一种靶向GPX4蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方法和应用

一种靶向gpx4蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向gpx4蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细胞铁死亡是一种由脂质过氧化物致死性累积驱动的调控性细胞死亡形式，并作为一种潜在的癌症治疗新通路近年来受到了广泛的关注。谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)在细胞铁死亡中起着关键作用，一些已经发生耐药性的癌细胞被发现强烈地依赖于gpx4蛋白的功能(参见【dixon,s.j.；lemberg,k.m.；lamprecht,m.r.；skouta,r.；zaitsev,e.m.；gleason,c.e.；patel,d.n.；bauer,a.j.；cantley,a.m.；yang,w.s.；morrison,b.,iii；stockwell,b.r.,ferroptosis:an iron-dependent form of nonapoptotic cell death.cell 2012,149(5),1060-1072.】)。
3.目前对于小分子抑制剂靶向gpx4治疗癌症仍然存在着挑战性。一方面，gpx4的分子表面缺少药物样结合口袋。已知的抑制剂通过共价键合到gpx4的活性部位发挥作用，但这可能会导致体内应用的低选择性。另一方面，gpx4对正常细胞也是必不可少的，gpx4的缺失会导致不可避免的毒副作用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向gpx4蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方法和应用，本发明的光敏剂嵌合体和gpx4蛋白的亲和力好，且能够靶向肿瘤细胞。
5.本发明提供了一种靶向gpx4蛋白的光敏剂嵌合体，包括靶向gpx4蛋白的多肽以及通过连接臂peg与所述靶向gpx4蛋白的多肽连接的光敏剂。
6.优选的，所述光敏剂包括9-甲基(i)和13-甲基(ii)反式-(
±
)-18-乙烯-4,4a-二氢-3,4-双(甲酯基)-4a,8,14,19-四甲基-23h,25h-苯卟啉-9,13-二丙酯。
7.优选的，所述靶向gpx4蛋白的多肽包括第一多肽、第二多肽、与所述第一多肽同源性大于90％的第三多肽或者与所述第二多肽同源性大于90％的第四多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.优选的，所述光敏剂嵌合体的化学结构式如式i或式ii所示；
[0009][0010]
所述式i和式ii中n独立为1～10之间的整数；所述targeting peptide为所述靶向gpx4蛋白的多肽；所述靶向gpx4蛋白的多肽的n端与连接臂peg通过酰胺键结合。
[0011]
优选的，所述靶向gpx4蛋白的多肽的c端经peg衍生化；所述光敏剂嵌合体的化学结构式如式iii或式iv所示；
[0012][0013][0014]
优选的，用于所述衍生化的peg的分子量≤20000。
[0015]
本发明还提供了上述方案所述的光敏剂嵌合体的制备方法，包括以下步骤：
[0016]
1)将连接臂peg和靶向gpx4蛋白的多肽第一混合，进行第一偶联，去除未偶联物，得到第一偶联物；
[0017]
2)将所述第一偶联物和光敏剂第二混合，在避光条件下进行第二偶联，去除未偶联物，得到光敏剂嵌合体。
[0018]
优选的，在步骤2)进行第二偶联后，还包括将第二偶联后的产物和peg第三混合，进行第三偶联，得到光敏剂嵌合体。
[0019]
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，活性成分包括上述方案所述的光敏剂嵌合体或者所述的制备方法制备得到的光敏剂嵌合体。
[0020]
本发明还提供了上述方案所述的光敏剂嵌合体或者所述的制备方法制备得到的光敏剂嵌合体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0021]
