1.本发明涉及一种二氢苯并呋喃类化合物，尤其是涉及一种从海洋曲霉菌中提取的2,3-二氢苯并呋喃类化合物及其制备方法和用途。
背景技术：2.在近年来，由于抗生素的广泛使用，耐药病原体显著增加，迫切需要新的抗真菌药物。海洋具有高盐、低氧、低营养、无光和高压的独特环境，大量证据表明，海洋微生物可以产生具有独特性质的代谢物。近年来，随着对海洋微生物的不断探索，从海洋环境中发现了越来越多具有显著抗病毒、抗肿瘤、抗真菌和抗氧化活性的天然产物。所有这些都证明，海洋微生物的代谢产物将继续在新药发现和开发中发挥关键作用。
3.本发明人在对海洋曲霉菌aspergillus versicolor dj013 （保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no: m2014089）在大米发酵下的乙酸乙酯提取物的化学调查中，发现了一个2,3-二氢苯并呋喃类型新天然产物，将其命名为dibetanide a。此外通过抗真菌活性的筛选，发现其具有一定程度的抗灰葡萄孢生物活性，因此可用于防控和治疗由灰葡萄孢所引起的感染和病害的抗真菌先导药物的开发和利用。目前尚未见该化合物的化学结构及抗灰葡萄孢活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
技术实现要素：4.本发明所要解决的技术问题是提供一种对灰葡萄孢具有抑制作用的二氢苯并呋喃类化合物及其制备方法和用途。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种二氢苯并呋喃类化合物，该二氢苯并呋喃类化合物的结构式如i所示；（i）。
6.2、一种二氢苯并呋喃类化合物的制备方法，包括如下步骤：（1）发酵生产将保藏号为cctcc no：m2014089的花斑曲霉（aspergillus versicolor dj013）在改良高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化6天后，挑取单菌落接种
于改良高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、160 rpm/min的转速下置于摇床上培养増菌，培养4 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到大米培养基中，于温度28 ℃培养30 天，获得发酵物；（2）浸膏提取在步骤（1）得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡3-5次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，加入由体积比为1：1的乙酸乙酯和水组成的混合溶液重复萃取4次，合并各次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；（3）化合物的分离制备将步骤（2）得到的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到8个组分；将收集的第4个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到9个组分；将得到的第5个组分采用由乙腈与水按体积比40:60的比例混合而成的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化，获得化合物，其结构如（i）所示：（i）。
7.步骤（1）中所述的改良高氏1号固体培养基的配制方法如下：将20g可溶性淀粉，1g kno3，0.5g k2hpo4，0.5g mgso4·
7h2o，0.5g nacl，0.01g feso4·
7h2o，20g琼脂和30g海盐溶于1l水中配制而成；所述的改良高氏1号液体培养基的配制方法如下：将20g可溶性淀粉，1g kno3，0.5g k2hpo4，0.5g mgso4·
7h2o，0.5g nacl，0.01g feso4·
7h2o和30g海盐溶于1l水中配制而成；所述的大米培养基的配制方法如下：将80 g大米和3.6 g海盐溶于120 ml海水中配制而成。
8.步骤（3）中所述的反相中压柱层析（mplc）梯度洗脱中乙腈体积从30~100%，洗脱时间120 min。
9.步骤（3）中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为 2.0 ml/min。
10.3、上述二氢苯并呋喃类化合物在制备灰葡萄孢抑制剂方面的用途。
11.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明分离出一种2,3-二氢苯并呋喃类化合物，通过微生物发酵培养来获取2,3-二氢苯并呋喃类的发酵物，然后通过将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏，然后将该粗浸膏经中压正向硅胶柱层析，中压反向柱层析，及
反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该化合物具有微弱抗灰葡萄孢活性，可用于抑制由灰葡萄孢引起的相关病害的药物开发方面的用途。
12.上述花斑曲霉（aspergillus versicolor），该菌为dj013菌株，保藏编号为cctcc no：m2014089，于2014年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
13.以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
14.实施例1一种2,3-二氢苯并呋喃类化合物的结构式如i所示：(i)。
15.实施例2如实施例1结构式（i）所示的2,3-二氢苯并呋喃类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：1、发酵生产将保藏号为cctcc no：m2014089的花斑曲霉（aspergillus versicolor dj013）在改良高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化6天后，挑取单菌落接种于改良高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、160 rpm/min的转速下置于摇床上培养増菌，培养4 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到大米培养基中，于温度28 ℃培养30 天，获得发酵物；其中改良高氏1号固体培养基的配制方法如下：将20g可溶性淀粉，1g kno3，0.5g k2hpo4，0.5g mgso4·
7h2o，0.5g nacl，0.01g feso4·
7h2o，20g琼脂和30g海盐溶于1l水中配制而成；改良高氏1号液体培养基的配制方法如下：将20g可溶性淀粉，1g kno3，0.5g k2hpo4，0.5g mgso4·
7h2o，0.5g nacl，0.01g feso4·
