mns16a基因型作为生物标志在预测癌症化疗敏感性中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及mns16a基因型作为生物标志在预测癌症化疗敏感性中的应用。
背景技术：2.恶性肿瘤是新世纪危害人类健康的主要疾病之一，也是全球较大的公共卫生问题之一，给社会带来极大的疾病负担。近20年间，恶性肿瘤已成为我国居民的第一位致死原因。因此，肿瘤防治是全人类重中之重的一大任务。随着社会需求，各种肿瘤治疗的手段(如外科手术、化疗、放疗和分子靶向药物治疗)迅速发展，近年来化疗在恶性肿瘤治疗过程中的价值越来越受到重视，化疗不仅用于晚期患者的姑息治疗和有严重并发症、高龄等不宜外科手术治疗的病例，而且用于手术病理分期后具有高危因素者的辅助治疗或手术切除范围不足的补充治疗，研究表明，术后化疗可有效降低死亡风险。
3.化疗敏感性是癌症患者对化疗药物的反应敏感程度不同，越来越多的临床数据显示，不同患癌个体对同种药物的治疗有着不同的反应，即使临床诊断、分期、一般状况相同，使用相同的药物及治疗剂量，仍然可以呈现不同的疗效或不良反应，随着人类基因组计划的完成，人们逐渐意识到，个体遗传的多态性可能是导致肿瘤个体化差异的原因所在。研究表明，基因生物标志能够预测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，可用于临床指导癌症化疗方案的选择，避免过度治疗、达到精准治疗和个体化用药的目的，所以将基因生物标记物与化疗敏感性相结合显得十分必要。
4.端粒是覆盖染色体远端的结构，其功能是防止染色体降解、端对端融合、重排和染色体丢失。端粒酶是维持端粒的一种全酶，除了外周血、脐带血和骨髓白细胞外，大多数正常人体细胞中都不能检测到端粒酶的活性。大约90％肿瘤细胞具有端粒酶活性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，这表明端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记，到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成：1.rna组份(hterc)，它作为端粒重复合成的内源性模板；2.端粒酶结合蛋白(tep1)；3.端粒酶催化亚基(htert)，也有人称为端粒酶逆转录酶基因(telomerase reverse transcriptase gene)。rna组份和端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必需的成份。研究表明端粒酶催化亚基(htert)在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达，因此htert基因被认为是最常见的肿瘤标志物之一。现有研究表明人体端粒酶表达水平是许多癌症预后的独立预测因子；近来又有研究发现在htert基因的反义转录启动子区域上有一个多态串联重复序列小卫星(mns16a)，并且mns16a的vntr的多态性与htert mrna表达有关，但是现在并未表明htert基因上的mns16a跟癌症的预后有关。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供mns16a基因型作为生物标志在预测癌症化疗敏感性中的应用，解决现在技术中没有合适的基因生物标志来预测癌症化疗敏感性的技术问题。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.本发明提供了mns16a基因型作为生物标志在预测癌症化疗敏感性中的应用。
8.进一步的，所述mns16a基因型根据vntr可分型为ll、sl和ss的功能基因型，当个体基因型为ss时，判断个体为化疗敏感个体，当个体基因型为ll和sl时，判断个体为化疗不敏感个体。
9.进一步的，所述ss基因型为等位基因均为s的纯合体，所述ll基因型为等位基因均为l的纯合体，所述sl基因型为等位基因为s和l的杂合体，所述s等位基为端粒酶基因上243bp或272bp的dna片段，所述l等位基因为端粒酶基因上302或333bp的dna片段。
10.本发明还提供了mns16a基因型作为生物标志在制备预测癌症化疗敏感性试剂盒中的应用。
11.进一步的，所述试剂盒包括检测mns16a基因型的pcr特异性扩增引物。