本发明提供了一种靶向gpx4蛋白的光敏剂嵌合体，包括靶向gpx4蛋白的多肽以及通过连接臂peg与所述靶向gpx4蛋白的多肽连接的光敏剂。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，gpx)是广泛存在于机体中的一种重要过氧化物分解酶。其中，gpx4蛋白具有高效清除膜脂质过氧化物的活性，在维持细胞膜氧化还原中具有关键的作用，是控制肿瘤细胞铁死亡过程的关键节点蛋白。本发明的光敏剂嵌合体包括靶向gpx4蛋白的多肽，对gpx4蛋白具有靶向性，能够与gpx4蛋白发生非共价的结合，并且所述靶向gpx4蛋白的多肽通过连接臂peg连接有光敏剂，在光照条件下可以选择性地降解多种肿瘤细胞中的gpx4蛋白，造成具有铁死亡特征和细胞免疫原性的细胞死亡方式。通过对肿瘤部位的定向式照射，本发明的光敏剂嵌合体可以实现对肿瘤细胞中gpx4的靶向性降解，对肿瘤靶向治疗具有重要的意义。
附图说明
[0022]
图1为光敏剂嵌合体制备过程图；
[0023]
图2为pv-1-α_液相图；
[0024]
图3为pv-1-α_质谱图；
[0025]
图4为pv-1-β_液相图；
[0026]
图5为pv-1-β_质谱图；
[0027]
图6为pv-2-α_液相图；
[0028]
图7为pv-2-α_质谱图；
[0029]
图8为pv-2-β_液相图；
[0030]
图9为pv-2-β_质谱图；
[0031]
图10为两种光降解靶向嵌合体pv-1、pv-2和维替泊芬的紫外吸收谱图，其中a:溶剂为pbs；b:溶剂为pbs/乙腈＝1:1；
[0032]
图11为两种光降解靶向嵌合体pv-1和pv-2荧光光谱，其中a:溶剂为pbs；b:溶剂为pbs/乙腈＝1:1；
[0033]
图12为两种光降解靶向嵌合体pv-1和pv-2在红光照射后用捕获剂tempo捕获后的的epr谱图，其中a:溶剂为pbs；b:溶剂为pbs/乙腈＝1:1；
[0034]
图13为应用生物膜干涉技术测定pv-2和蛋白gpx4的结合能力的结果；
[0035]
图14为不同光照时间、不同浓度下的嵌合体对活细胞中的蛋白gpx4的选择性降解结果；其中，a:pv-1对gpx4蛋白的降解依赖于光照时间的长短；b:pv-1对gpx4蛋白的降解依赖于浓度；c:pv-2对gpx4蛋白的降解依赖于光照时间的长短；d:pv-2对gpx4蛋白的降解依赖于浓度；e:pv-1和pv-2选择性地降解了gpx4而不影响其它相关蛋白；f：光降解后基于考马斯蓝染色的sds-page分析中全蛋白的比较(pv-2的浓度为5μm)；
[0036]
图15为设计的光降解靶向嵌合体诱发细胞发生铁死亡验证结果；其中a:pv-2导致的肿瘤细胞死亡可以被铁离子络合剂dfo阻断；b:pv-2导致的肿瘤细胞死亡可以被铁死亡
抑制剂liproxstatin-1(lip)阻断；
[0037]
图16为设计的光降解靶向嵌合体诱发癌细胞免疫原性以及树突状细胞的成熟；其中a：pv-2处理后肿瘤细胞上清中的hmgb1蛋白含量；b：pv-2处理后肿瘤细胞上清中的atp含量；c:pv-2处理后的肿瘤细胞对bmdc细胞的激活；
[0038]
图17为小鼠存活率和肿瘤大小变化，其中a：小鼠存活率；b：肿瘤大小变化；
[0039]
图18为pv-2_1-α液相图；
[0040]
图19为pv-2_1-α质谱图；
[0041]
图20为pv-2_1-β_液相图；
[0042]
图21为pv-2_1-β_质谱图；
[0043]
图22为光降解靶向嵌合体pv-2和pv-2_1蛋白降解考马斯亮蓝结果；
[0044]
图23为peg化共轭光敏嵌合体结构以及maldi-tof质谱结果；
[0045]
图24为peg化共轭光敏嵌合体粒径；
[0046]
图25为细胞活性结果。
具体实施方式
[0047]
本发明提供了一种靶向gpx4蛋白的光敏剂嵌合体，包括靶向gpx4蛋白的多肽以及通过连接臂peg与所述靶向gpx4蛋白的多肽连接的光敏剂。
[0048]
本发明通过构建gpx4靶向的光敏剂嵌合体，利用光照的方式来特异地降解gpx4蛋白，进而引发肿瘤细胞发生具有铁死亡特征和更强免疫原性的细胞死亡方式。
[0049]
在本发明中，所述光敏剂优选的包括9-甲基(i)和13-甲基(ii)反式-(