7h2o和30g海盐溶于1l水中配制而成；大米培养基的配制方法如下：将80 g大米和3.6 g海盐溶于120 ml海水中配制而成；2、浸膏提取在步骤1得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡4次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，加入由体积比为1：1的乙酸乙酯和水组成的混合溶液重复萃取4次，合并各次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；3、化合物的分离制备
将步骤2制备得到的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流极性由小到大排列，合并得到8个组分；将收集的第4个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到9个组分；将得到的第5个组分采用由乙腈与水按体积比40:60的比例混合而成的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化，获得化合物，其结构如（i）所示：（i）。
16.本发明化合物ⅰ为黄色蜡状，正离子模式下的高分辨质谱(hr-esi-ms)给出其准分子离子峰m/z 366.1666 [m + h]
+
。结合
13
c nmr谱确定其分子式为c
20h25
no4，该化合物的1h和
13
c nmr谱数据见表1：表1. 化合物ⅰ的1d nmr 数据 (dmso-d6)
ꢀ
注1：s—单重峰、d—二重峰、t—三重峰、 m—多重峰。
[0017]
注2：1h 在600 mhz nmr获得；
13
c 在150 mhz nmr获得。
[0018] 实施例3实施例1所述的2,3-二氢苯并呋喃类化合物活性及应用（1）实验样品被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物ⅰ纯品，精密称取适量样品，用dmso配制成所需浓度的溶液供测试抗真菌活性。该实验使用的指示菌为灰葡萄孢（cgmcc3.3789）。
[0019]
（2）实验方法96孔板抗真菌测试方法：在96孔板中，终体积为200μl/孔的pda作为基本培养基，其中化合物的浓度以二倍稀释法稀释至浓度为512至1
ꢀµ
g/ml，并以6
×
10
5 cfu / ml的浊度添加真菌孢子培养物。将板在28℃下孵育过夜，然后观察板，将肉眼不能观察到真菌的孔所对应的化合物浓度确定为该化合物的最低抑制浓度mic。同时以咪鲜胺作阳性对照。
[0020]
（3）实验结果在96孔板抗真菌测试中，化合物ⅰ对灰葡萄孢的最小抑制浓度（mic）被确定为256
ꢀµ
g/ml。因此，可作为灰葡萄孢抑制剂或其他抗农用病原菌的药物先导化合物研究。
[0021]
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护
范围。
技术特征：1.一种二氢苯并呋喃类化合物，其特征在于所述的二氢苯并呋喃类化合物的结构式如（i）所示：（i）。2.一种权利要求1所述的-二氢苯并呋喃类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）发酵生产将保藏号为cctcc no：m2014089的花斑曲霉在改良高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化6天后，挑取单菌落接种于改良高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、160 rpm/min的转速下置于摇床上培养増菌，培养4 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到大米培养基中，于温度28 ℃培养30 天，获得发酵物；（2）浸膏提取在步骤（1）得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡3-5次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，加入由体积比为1：1的乙酸乙酯和水组成的混合溶液重复萃取4次，合并各次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；（3）化合物的分离制备将步骤（2）得到的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到8个组分；将收集的第4个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到9个组分；将得到的第5个组分采用由乙腈与水按体积比40:60的比例混合而成的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化获得化合物，其结构如（i）所示：
（i）。3.根据权利要求2所述的一种二氢苯并呋喃类化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的改良高氏1号固体培养基的配制方法如下：将20g可溶性淀粉，1g kno3，0.5g k2hpo4，0.5g mgso4·
7h2o，0.5g nacl，0.01g feso4·
7h2o，20g琼脂和30g海盐溶于1l水中配制而成；所述的改良高氏1号液体培养基的配制方法如下：将20g可溶性淀粉，1g kno3，0.5g k2hpo4，0.5g mgso4·
7h2o，0.5g nacl，0.01g feso4·
7h2o和30g海盐溶于1l水中配制而成；所述的大米培养基的配制方法如下：将80 g大米和3.6 g海盐溶于120 ml海水中配制而成。4.根据权利要求2所述的一种二氢苯并呋喃类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的反相中压柱层析梯度洗脱中乙腈体积从30~100%，洗脱时间120 min。5.根据权利要求2所述的一种二氢苯并呋喃类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为 2.0 ml/min。6.一种权利要求1所述的二氢苯并呋喃化合物在制备灰葡萄孢抑制剂方面的用途。
技术总结本发明公开了一种二氢苯并呋喃类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC NO：M2014089的曲霉菌通过发酵培养来获取2,3-二氢苯并呋喃化合物的发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取得粗浸膏，在此基础上将该粗浸膏经正相硅胶柱层析，反向中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，优点是该2,3-二氢苯并呋喃类具有抗灰葡萄孢的作用，可以用于开发预防和治疗由灰葡萄孢所引起的病害和感染的药物。和感染的药物。
技术研发人员：励文豪 丁立建 何山 胡炎杰 李娟
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5
