一种基于神经肽基因npy鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种基于神经肽基因npy鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用。
背景技术：2.鸭肉是我国消费者重要的优质蛋白质来源，风味独特，富含有益于人体健康的不饱和脂肪酸，占家禽消费量约25％，深受消费者喜欢。肉鸭主要有白羽肉鸭、麻羽肉鸭、番鸭等，其中白羽肉鸭的出栏量占整个肉鸭出栏量的80％～90％。当前，饲养的白羽肉鸭主要品种有樱桃谷肉鸭、z型北京鸭等。白羽肉鸭q1系是新选育的一个品系，以美国枫叶鸭父母代种鸭为育种素材，连续开展了六个世代的选育，但对其生长发育规律等缺少研究。以npy基因作为影响屠宰性状的候选基因，筛查q1系鸭的snps位点，并分析其对屠宰性状的影响，为白羽肉鸭q1系持续开展选育和分子标记辅助选择、饲养管理提供参考。
3.npy基因是1982年tatemoto等研究人员在研究肽酰胺时在猪脑组织中发现，该基因主要存在于动物的神经组织中，对刺激动物采食活动以及参与机体能量代谢作用，因此得名神经肽(kazuhiko tatemoto,mats carlquist and viktor mutt.neuropeptide y
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a novel brain peptide with structural similarities to peptide yy and pancreatic polypeptide[j].nature,1982,296(5858):659-660.)。clark等对成年雌性大鼠关于npy对采食量(fi)的研究，发现npy对大鼠采食量有影响，其不仅能够刺激饱食大鼠进食，而且同注射胰岛素组大鼠做对比，发现其摄食量(fi)是注射胰岛素组的3倍，由此可知npy是一种强烈刺激摄食的一种多肽，同时研究还发现npy介导多种基因表达，而导致机体产生肥胖，如npy不仅介导炎症因子pentraxin3的表达，还促进活性氧(rox)的产生，而rox是已知的脂肪生成触发因素之一，导致小鼠前脂肪细胞3t3-l1细胞中的脂质积累(clark j t,kalra p s,crowley w r,et al.neuropeptide y and human pancreatic polypeptide stimulate feedingbehavior in rats[j].endocrinology,1984,115(1):427-9；shin m k,choi b,kim e y,et al.elevated pentraxin 3in obese adipose tissue promotes adipogenic differentiation byactivating neuropeptide y signaling[j].front immunol,2018,9:1790.)。在2011年zhang等对中国地方牛种的npy基因研究发现，该基因的第32463位出现a/c突变以及第32302位出现c/g突变，且该突变与中国地方牛-南阳牛的6、12、18月龄的体长和胸围相关(p《0.05)(zhang l,zhanga-l,zhang l-z,et al.association analysis between variants in bovine npy gene and growth traits in nanyang cattle(bos tarus)[j].gen comp endocrinol,2011,170(1):189-192.)。perkins等发现神经肽(npy)在高低rfi组安格斯牛表达有差异，在低rfi组中其表达量下降64％(perkins s d,key c n,garrett c f,et al.residual feed intake studies in angus-sired cattle reveal a potential role for hypothalamic gene expression in regulating feed efficiency[j].j anim sci,2014,92(2):549-560)。此外，中国专利文献cn111676295a公
开了一种采食量调控相关基因的研究方法，并具体公开了根据ncbi genbank中已知鸭的cck、cckar、npy以及npy5r基因设计多态性检测引物，用于基于上述基因开发与鸭采食量相关的snps位点，结果发现cckar基因具有与鸭采食量相关的snps位点，对cck、npy以及npy5r基因的snps位点未见报道。目前，也没有其它文献有关于npy与鸭采食量相关的snps位点被开发。
[0004]
本发明为了准确地挑选更适合生长发育的基因型，进而为早期选育提供数据，基于上述内容，提出一种基于神经肽基因npy鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用。
技术实现要素：[0005]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于神经肽基因npy鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用，针对与鸭的饲料利用率性状相关的候选基因的snp(单核苷酸多态性)分子标记，以解决常规表型育种选育进展缓慢，实现早期鉴定饲料利用率性状这一难题。
[0006]
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
[0007]
本发明提供了一种基于神经肽基因npy鸭饲料利用率性状的分子标记，所述npy基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为t或c，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第577位。
[0008]
本发明还提供了一种上述基于神经肽基因npy鸭饲料利用率性状的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。
[0009]
本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，包括以下步骤：
[0010]
(1)提取鸭翅静脉血液总dna；
[0011]
(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；
[0012]
(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测鸭的分子标记类型；
[0013]