±
)-18-乙烯-4,4a-二氢-3,4-双(甲酯基)-4a,8,14,19-四甲基-23h,25h-苯卟啉-9,13-二丙酯(维替泊芬)，化学结构式如式v所示：
[0050][0051]
在本发明中，所述靶向gpx4蛋白的多肽包括第一多肽、第二多肽、与所述第一多肽同源性大于90％的第三多肽或者与所述第二多肽同源性大于90％的第四多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：crvdlqgwrrcrr；所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为：crawyqnycalrr；所述第一多肽和第二多肽的氨基酸序列从左到右为n端到c端。
[0052]
在本发明中，所述光敏剂嵌合体的化学结构式如式i或式ii所示；
[0053][0054]
所述式i和式ii中n独立为1～10之间的整数，优选为1～6之间的整数；所述targeting peptide为所述靶向gpx4蛋白的多肽；所述靶向gpx4蛋白的多肽的n端与连接臂peg通过酰胺键结合。
[0055]
在本发明中，所述靶向gpx4蛋白的多肽的c端经peg衍生化，以提高化合物的溶解性和在体内的稳定性；用于所述衍生化的peg的分子量优选的≤20000。
[0056]
在本发明中，所述光敏剂嵌合体的化学结构式如式iii或式iv所示；
[0057][0058][0059]
本发明还提供了上述方案所述的光敏剂嵌合体的制备方法，包括以下步骤：
[0060]
1)将连接臂peg和靶向gpx4蛋白的多肽第一混合，进行第一偶联，去除未偶联物，得到第一偶联物；
[0061]
2)将所述第一偶联物和光敏剂第二混合，在避光条件下进行第二偶联，去除未偶联物，得到光敏剂嵌合体。
[0062]
本发明首先将连接臂peg和靶向gpx4蛋白的多肽第一混合，进行第一偶联，去除未
偶联物，得到第一偶联物。
[0063]
本发明对所述靶向gpx4蛋白的多肽的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法制备得到即可。在本发明具体实施过程中，所述靶向gpx4蛋白的多肽采用基于fmoc的固相合成的方法制备得到。用于多肽合成的
α
n-fmoc或
α
n-boc保护的天然氨基酸包括：fmoc-asn(trt)-oh，fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。
[0064]
本发明在树脂上偶联靶向gpx4蛋白的多肽后，脱除fmoc保护基，洗涤，之后与溶解有连接臂peg的溶液第一混合；所述溶解有连接臂peg的溶液以dmf为溶剂，溶解有连接臂peg、hatu和hoat；所述连接臂peg、hatu和hoat的当量比优选为1:1:1；在第一混合前，溶解有连接臂peg的溶液中加入diea活化氨基酸。
[0065]
在本发明中，所述第一偶联的时间优选为9～16h，更优选为12h。
[0066]
得到第一偶联物后，本发明将所述第一偶联物和光敏剂第二混合，在避光条件下进行第二偶联，去除未偶联物，得到光敏剂嵌合体。
[0067]
在本发明中，所述第一偶联物偶联于树脂的基础上与溶解有光敏剂的溶液进行第二混合；所述溶解有光敏剂的溶液以dmf为溶剂，溶剂有光敏剂、hatu和hoat；所述光敏剂、hatu和hoat的当量比优选为1:1:1。在第二混合前，溶解有连接臂光敏剂的溶液中加入diea活化氨基酸。
[0068]
在本发明中，所述第二偶联的时间优选为9～16h，更优选为12h。
[0069]
在进行第二偶联后，本发明中优选的还包括将第二偶联后的产物和peg第三混合，进行第三偶联，得到光敏剂嵌合体。
[0070]
得到第二偶联物后，本发明将共轭物从树脂上切下，纯化，得到羧基末端的光降解靶向嵌合体；所述第三偶联优选的在液相溶剂dmf中进行。
[0071]
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，活性成分包括上述方案所述的光敏剂嵌合体或者所述的制备方法制备得到的光敏剂嵌合体。
[0072]