12.进一步的，所述特异性扩增引物的序列为：前引物序列为5
′‑
aggattctgatctgaagggtg-3
′
，反向引物序列为5
′‑
tctgcctgaggagacgtatg-3
′
。
13.进一步的，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dntp、氯化镁、taq聚合酶和去离子水。
14.与现有技术相比，本发明的优点在于：
15.本发明通过检测htert基因上的mns16a基因型能够有效预测癌症患者对化疗药物的敏感性，用于临床指导癌症化疗方案的选择，制定更加合理的治疗方案，避免无效化疗、降低医疗成本、提高有效治愈率，达到精准治疗和个体化用药的目的。
附图说明
16.图1为本发明中299名胶质母细胞瘤患者的人端粒酶(htert)mns16a基因分型结果；
17.图2为不同基因型的总生存分析图。
具体实施方式
18.下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，未特别说明的试剂和仪器均可市售获得，未特别说明的实验操作均按产商说明书或本领域常规技术实施，除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
19.本发明的技术方案具体包括以下内容：
20.(1)以标准操作流程采集患者的外周血样本，系统收集完整的人口学资料和临床信息；
21.(2)对患者进行定期随访，进行完整的随访资料登记；
22.(3)对患者进行基因分型，获取其基因型信息；
23.(4)基于患者基因型进行统计分析，并对进行敏感性分析；
24.具体而言，本发明中涉及的实验方法主要包括以下几个部分：
25.本实施例提供了一种可用于预测癌症化疗敏感性的生物标志，为癌症患者的治疗
提供了新的
26.(1)研究样本的选择：
27.本发明样本为原发性恶性胶质瘤患者中的多形性胶质母细胞瘤患者，具有完整的病例资料(含诊断和治疗方案、病史等)，患者均接受了化疗，患者均为无肿瘤发病史的初诊患者，且入院前没有接受过与肿瘤相关的放射治疗，最终研究人群为299例gbm患者，其诊断年龄从20岁到65岁，平均年龄49.9岁。
28.(2)外周血基因组dna提取：
29.通过离心从外周血血样中获得白细胞沉淀，再根据使用说明，使用qiagen dna blood mini kit(qiagen，valencia，ca)从白细胞沉淀中提取基因组的dna，通过在1％琼脂糖凝胶电泳评估dna纯度，并通过紫外光谱测定dna的浓度。
30.(3)试剂盒制备方法
31.用于癌症化疗敏感性的预测的试剂盒包含：包含htert基因mns16a可变数目的串联重复序列多态性的dna片段，前引物序列：5
′‑
aggattctgatctgaagggtg-3
′
，反向引物序列：5
′‑
tctgcctgaggagacgtatg-3
′
，以及pcr缓冲液、dntp、氯化镁、taq聚合酶和去离子水等辅助成分。
32.(3)mns16a基因分型
33.对包含htert基因mns16a可变数目的串联重复序列多态性的dna片段进行特异性扩增，获得基因型信息，mns16a基因型根据vntr可分型为ll、ls和ss的功能基因型。
34.(4)统计分析
35.双侧χ2检验用于确定人口学变量和临床特征(年龄、性别、手术)在mns16a基因型的分布中的任何统计学上的显著差异；采用kaplan-meier法估算三种不同的mns16a基因型的总中位生存率，并使用对数秩检验来检验应用于计算p值；根据已鉴定的相关预后因素来建立cox比例风险模型，计算出风险比(hazards ratio,hr)及其95％置信区间(95％confidence interval,95％ci)，以此分析mns16a基因型多态性对癌症患者化疗敏感性的影响，根据患者的平均年龄(《50岁和≥50岁)将患者的诊断年龄分为两组，患者的手术切除类型分为以下三类：大体全切除、次全切除和活检，患者的生存时间从第一次在在癌症中心登记之日起计算，以最后一次接触日期或者死亡日期作为审查结点；统计学分析采用sas软件程序完成，统计学显著性水平为p＜0.05，所有检验均为双侧检验。
36.(5)结果分析
