1.本发明涉及一种单链可变区重组抗体及其制备方法和应用，具体涉及一种白斑症病毒单链可变区重组抗体及其制备方法和应用，其属于对虾分子免疫学技术领域。
背景技术：2.白斑症病毒（white spot syndrome virus, wssv）是一种世界范围内流行，能够感染多种海淡水养殖虾蟹类，造成白斑症的传染性病原。wssv 属于线头病毒科（nimaviridae）白斑病毒属（whispovirus），是一种具有囊膜的双链 dna 病毒，病毒粒子呈卵圆形、椭圆形或杆状，规则对称，直径 80-120nm，长 250-380nm。wssv的基因组大小约为300kbp，至少编码181个多肽，在wssv中已发现多种结构蛋白和约30个囊膜蛋白。作为wssv的重要囊膜蛋白之一，vp28已被证明在病毒感染过程中发挥了重要作用，其参与病毒对宿主的系统性感染，作用于宿主细胞，是病毒粘附并进入细胞的关键病毒蛋白，还参与病毒蛋白复合物的形成，协助子代病毒的组装和释放。
3.vp28作为wssv重要的致病性囊膜蛋白之一，是病毒检测、诊断的关键结构性蛋白，也是防治wssv感染的关键靶点。公开号为cn101691403的中国专利申请公开了一种抗对虾白斑症病毒囊膜蛋白vp28独特型单克隆抗体及其制备方法，该单抗是以抗wssv-vp28单抗(ab1)为抗原制备的，能与兔抗wssv-vp28抗体结合；具有与wssv竞争结合兔抗wssv-vp28抗体的能力。但是，vp28的单克隆抗体制备耗时长，纯化过程困难，大批量生产成本较高；并且由于其分子量较大、免疫原性高，在临床治疗应用时组织渗透性差，且易被降解；同时由于单抗无法进行基因工程设计与操作，影响其规模化应用与推广。
4.单链可变区重组抗体（scfv）由于其体积小、特异性高、能进行基因工程操作、便于规模化生产等特点，越来越受到大家的青睐。重组抗体通过克隆单克隆抗体的相关基因并将其在细菌、酵母、动物或植物细胞中表达，最终获得小分子重组抗体蛋白。scfv主要由抗体的可变重链（vh）和可变轻链（v
l
）组成，并通过柔性肽连接，其包含六个称为互补决定区（cdr）的特定区域，这些互补决定区是抗体中抗原结合域最小的功能单位。scfv 较好地保持了亲代单克隆抗体的抗原结合活性，分子量仅全长抗体的1/6，具有很好的组织渗透性，在临床治疗中具有良好的应用效果与前景。同时，单链抗体的多肽接头可根据实际需要设计为金属螯合位点、连接药物位点等，可广泛应用于病原的检测、诊断以及治疗。
技术实现要素：5.本发明的第一个目的是提供一种分子量小、免疫原性低、特异性高、具有病毒中和活性的白斑症病毒单链可变区重组抗体，用于对虾白斑症的临床防治，也可用于wssv的快速精确检测。
6.本发明的第二个目的是提供一种上述白斑症病毒单链可变区重组抗体的制备方法，通过克隆抗wssv-vp28中和性单克隆抗体3b7的scfv基因序列，制备高效表达该蛋白的菌株escherichia coli wssv-vp28-3b7-scfv，从而获得wssv-vp28中和性单克隆抗体的单
链可变区重组抗体。
7.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种白斑症病毒单链可变区重组抗体，包括重链可变区、轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no: 3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no: 4所示。所述重组抗体的重链可变区的编码核苷酸序列如seq id no: 1所示，所述轻链可变区的编码核苷酸序列如seq id no: 2所示。
8.所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由cdr1、cdr2和cdr3组成；所述重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的编码核苷酸序列分别如seq id no: 7、seq id no: 9和seq id no: 11所示。所述轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的编码核苷酸序列分别如seq id no: 13、seq id no: 15和seq id no: 17所示。
9.一种用于生产上述白斑症病毒囊单链可变区重组抗体的重组菌株，名称为：escherichia coli wssv-vp28-3b7-scfv，保藏号为：cctcc no：m 2022421，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2022年4月15日。
10.所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7是通过vp28重组蛋白作为抗原制备的，并经体内中和实验证实具有wssv中和活性。