本发明还提供了上述方案所述的光敏剂嵌合体或者所述的制备方法制备得到的光敏剂嵌合体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0073]
本发明将光敏剂嵌合体与肿瘤进行孵育，继而对肿瘤区域进行光照，肿瘤细胞中gpx4发生降解并出现具有铁死亡特征和细胞免疫原性的细胞死亡。本发明的光敏剂嵌合体靶向gpx4蛋白显示出了重要的抗肿瘤治疗的意义。“耐药的肿瘤细胞”和处于“上皮细胞-间充质转化”(epithelial-mesenchymal transition，emt)状态的肿瘤细胞都对gpx4表现了更强的依赖性(参见hangauer,m.j.；viswanathan,v.s.；ryan,m.j.；bole,d.；eaton,j.k.；matov,a.；galeas,j.；dhruv,h.d.；berens,m.e.；schreiber,s.l.；mccormick,f.；mcmanus,m.t.,drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to gpx4 inhibition.nature 2017,551(7679),247-250.)。此外，gpx4失活导致的铁死亡具有免疫原性，可以应用于肿瘤免疫治疗。
[0074]
如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
[0075]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0076]
实施例1
[0077]
光敏剂嵌合体制备过程如图1所示
[0078]
(a)基于fmoc的固相多肽合成
[0079]
向多肽合成管中称取一定量负载有fmoc-nh2的树脂(fmoc loading:0.37mmol/g，总量按fmoc计算约为5μmol)，肽段的合成以dmf作为溶剂，在多肽合成管中完成偶联。fmoc保护基的脱除使用20％哌啶的dmf溶液处理两次，每次时间为5min；使用hatu/hobt(1:1)为偶联试剂，通过diea活化羧基实现氨基酸的偶联，每次偶联时间为20min，在大位阻氨基酸(pro、val、ile、arg、thr)之后进行的偶联一般缩合两次以保证连接效率。
[0080]
用于多肽合成的
α
n-fmoc或
α
n-boc保护的天然氨基酸包括：fmoc-asn(trt)-oh，fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。
[0081]
(b)linker和维替泊芬的偶联
[0082]
fmoc保护基使用20％哌啶的dmf溶液脱除(5min
×
2)，之后用dmf(
×
3)、dcm(
×
3)、dmf(
×
3)洗涤。将连接臂fmoc-nh-peg
n-ch2ch2-cooh(1.2equiv.)、hatu(1.2equiv.)和hoat(1.2equiv.)溶于3ml dmf，加入diea(2.4equiv.)活化氨基酸后将该混合溶液加入到装有树脂的多肽合成管中，在摇床上反应过夜至偶联完成。继续使用20％哌啶的dmf溶液脱除(5min
×
2)连接臂上的fmoc保护基，之后用dmf(
×
3)、dcm(
×
3)、dmf(
×
3)洗涤。将维替泊芬verteporfin(1.2equiv.)、hatu(1.2equiv.)和hoat(1.2equiv.)溶于3ml dmf，加入diea(2.4equiv.)活化氨基酸后将该混合溶液加入到装有树脂的多肽合成管中，在摇床上反应过夜至偶联完成，此过程需要全程避光操作。
[0083]
(c)嵌合体制备后的处理
[0084]
完成多肽固相合成后，将洗涤干净并除去溶剂的干燥树脂置于多肽合成管内，加入一定量的tfa/tips/h2o(95:2.5:2.5，～8ml/0.05mmol树脂)混合溶液并于摇床上处理2～3h实现多肽从树脂上的裂解以及多肽侧链保护基的脱除。之后收集反应液体并使用氮气流将其吹干，得到的固体用冷乙醚洗涤。最后使用h2o/mecn混合溶液将固体溶解，经滤膜过滤得到澄清溶液，用于后续的分析和分离纯化。
[0085]
(d)液相色谱分析及分离条件
[0086]