37.mns16a基因型的分布在年龄、性别或手术治疗方面没有统计学上的显著差异，然而，该基因型的分布因生存时间的长短而显著不同，与sl或ll基因型患者相比，ss基因型生存时间更长；ss基因型患者的中位生存期为25.1个月(95％ci＝14.9-30.9个月)，sl基因型患者的中位生存期为14.7个月(95％ci＝13.9-18.8个月)，ll基因型患者的中位生存期为14.6个月(95％ci＝12.6-17.4个月)(p＝.039)；l等位基因具有显性效应，l等位基因增多的患者hrs增加趋势检验具有统计学意义(p＝.02)；总之，可得出结论，mns16a基因型可作为生物标志预测癌症化疗敏感性，ss基因型患者生存期更长为化疗敏感性个体，ll基因型患者和sl基因型患者生存期更短、死亡风险更高为化疗不敏感性个体。
38.在一些实施例中，本发明提供了mns16a基因型作为生物标志用于预测癌症化疗敏感性及其应用，并研制出了用于预测化疗敏感性的检测试剂盒，以用于精准、个体化判定癌
症化疗疗效，指导个体化治疗改善癌症患者的预后。
39.在一些实施例中，本发明提供了mns16a基因型作为生物标志用于预测癌症化疗敏感性，mns16a基因型根据vntr可分型为ll、ls和ss的功能基因型。
40.在一些实施例中，mns16a基因型的pcr特异性扩增引物前引物序列为5
′‑
aggattctgatctgaagggtg-3
′
，反向引物序列为5
′‑
tctgcctgaggagacgtatg-3。
41.在一些实施例中，本发明提供了mns16a基因型作为生物标志在制备预测癌症化疗敏感性试剂盒中的应用，试剂盒其包括mns16a基因型的pcr特异性扩增引物，以及pcr缓冲液、dntp、氯化镁、dna聚合酶、去离子水等辅助成分。
42.实施例1
43.本发明用于预测癌症化疗敏感性的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括mns16a基因型的pcr特异性扩增引物，以及pcr缓冲液、dntp、氯化镁、dna聚合酶、去离子水等辅助成分。
44.实施例2
45.研究样本的采集资料整理
46.采集的样本为原发性恶性胶质瘤患者中的多形性胶质母细胞瘤患者，通过对临床资料进行整理，选择了符合标准的299例患者样本进行后续的研究分析，研究人群的诊断年龄从20岁到65岁，平均年龄49.9岁，所有患者均具有完整的病例资料(含诊断和治疗方案、病史等)，患者均接受了化疗，患者均为无肿瘤发病史的初诊患者，且入院前没有接受过与肿瘤相关的放射治疗。
47.实施例3
48.患者dna扩增以及基因分型
49.(1)基因组dna提取：
50.取实施例2中患者的外周血样本，通过离心从外周血血样中获得白细胞沉淀，再根据使用说明，使用qiagen dna blood mini kit(qiagen，valencia，ca)从白细胞沉淀中提取基因组的dna，通过在1％琼脂糖凝胶电泳评估dna纯度，并通过紫外光谱测定dna的浓度；
51.(2)mns16a基因分型
52.使用检测试剂盒，首先特异性扩增包含htert基因mns16a可变数目的串联重复序列多态性的dna片段，引物序列如下：
53.前引物序列：5
′‑
aggattctgatctgaagggtg-3
′
，反向引物序列：5
′‑
tctgcctgaggagacgtatg-3
′
；
54.反应体系(10ul)包含：1
×
pcr缓冲液(50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、ph8.3)，40ng基因组dna，5pmol pcr引物，1.5mmol/l氯化镁、0.1mmol/ldntp和1u taq聚合酶。该扩增反应在pcr扩增仪上进行，反应条件为：95℃预变性5分钟，进行35个循环的95℃30秒，60℃45秒，72℃1分钟，72℃10分钟；
55.pcr反应结束后，进行dna电泳(0.25μg/ml溴化乙锭和2％琼脂糖凝胶)对pcr产物进行检测，结果如图1所示，产生的基因型可分为243bp、272bp、302bp和333bp的不同组合，将243bp或272bp的dna片段归为s等位基因，302bp或333bp的dna片段归为l等位基因；mns16a基因型根据vntr可分型为ll、sl和ss的功能基因型，随机选取10％的样本重复进行基因分型，结果与先前的结果完全一致。
56.实施例4
57.结合实施例3得到的基因分型和实施例2中的多形性胶质母细胞瘤患者相关数据进行相关性统计分析：