(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状性状。
[0014]
进一步改进在于，所述特异性扩增引物序列为：
[0015]
seq id no.2:forward primer：ggacatggccagatactacctgg；
[0016]
seq id no.3:reverse primer：gggtacatgacccctgcactttt。
[0017]
进一步改进在于，所述基因分型检测方法为将pcr扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染获得图像，根据图像进行基因分型：
[0018]
(1)包含3条条带的则为cc型；
[0019]
(2)包含6条条带的则为ct型；
[0020]
(3)包含5条条带的则为tt型。
[0021]
进一步改进在于，所述步骤(4)中根据分子标记类型判断肉鸭饲料利用率性状的具体步骤为：
[0022]
(1)若待测鸭分子标记类型为cc型，该鸭饲料利用率性状极高；
[0023]
(2)若待测鸭分子标记类型为ct型和tt型，该鸭饲料利用率性状一般；
[0024]
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种基于神经肽基因npy鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用，利用pcr-sscp的方法来检测npy基因的突变，根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择，建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法，该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器，适合实验的需要。
附图说明
[0025]
图1为采用试剂盒法提取鸭基因组的dna电泳检测结果；
[0026]
图2为部分样品pcr特异性扩增产物的电泳图；其中，m为1kb dnamarker，泳道1～5为特异性扩增产物条带；
[0027]
图3为部分样品pcr特异性扩增产物的基因分型电泳图；
[0028]
图4为npy基因中第557位点基因型验证测序结果。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
[0030]
1、材料
[0031]
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0032]
2、方法
[0033]
2.1获得鸭npy基因多态位点
[0034]
2.1.1基因组dna提取与检测
[0035]
选取白羽肉雏鸭公鸭(q1系)388只，42日龄时翅静脉采血，利用大连宝生物公司生产的血液dna提取试剂盒提取鸭翅静脉血样中总dna，具体参照试剂盒使用说明书进行。
[0036]
用nanodrop2000测量dna浓度及od值。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测dna，结果如图1所示，提取的基因组dna质量较好，主带单一、清晰。
[0037]
2.1.2引物设计
[0038]
从鸭基因组数据库中找到seq id no.1所示的基因npy(ncbi的登录号为nc_051773)对应的dna序列，以seq id no.1所示基因npy的部分dna序列为模板，在引物设计的过程中注意尽量将snp位点设于中间位置，避免发夹结构、引物二聚体和错配等情况的发生，使引物序列最优化，引物序列如下所示：
[0039]
seq id no.2:forwardprimer：ggacatggccagatactacctgg；
[0040]
seq id no.3:reverse primer：gggtacatgacccctgcactttt。
[0041]
该引物的可扩增区域的长度为197bp序列，序列如seq id no.4所示，其中包含第557位t/c突变的分子标记位点。
[0042]
2.1.3pcr扩增
[0043]
利用上海生工生物工程有限公司生产的mix，通过已合成的测序特异性引物对npy基因的目的片段，进行pcr扩增反应，pcr扩增体系为：
[0044][0045][0046]
pcr反应条件为：95℃预变性5min；第一步95℃变性45s；第二步62℃退火45s(退火温度根据引物而定)；第三步72℃延伸30s，其中第二步到第三步循环31次，共有32个循环；72℃延伸10min。
[0047]
2.1.4pcr扩增产物检测
[0048]
利用1％质量比的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，如图2所示，在凝胶成像仪成像后获得获得一条长度近似200bp的条带，与预测的长度一致，说明获得了目的片段。将pcr产物送到上海生工生物工程测序，序列如seq id no.4所示，与预测结果一致。
[0049]
2.1.5pcr产物变性及sscp检测
[0050]
对pcr扩增后的产物首先变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶检测，最终根据不同的带型结果判定其突变，具体步骤如下：
[0051]
(1)根据说明配置非变性聚丙烯酰胺胶体，非变性丙烯酰胺凝胶体系如下：
[0052][0053]
(2)temed最后加入，加入后立即倒入模具中(浇灌前要确保模具封闭，防止灌胶时漏胶，以及胶条和孔梳的尺寸要一致)，倾斜约45
°
角，胶液从垂直板中间(可有效避免气泡产生)缓慢倒入，当浇灌至约离模具上沿时停止灌胶，插入事先准备好的梳子，室温聚合40分钟，多余的丙烯酰胺4℃保存，随时观察玻璃板凝胶聚合情况，并且补加适量非变性丙烯酰胺凝胶体系混合液。
[0054]
(3)在凝胶聚合等待过程时准备电泳卡槽，等聚合完成后安装好玻璃板向电泳卡槽中加入1
×
tbe，致tbe溶液超过加样孔约3cm，并赶走其中气泡。
[0055]
(4)取3μl的pcr扩增产物置于pcr管中，加入7μl变性试剂，短暂离心混匀，98℃变性10min，迅速取出放入-20℃冰盒10min，用10μl移液管点样。
[0056]
(5)打开电源，先220伏电泳10min，然后将电压调制120伏，电泳21h。
[0057]
(6)电泳结束后关上电泳仪，拿出玻璃板，小心取出凝胶，放入盛有清水的白瓷盘中清洗1-2次。
[0058]
(7)将凝胶放入染色液中避光轻摇15min。染色液：由硝酸银和纯水组成，硝酸银浓
度为0.2％。
[0059]
(8)染色结束，回收agno3，去离子水清洗1-3遍，每次2min，洗去多余的染色液。
[0060]
(9)显色液显色，使条带清晰，背景淡黄，染色时间使得条带清晰可见为止，显色后立即倒掉显色液。显色液：500ml，其中2％naoh+0.04％na2co3+420μl甲醛。