使用高效液相色谱进行多肽产物的分析及分离，所用流动相为添加0.05％tfa的h2o(流动相a)以及添加0.04％tfa的mecn(流动相b)。分析及分离采用梯度洗脱，所示梯度为mecn百分比含量。
[0087]
实施例2
[0088]
peg衍生化光敏剂嵌合体的制备方法
[0089]
向多肽合成管中称取一定量wang树脂(末端为cooh，fmoc loading：0.37mmol/g，总量按fmoc计算约为5μmol)，肽段的合成以dmf作为溶剂。fmoc保护基的脱除使用20％哌啶的dmf溶液处理两次，每次时间为5min；使用hatu/hobt(1:1)为偶联试剂，通过diea活化羧基实现氨基酸的偶联，每次偶联时间为20min，在大位阻氨基酸(pro、val、ile、arg、thr)之后进行的偶联一般缩合两次以保证连接效率。利用之前的方法通过固相多肽合成技术，将氨基酸，连接臂以及光敏剂连接到树脂上，随后利用tfa/tips/h2o(95:2.5:2.5，～8ml/0.05mmol树脂)混合溶液将多肽共轭物从树脂上切下，并通过上述纯化方式纯化，得到羧基
末端的光降解靶向嵌合体pv-2。之后加入等当量的nh
2-peg2000-oh，偶联试剂hatu/hobt(2equiv.，1:1)，活化剂diea(4equiv.)，在液相溶剂dmf中实现光降解靶向嵌合体羧基端和peg2000氨基端的偶联。结构如图13所示。
[0090]
(2)产品表征参数：
[0091][0092]
pv-1(同分异构体)
[0093][0094]
pv-2(同分异构体)
[0095]
lc-ms表征数据：
[0096]
利用lc-ms表征条件：agilent c18分析色谱柱，洗脱梯度为30min内流动相b从20％均匀变化至90％。
[0097]
pv-1:保留时间为19.51min和20.16min。esi-ms：calculate for c
117h171n36o26
s2:2562.39da和2561.82da(average isotopes)(m/z)，[m+3h]
3+
：855.13da和854.94da。两种同分异构体pv-1(分子式:c
117h171n36o26
s2)的lc-ms谱图如图2～图5。质谱的最高峰数据归属于[m+3h]
3+
.。
[0098]
pv-2:保留时间为20.88min和21.61min。esi-ms：calculate for c
122h164n31o27
s2:2561.22da和2561.22da(average isotopes)(m/z)，[m+3h]
3+
：854.74da和854.74da。两种同分异构体pv-2的lc-ms谱图(分子式:c
122h164n31o27
s2)如图6～图9。质谱的最高峰数据归属于[m+3h]
3+
.。
[0099]
(3)紫外表征图谱
[0100]
将光降解靶向嵌合体pv-1和pv-2分别溶解在pbs或50％acn(pbs:乙腈＝1:1)混合
溶剂中，浓度为20μm分别测定二者在两种溶剂中的紫外吸收谱图，并以光敏剂维替泊芬本身作为对照。测定结果如图10所示。在pbs溶液中，光降解靶向嵌合体的紫外吸收谱图与维替泊芬本身无显著差异。在pbs/乙腈1：1混合溶剂中，光降解靶向嵌合体的紫外吸收谱图略低于维替泊芬本身，可能的原因是溶解度差异。
[0101]
(4)荧光表征图谱
[0102]
将光降解靶向嵌合体pv-1和pv-2分别溶解在pbs或50％acn(pbs:乙腈＝1:1)混合溶剂中，浓度为20μm分别测定二者在两种溶剂中的荧光发射谱图，并以光敏剂维替泊芬本身作为对照。测定结果如图11所示。光降解靶向嵌合体的最大发射波长与维替泊芬本身一致。
[0103]
(5)epr图谱
[0104]
光降解靶向嵌合体以及维替泊芬本身产生的单线态氧在光激发期间被自旋捕获剂4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶(4-oh-temp，200mm)捕获，然后在x波段brukera200光谱仪上检测。为了检测单线态氧，在辐照前向光降解靶向嵌合体或维替泊芬溶液(20μm)中添加200mm最终浓度的4-oh-temp。用300w氙弧灯(ceaulight)和600nm带通滤波器(～1.5mw/cm2)照射一定时间后，立即将30μl等分试样吸入玻璃毛细管并转移至epr谐振器。溶剂为pbs或50％acn(pbs:乙腈＝1:1)。用于epr检测的典型设置为：扫描范围，100g；扫描时间60s；调制幅度1g；调制频率，100khz；微波功率19.23mw。测定结果如图12。