58.由表1可见，mns16a基因型的分布在年龄、性别或手术治疗方面没有统计学上的显著差异。然而，该基因型的分布因生存时间的长短而显著不同，与sl或ll基因型患者相比，ss基因型生存时间更长。由图2的htert mns16a基因型的kaplan-meier生存曲线也可见与sl或ll基因型患者相比，ss基因型生存时间更长；如表2所示，不同mns16a基因型患者的中位生存期差异显著，ss基因型患者的中位生存期为25.1个月(95％ci＝14.9-30.9个月)，sl基因型患者的中位生存期为14.7个月(95％ci＝13.9-18.8个月)，ll基因型患者的中位生存期为14.6个月(95％ci＝12.6-17.4个月)(p＝.039)；由表3的单因素和多因素cox比例风险分析可见，与ss基因型相比，sl和ll基因型的死亡风险增加(调整后的hr＝1.78；95％ci＝1.11-2.85)，进一步分析发现l等位基因(sl基因型，调整后hr＝1.69；95％ci＝1.03-2.76；ll基因型，hr＝1.87；95％ci＝1.15-3.03)具有显性效应，l等位基因增多的患者hrs增加趋势检验具有统计学意义(p＝.02)；多变量cox比例风险分析也证实了，与ss基因型患者相比，sl或ll基因型患者的死亡风险更高，且这种端粒酶基因上的遗传变异的影响是独立于诊断年龄和手术治疗等危险因素的；总之，可得出结论，mns16a基因型可作为生物标志预测癌症化疗敏感性，ss基因型患者生存期更长为化疗敏感性个体，ll基因型患者和sl基因型患者生存期更短、死亡风险更高为化疗不敏感性个体。因此，本发明能够在能够在治疗方案制定时通过该方法预测化疗效果，从而给出更加合理的治疗方案，大幅提高治疗有效率，指导后续综合治疗，避免无效化疗，减少不必要的毒副反应，并避免经济上的浪费，为患者减轻负担。
59.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
60.表1.所选变量的mns16a基因型分布
[0061][0062]
表2.按选定变量分列的整个患者组的中位生存期
[0063]
[0064][0065]
表3.整个患者组的单因素和多元cox比例风险分析
[0066]
技术特征：1.mns16a基因型作为生物标志在预测癌症化疗敏感性中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述mns16a基因型根据vntr可分型为ll、sl和ss的功能基因型，当个体基因型为ss时，判断个体为化疗敏感个体，当个体基因型为ll和sl时，判断个体为化疗不敏感个体。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述ss基因型为等位基因均为s的纯合体，所述ll基因型为等位基因均为l的纯合体，所述sl基因型为等位基因为s和l的杂合体，所述s等位基为端粒酶基因上243bp或272bp的dna片段，所述l等位基因为端粒酶基因上302或333bp的dna片段。4.mns16a基因型作为生物标志在制备预测癌症化疗敏感性试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括检测mns16a基因型的pcr特异性扩增引物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述特异性扩增引物的序列为：前引物序列为5
′‑
aggattctgatctgaagggtg-3
′
，反向引物序列为5
′‑
tctgcctgaggagacgtatg-3
′
。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dntp、氯化镁、taq聚合酶和去离子水。
技术总结本发明公开了一种MNS16A基因型作为生物标志在预测癌症化疗敏感性中的应用，本发明涉及基因检测技术领域；MNS16A基因型根据VNTR可分型为LL、SL和SS的功能基因型，当个体基因型为SS时，判断个体为化疗敏感个体，当个体基因型为LL和SL时，判断个体为化疗不敏感个体，本发明通过检测hTERT基因上的MNS16A基因型能够有效预测癌症患者对化疗药物的敏感性，用于临床指导癌症化疗方案的选择，制定更加合理的治疗方案，避免无效化疗、降低医疗成本、提高有效治愈率，达到精准治疗和个体化用药的目的。达到精准治疗和个体化用药的目的。达到精准治疗和个体化用药的目的。
技术研发人员：汪洛
受保护的技术使用者：海南源轩生物科技有限公司
技术研发日：2022.04.07
技术公布日：2022/7/5