[0061]
(10)拍照，保存。
[0062]
2.1.6基因分型
[0063]
pcr-sscp图片如图3所示。不同的带型表示不同的基因型，从图3中可以看出npy基因第577位存在三种基因型，即tt、ct、cc。
[0064]
(1)包含3条条带的则为cc型；
[0065]
(2)包含6条条带的则为ct型；
[0066]
(3)包含5条条带的则为tt型。
[0067]
2.1.7dna验证测序
[0068]
将显色的基因分型胶图进行统计，获得tt、ct、cc三种分型，对这三种分型分别挑选一个个体进行测序比对，测序比对图如图4所示；测序结果中t突变成c，箭头标出了突变位置，与pcr-sscp结果一致。
[0069]
2.2npy基因t577c突变位点与鸭饲料利用率性状的关联分析
[0070]
2.2.1基因分型
[0071]
为确定白羽肉鸭(q1系)npy基因外显子1第557位碱基(t557c)的t/c多态性与肉鸭饲料效率性状是否相关，以388只白羽肉鸭公鸭(q1系)为试验材料，对21～42周龄肉鸭bw21(21日龄体重)、bw42(42日龄体重)、rfi(剩余采食量)、adfi(日采食量)、adg(日增重)、fcr(料重比)、mbw(代谢体增重)进行统计。根据如下公式计算个体rfi、adfi、mbw、bwg值：
[0072]
rfi＝fi-(b0+b1*mbw
0.75
+b2*bwg)
[0073]
adfi＝(fi42-fi21)/21(21-42天平均采食量)
[0074]
mbw
0.75
＝[(bw21+bw42)/2]0.75
[0075]
adg＝(bw42-bw21)/21
[0076]
其中，rfi为剩余采食量；fi为个体日采食量；mbw0.75为平均代谢体重；adg为日增重；b0为截距，b1、b2为回归系数。rfi的计算由sas线性拟合函数完成。采用2.1.6的基因分型方法，对388只鸭，进行基因分型，结果如表1。
[0077]
表1不同表型个体基因型检测结果
[0078][0079]
卡方检验结果显示，试验鸭群体基因型处于hardy-weinberg平衡。
[0080]
2.2.2统计分析
[0081]
通过胶图统计tt、ct、cc基因型个数，采用spss20.0中one-wayanova分析三种基因型与屠宰性能之间的差异，不同基因型与各性状间的关联分析结果见如表2所示：
[0082]
表2鸭npy基因型与鸭饲料利用率性状关联分析
[0083][0084]
注：同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，无字母表示差异不显著(p＞0.05)。
[0085]
从表中可以看出，通过不同基因型个体饲料效率性状比较得出，在cc、ct、tt三种基因型公鸭中，cc型在采食量(fi)和剩余采食量(rfi)，尤其是剩余采食量(rfi)，显著低于ct和tt型(p＜0.05)公鸭，各基因型间在其他指标上差异不显著(p＞0.05)。由于rfi是一个负向选择性状，得出结论，cc基因型个体饲料转化性状极高，ct基因型个体和tt基因型个体饲料转化性状一般。
[0086]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
技术特征：1.一种基于神经肽基因npy鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记，其特征在于，所述npy基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为t或c，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第557位。2.一种如权利要求1所述的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。3.一种利用如权利要求1所述的分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取鸭翅静脉血液总dna；(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测鸭的分子标记类型；(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状。4.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物序列为：seq id no.2:forward primer：ggacatggccagatactacctgg；seq id no.3:reverse primer：gggtacatgacccctgcactttt。5.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述基因分型检测方法为将pcr扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染获得图像，根据图像进行基因分型：(1)包含3条条带的则为cc型；(2)包含6条条带的则为ct型；(3)包含5条条带的则为tt型。6.根据权利要求5所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述步骤(4)中根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状的具体步骤为：(1)若待测鸭分子标记类型为cc型，该鸭饲料利用率性状极高；(2)若待测鸭分子标记类型为ct型和tt型，该鸭饲料利用率性状一般。
技术总结本发明公开了一种基于神经肽基因NPY鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其方法和应用，所述NPY基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为T或C，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第577位。本发明利用PCR-SSCP的方法来检测NPY基因的突变，根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择，建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法，该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器，适合实验的需要。要。要。
技术研发人员：金四华 耿照玉 江洪峰 税斐 夏晶晶 贾羽晴 曹程程 丁元飞 张泰康 贾富民
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2022.05.09
技术公布日：2022/7/5