11.所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体经间接酶联免疫吸附实验结果显示能和天然wssv发生特异性结合。
12.所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体能与浓缩的白斑症病毒悬液28kda蛋白发生特异性反应，显示紫褐色条带并经质谱检测。
13.所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体能特异性识别感染白斑症对虾虾鳃中的病毒粒子，显示绿色荧光。
14.所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体能够有效中和wssv的感染，延缓病毒感染造成的对虾死亡。
15.一种生产白斑症病毒单链可变区重组抗体的重组菌株escherichia coli wssv-vp28-3b7-scfv的制备方法，包括如下步骤：（1）通过双酶切、连接将白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体的单链可变区抗体基因与原核表达质粒pet-28a进行重组；（2）将重组质粒转化进入质粒表达大肠杆菌bl21中，获得表达单链抗体的重组菌株。
16.所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体基因的制备方法，包括如下步骤：（1）提取白斑症病毒囊膜蛋白vp28单克隆抗体杂交瘤细胞株3b7总rna并通过反转录pcr获得cdna模板；（3）利用cdna模板经pcr扩增重、轻链可变区基因序列；（4）通过重叠延伸 pcr并利用短肽 linker(gly4ser)3将重、轻链可变区连接，获得3b7单克隆抗体对应的单链抗体基因。
17.本发明还提供了所述白斑症病毒单链可变区重组抗体在制备鉴定白斑症病毒试剂，或在制备防治白斑症病毒感染研究试剂中的应用。
18.所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体基因，其氨基酸序列为：seq id no:3和seq id no:4所述白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体基因其核苷酸序列为：seq id no:1和seq id no:2本发明的优点在于：本发明克隆了抗wssv-vp28中和性单克隆抗体3b7的scfv基因
序列，并制备了高效表达该蛋白的菌株wssv-vp28-3b7-scfv，获得了wssv-vp28中和性单克隆抗体的单链可变区抗体的重组蛋白，并经免疫学检测、体内试验证明该单链可变区抗体能够特异性识别、结合wssv，能够有效中和wssv的感染，为wssv的快速诊断、检测和防治提供了重要工具。本发明根据虾蟹体内是否携带wssv，从而可判断其的健康状况；利用重组抗体蛋白能够提高动物抵抗wssv感染的能力，进而及时切断传播途径，以有效阻止病毒的感染与传播，减少wssv带来的经济损失。本发明基于wssv的vp28中和性单克隆抗体研制scfv，能够大量并且快速高效的制备免疫原性低、特异性高、组织渗透性强的重组抗体蛋白，这对基于具有病毒中和活性的重组单链抗体研发wssv治疗药物及快速检测诊断试剂具有重要的价值与意义。
附图说明
19.图1为对虾体内实验检测wssv-vp28单克隆抗体3b7的病毒中和效果结果图。
20.图2为wssv-vp28中和性单抗3b7单链可变区编码基因的核酸电泳图。
21.其中泳道m为标准核苷酸；泳道1为scfv-vh区编码基因；泳道2为scfv-v
l
区编码基因；泳道3为scfv-vh‑ꢀ
linker-v
l
全长。
22.图3为wssv-vp28中和性单抗3b7单链可变区重组抗体产生菌株wssv-vp28-3b7-scfv的蛋白诱导结果图。
23.其中泳道m表示分子量标准蛋白；泳道1表示未诱导的菌株；泳道2表示经iptg诱导的菌株；泳道3表示纯化的scfv重组蛋白；泳道4表示经iptg诱导的菌株裂解液上清蛋白。
24.图4为间接酶联免疫吸附实验分析不同浓度scfv蛋白对天然wssv特异性结合的结果图。
25.其中pc表示单克隆抗体3b7与天然wssv发生结合反应的od值，即阳性对照；nc表示未包被wssv组的od值，即阴性对照。
26.图5为免疫印迹法分析重组单链抗体与天然wssv特异性结合的结果图其中泳道m表示分子量标准蛋白；泳道1表示天然wssv的sds-page结果；泳道2表示单克隆抗体3b7与天然wssv中28kda蛋白反应结果；泳道3表示scfv与天然wssv中28kda蛋白反应结果；泳道4为阴性对照。
27.图6为免疫印迹法分析中对应的28kda蛋白条带切胶质谱结果。
28.图7为间接免疫荧光实验分析scfv与感染对虾虾鳃中的wssv特异性结合反应图。
29.其中a1表示在40倍物镜下观察的scfv与感染对虾虾鳃中的wssv结合反应；a2为dapi衬染的细胞核；a3为a1、a2的叠加图；b1为骨髓瘤细胞上清液孵育感染的对虾虾鳃；b2为dapi衬染的细胞核；b3为b1、b2的叠加图。