[0105]
(6)亲和力测定
[0106]
使用octet red96e(fortebio)通过生物层干涉法测定化合物对gpx4的剂量依赖性结合亲和力。用含0.01m hepes、0.15m nacl、0.05％v/v表面活性剂p20、1％牛血清白蛋白(bsa)的hbs-p缓冲液预处理后，使用酰胺反应第二代(ar2g)生物传感器探针(fortebio)，用反应性胺基固定gpx4蛋白。所有分析均采用标准方案，在30℃条件下，在96孔黑板中进行，每孔总体积为200μl。所有数据均通过八重态数据分析软件进行分析。采用1:1结合动力学模型拟合缔合率和解离率。平衡离解常数(kd)值由k
off
与k
on
之比计算得出。结果如图13所示。
[0107]
(7)蛋白降解实验
[0108]
蛋白质靶向光降解解采用westernblot进行分析。为了在活细胞中进行分析，将a549细胞接种到6孔板上。孵育24小时后，用光降解靶向靶向嵌合体pv-1，pv-2，维替泊芬本身、纯多肽或dmso作为对照在37℃下处理细胞8小时，然后用300w氙弧灯(600nm带通滤波器，1.5mw/cm2)照射细胞。细胞在含有蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合物(#87786，thermo fisher scientific)的ripa裂解缓冲液(p0013b，beyotime biotechnology)中在4℃下裂解30分钟，并通过细胞刮片收集。将收获的总蛋白质在12％聚丙烯酰胺凝胶中通过sds-page分离，然后转移到pvdf膜上(#1620177，bio-rad)。膜与5％脱脂牛奶一起孵育1小时，并在4℃下过夜，主要抗体如下：gpx4(ab125066，兔子，1:1000，abcam)、gpx1(ab108427，兔子，1:1000，abcam)、acsl4(ab155282，兔子，1:1000，abcam)和β-肌动蛋白(ab8226，兔子，1:1000，abcam)。在室温下与相应的hrp结合二级抗体(#7076，小鼠，1:2000；#7074，兔，1:2000，细胞信号)孵育2小时后，用增强化学发光试剂盒(p0018fm，beyotime biotechnology)检测印迹。实验结果如图14所示。实验结果表明，光降解靶向嵌合体pv-1，pv-2在细胞层面可以成功的实现gpx4的靶向的选择性降解。
[0109]
(8)细胞水平铁死亡验证实验
[0110]
1)采用cck-8法进行检测，以人三阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231细胞)为模型细胞，在96孔板中，孵育mda-mb-231细胞(5
×
104细胞/毫升培养基，培养基中含10％胎牛血清，1％双抗)；
[0111]
2)于培养箱中(37℃)培养12小时后，待细胞成功贴壁后，加入光降解靶向嵌合体pv-2，维替泊芬，多肽或dmso，孵育4小时后，再加入不同浓度铁死亡相关抑制剂铁离子螯合剂-去铁敏(desferrioxamine mesylate，dfo)或liproxstatin-1(lip)孵育1小时后，光照，共重复三组作为平行对照；
[0112]
3)样品孵育24小时后，用pbs洗三次，再加入10％的cck-8溶液(cck-8溶解于培养基中)于培养箱中孵育2小时，采用酶标仪测试孔板中的吸光度(480nm)计算细胞存活率；
[0113]
4)含样品片的孔板作为阳性对照，吸光度值定义为100％，不含细胞的孔板作为阴性对照，吸光度值定义为0％，以此计算样品片处理后的细胞存活率。本次实验步骤在上述实验基础上，得到实验结果如图15所示。
[0114]
(9)肿瘤免疫原性体外体内实验
[0115]
1)小鼠高迁移率族蛋白b1(hmgb-1)测定
[0116]
以小鼠黑色素瘤细胞(b16细胞)为模型细胞，在96孔板中，孵育b16细胞(5
×
