgtctagcgctcgcgg
[0076]
实施例2：嗜水气单胞菌胁迫实验
[0077]
(1)嗜水气单胞菌以0.1％v/v的量接种lb培养基，置28℃培养箱220r/min摇床培养；
[0078]
(2)培养至8h时，嗜水气单胞菌菌液浓度已达到较高水平，此刻用涂布平板法检测嗜水气单胞菌的浓度。灭菌去离子水将嗜水气单胞菌母液稀释106倍，稀释后的菌液取100μl涂布lb平板，三个平行，置28℃培养箱培养，次日计算单菌落个数，取平均值得到菌液的实际浓度；
[0079]
实验致病菌嗜水气单胞菌对斑马鱼的lc50是10
10
cfu/ml
[0080]
(3)用灭菌去离子水稀释嗜水气单胞菌，调整嗜水气单胞菌的浓度，制备不同梯度浓度的嗜水气单胞菌菌液。本实验中，制备了3个不同浓度梯度的嗜水气单胞菌菌液，浓度分别为：108cfu/ml、107cfu/ml、106cfu/ml。收集野生型、实施例1获得的epc1-/-、epc2-/-、epc1-/-epc2-/-双突变体以及突变体cox17-/-斑马鱼胚胎(zhang et al.,2020)，将发育至68hpf的斑马鱼幼鱼分别胁迫于不同浓度的嗜水气单胞菌菌液中，每组3个重复，每个重复50尾。
[0081]
(4)每隔12或24小时统计一次斑马鱼幼鱼的死亡率；
[0082]
(5)整理斑马鱼幼鱼死亡率，绘制成折线图。
[0083]
结果表明：相比较于野生型幼鱼，epc1-/-、epc2-/-和epc1-/-epc2-/-突变体对106cfu/ml(图2中a)、107cfu/ml(图2中b)、108cfu/ml(图2中c)不同浓度的嗜水气单胞菌胁迫均比较敏感，并且epc1-/-epc2-/-双突变体要比单突变体更加敏感。cox17-/-突变体对106cfu/ml(图3中a)、107cfu/ml(图3中b)浓度的嗜水气单胞菌胁迫不敏感。
[0084]
每个重复的致死率(％)＝(每个重复死亡个数/每个重复总个数(50个))*100％
[0085]
每组平均致死率(％)＝(重复1的致死率+重复2的致死率+重复3的致死率)/3
[0086][0087]
实施例3：
[0088]
低氧胁迫实验
[0089]
(1)将低氧仓氧气浓度调至2％，氮气浓度为93％，二氧化碳浓度为5％，温度调至28.5℃；
[0090]
(2)将适量斑马鱼养殖循环水提前12小时放至低氧仓，并搅拌，使循环水氧含量为2％；
[0091]
(3)收集野生型、突变体(epc1-/-、epc2-/-和epc1-/-epc2-/-)72hpf幼鱼。每组3个重复，每个重复50个样品，放置于60mm培养皿中，并将培养皿中的水替换为步骤(2)所准备的含氧量为2％的水，然后将样品放至低氧仓；以在正常氧气浓度下相同处理的鱼为对照。
[0092]
(4)每两小时统计并记录一次死亡数目；
[0093]
(5)对统计数据进行分析，并计算显著性。
[0094]
每个重复的存活率(％)＝(每个重复的存活个数/每个重复总个数(50个))*100％
[0095]
每组平均存活率(％)＝(重复1的存活率+重复2的存活率+重复3的存活率)/3
[0096]
结果表明：对于72hpf的斑马鱼幼鱼，相对于72hpf野生型，epc2-/-(图4b)和epc1-/-epc2-/-突变体(图4中c)的低氧耐受性均显著下调。且epc1-/-突变体对低氧耐受性无显著变化(图4中a)。
[0097]
技术特征：1.epc1-/-epc2-/-突变体斑马鱼在构建环境易感斑马鱼模型中的应用，所述的epc1-/-epc2-/-突变体斑马鱼，是野生斑马鱼中双缺失了epc1和epc2基因的纯合子转基因鱼。2.根据权利要求1所述的应用，应用过程是分别构建epc1和epc2单基因缺失的纯合突变体斑马鱼，然后二者再进行杂交，即可获得纯合双突变型epc1-/-epc2-/-斑马鱼。3.根据权利要求2所述的应用，构建单基因缺失的纯合突变体斑马鱼采用的crispr/cas9基因编辑技术，epc1grna靶位点为：5
’‑
ggtctggcagatcctcgcag-3’， epc2grna靶位点为：5
’‑
gggcgtctagcgctcgcgcg-3’。
技术总结本发明属于分子生物学领域，具体涉及epc1-/-epc2-/-突变体及其在构建环境易感斑马鱼模型中的应用，分别构建epc1和epc2单基因缺失的纯合突变体斑马鱼，然后二者再进行杂交，即可获得纯合双突变型epc1-/-epc2-/-斑马鱼。利用本发明所获得的epc1-/-epc2-/-环境易感突变体斑马鱼模型，可通过对渔业水环境或饮用水环境中的氧含量及细菌可进行生物指示监测，应用于水环境污染以及饮用水污染实时预警，具有灵敏度更高，应急效应更迅速等优势。应急效应更迅速等优势。
技术研发人员：刘静霞 刘茜 刘文叶 林舒慧
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2022/7/5