104细胞/毫升培养基，培养基中含10％胎牛血清，1％双抗)；于培养箱中(37℃)培养12小时后，待细胞成功贴壁后，加入光降解靶向嵌合体pv-2，维替泊芬，多肽或dmso，孵育4小时后，光照不同时间，共重复三组作为平行对照；在指定的时间点后，收集上清液并通过离心从死亡的肿瘤细胞中清除，在室温下冷冻-20℃用于随后通过elisa试剂盒(solarbio)进行小鼠高迁移率族蛋白b1(hmgb-1)定量。所有分析均按照各自制造商的说明进行，采用biotek synergyneo2进行测试。数据分析采用四参数logistic曲线拟合。结果如16中的a所示
[0117]
2)atp测定
[0118]
用光降解靶向嵌合体pv-2处理b16细胞，以维替泊芬或dmso作为对照，在含2％fbs的培养基中培养24小时。然后收集上清液，并在4℃下以15000rpm离心3分钟。上清液储存在-80℃或立即用于atp测量。如产品说明书所述，使用celltiter发光细胞活性测定试剂盒(promega，g7571)进行atp分析。发光是在biotek synergyneo2上测量的。结果如图16中的b所示
[0119]
3)按照常规方法从小鼠的骨髓中提却未成熟的树突状细胞(bmdc细胞)。如前所述，分离和培养未成熟小鼠bmdc。然后将bmdc与光降解靶向嵌合体，维替泊芬或dmso刺激b16细胞以1:5、1:10或1:20的比例共同孵育18小时。作为阳性对照，bmdc与100ng/ml大肠杆菌脂多糖(lps)平行刺激。共培养18小时后，收集细胞，收集细胞离心(3000
×
g，5分钟，4℃)并用pbs溶液洗涤三遍。用免疫组化方法分析bmdc的成熟度。用抗cd11capc(biolegend)、抗cd86 apc-cy7(biolegend)以及抗mhcⅱpe-cy7(biolegend)流式抗体进行检测。结果如图16中c所示。
[0120]
上述实验结果证明，经光降解靶向嵌合体刺激的癌细胞展现出较好的免疫原性，能够很好的刺激bmdc细胞成熟。
[0121]
4)雌性c57bl/6j小鼠(5～6周龄)被饲养在特定的无病原体条件下。如上所述，光降解靶向嵌合体pv-2或维替泊芬分别在体外对b16细胞进行孵育照光处理。接下来，收集细
胞，在pbs中洗涤一次，并在pbs中以所需的细胞密度重新悬浮。接种小鼠皮下注射5
×
105的b16细胞或左侧注射pbs。在接种后第8天，用1
×
105活b16细胞在小鼠的对侧皮下攻击小鼠。肿瘤生长激发后，使用卡尺监测激发部位长达4周。如图17所示。这些数据表明光降解靶向嵌合体能够很好的诱导癌细胞死亡，并激活小鼠体内的适应性免疫反应，此效果还优于光敏剂维替泊芬本身。
[0122]
实施例3
[0123]
产品(pv-2_1的两种同分异构体pv-2_1-α和pv-2_1-β，分子式:c
127h174n31o30
s2)化学结构式如下所示：
[0124][0125]
lc-ms表征数据：
[0126]
利用lc-ms表征条件：agilent c18分析色谱柱，洗脱梯度为30min内流动相b从20％均匀变化至90％。
[0127]
pv-2_1:保留时间为24.75min和23.21min。esi-ms：calculate forc
127h174n31o30
s2:2679.05da和2679.16da(average isotopes)(m/z)，[m+3h]
3+
：893.97da和893.84da。如图18～图21所示。质谱的最高峰数据归属于[m+3h]
3+
。
[0128]
考马斯亮蓝蛋白降解实验
[0129]
为研究所设计的不同linker的光降解靶向嵌合体对于蛋白的降解能力的差异，将gpx4蛋白(100μg/ml)在25℃下用维替泊芬(vpf)、光解靶向嵌合(pv-2，pv-2_1)或二甲基亚砜处理，然后用300w氙弧灯(600nm带通滤光片，1.5mw/cm2)照射不同时间。混合蛋白溶液在15％聚丙烯酰胺凝胶中通过sds-page分离，然后进行考马斯亮蓝染色。为了制备0.025％考马斯r-250溶液，将phastgel blue片剂溶于1.6l考马斯r-250和1l 10％(v/v)醋酸中。将溶液加热至90℃，并将其倒入不锈钢托盘中的凝胶上；将盖有盖子的托盘放在实验室摇床上10分钟。在室温下，将凝胶在摇床上的托盘中在10％(v/v)醋酸中至少静置2小时。结果如图22。结果表明，linker长度的改变，依旧不会破坏所设计的光靶向嵌合体降解蛋白能力。
[0130]
peg衍生化产品的表征数据与药效实验
[0131][0132]
peptide2+vbf(n1＝2，n2＝2000)
[0133]
(a)产品表征参数参见图23。
[0134]
(b)粒径测量
[0135]
为了探究多肽的自组装情况，利用马尔文纳米粒度仪对过夜孵育的多肽粒径进行了测定。用pbs缓冲液将多肽储液(5mm)梯度稀释至所需浓度。取分散均匀的100μl多肽溶液加入样品池中，注意不要有气泡。将样品池放入仪器样品池槽内，开始仪器测试。结果如图24所示。
[0136]
(c)细胞数据
[0137]
为了研究peg化的光降解靶向嵌合体的抗肿瘤活性以及相关铁死亡机理，我们利用步骤8中的cck-8方法对人肺癌细胞a549细胞，人黑色素瘤细胞a375细胞分别测试相关化合物毒性以及铁死亡作用机制。结果显示引入的peg化方式对于癌细胞的ic
50
提高到1μm，并且能够诱发细胞发生铁死亡。结果如图25所示。
[0138]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种靶向gpx4蛋白的光敏剂嵌合体，包括靶向gpx4蛋白的多肽以及通过连接臂peg与所述靶向gpx4蛋白的多肽连接的光敏剂。2.根据权利要求1所述的光敏剂嵌合体，其特征在于，所述光敏剂包括9-甲基(i)和13-甲基(ii)反式-(
±
)-18-乙烯-4,4a-二氢-3,4-双(甲酯基)-4a,8,14,19-四甲基-23h,25h-苯卟啉-9,13-二丙酯。3.根据权利要求1所述的光敏剂嵌合体，其特征在于，所述靶向gpx4蛋白的多肽包括第一多肽、第二多肽、与所述第一多肽同源性大于90％的第三多肽或者与所述第二多肽同源性大于90％的第四多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。4.根据权利要求1～3任意一项所述的光敏剂嵌合体，其特征在于，所述光敏剂嵌合体的化学结构式如式i或式ii所示；所述式i和式ii中n独立为1～10之间的整数；所述targeting peptide为所述靶向gpx4蛋白的多肽；所述靶向gpx4蛋白的多肽的n端与连接臂peg通过酰胺键结合。5.根据权利要求4所述的光敏剂嵌合体，其特征在于，所述靶向gpx4蛋白的多肽的c端经peg衍生化；所述光敏剂嵌合体的化学结构式如式iii或式iv所示；
6.根据权利要求5所述的光敏剂嵌合体，其特征在于，用于所述衍生化的peg的分子量≤20000。7.权利要求1～6任意一项所述的光敏剂嵌合体的制备方法，包括以下步骤：1)将连接臂peg和靶向gpx4蛋白的多肽第一混合，进行第一偶联，去除未偶联物，得到第一偶联物；2)将所述第一偶联物和光敏剂第二混合，在避光条件下进行第二偶联，去除未偶联物，得到光敏剂嵌合体。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)进行第二偶联后，还包括将第二偶联后的产物和peg第三混合，进行第三偶联，得到光敏剂嵌合体。9.一种抗肿瘤药物，活性成分包括权利要求1～6任意一项所述的光敏剂嵌合体或者权利要求7或8所述的制备方法制备得到的光敏剂嵌合体。10.权利要求1～6任意一项所述的光敏剂嵌合体或者权利要求7或8所述的制备方法制备得到的光敏剂嵌合体在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向GPX4蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方法和应用。本发明的光敏剂嵌合体包括靶向GPX4蛋白的多肽，所述靶向GPX4蛋白的多肽通过连接臂PEG连接有光敏剂，在光照条件下可以有效地降解多种肿瘤细胞中的GPX4蛋白，造成具有铁死亡特征和细胞免疫原性的细胞死亡方式。本发明光敏剂嵌合体对肿瘤靶向治疗具有重要的意义。敏剂嵌合体对肿瘤靶向治疗具有重要的意义。敏剂嵌合体对肿瘤靶向治疗具有重要的意义。


技术研发人员：刘国全 刘思瑾
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2022.04.07
技术公布日：2022/7/5