30.图8为对虾体内实验验证scfv对wssv中和效果的结果图。
具体实施方式
31.下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
32.实施例1：白斑症病毒囊膜蛋白vp28的重组蛋白制备及其中和单克隆抗体的研制1、白斑症病毒囊膜蛋白vp28重组蛋白的制备（1）根据已公布的wssv基因组序列，设计了vp28的特异性引物对，并用于扩增其开
放阅读框（orf）。所有用于重组表达的引物都列在表1中。
33.表1 vp28重组蛋白制备所用的引物rvp28-fcgggatccatggatctttctttcactctttcggtcgrvp28-rcccaagcttctcggtctcagtgccagagtaggtg（2）将扩增的序列连接到pet-32a载体中并转移到大肠杆菌bl21（de3）中。通过pcr筛选出阳性克隆，并通过测序确认其正确性。将阳性的大肠杆菌bl21在lb培养基中37℃培养到指数生长期，然后加入100mm的iptg来诱导重组vp28的表达。
34.（3）带his标签的vp28重组通过ni-nta亲和层析进行纯化，并进行尿素梯度透析处理。随后，纯化的vp28重组蛋白进行冷冻干燥，并储存在-80℃超低温冰箱。
35.2、中和单克隆抗体的研制（1）将100
µ
g纯化的vp28重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合并乳化，然后对两只balb/c小鼠进行腹腔内免疫。两周后，用弗氏不完全佐剂乳化相同数量的rvp28进行腹腔注射以加强免疫。然后每隔一周通过尾静脉给小鼠注射100
µ
g的重组蛋白。最后一次注射三天后，在无菌条件下提取小鼠脾脏与胸腺细胞。
36.（2）采用乙醚麻醉小鼠，无菌条件下取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用rpmi-1640培养基吹打形成单细胞悬液。本发明中关于实验动物的处理均符合动物福利的要求。
37.（3）分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀用rpmi-1640培养基重悬，胸腺细胞沉淀用含有1%hat的rpmi-1640 (含10%胎牛血清)选择性细胞培养基重悬。
38.（4）将脾细胞悬液与p3-x63-ag8u1骨髓瘤细胞悬液混合均匀后，1000rpm离心3min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状；用吸管吸取预热到37℃的聚乙二醇溶液lml，于1min内匀速滴加到离心管内，然后在37℃水浴中静置5min；继续滴加预热到37℃的rpmi-1640培养基15ml，使peg稀释而失去作用，补加rpmi-1640培养基至40ml，经1000rpm离心3min，弃去上清液；（7）将的1ml细胞悬液加入制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中；将培养板放入37℃，co2浓度为4.5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。
39.（8）融合后，待杂交瘤细胞群长至占96孔培养板孔底面积约1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞。
40.①
包被抗原：将vp28重组蛋白用碳酸盐包被液（ph 9.6）稀释至浓度为50
µ
g/ml，加入96孔酶标板中（100
µ
l/孔），4℃下包被过夜；
②
吸出包被液，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（pbst）洗涤，每次5min，洗三次；
③
每孔加入200
µ
l 3%的牛血清白蛋白封闭液（3%bsa封闭液），37℃下封闭1h；
④
同
②
洗涤三次；
⑤
将杂交瘤细胞培养上清液作为第一抗体，按每孔50
µ
l加入酶标板，37℃温箱孵育1h；
⑥
同
②
洗涤三次；
⑦
将碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠ig单抗（1:4000稀释）作为第二抗体，按每孔50
µ
l加入酶标板，37℃温箱孵育1h；
⑧
同
②
洗涤三次；然后每孔加入100
µ
l 4-硝基酚磷酸盐（pnpp）应用液，暗处反应5~20min，每孔加入50
µ
l 2m的naoh溶液，稳定3~5min即可用405nm工作波长测定od值。
41.以骨髓瘤细胞上清液作为阴性对照，以不测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比（p/n），当p/n≥2.1时该孔为阳性。
42.（9）克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下：
①
采用乙醚麻醉小鼠后，无菌条件下取出胸腺，在100目网筛上研磨，用rpmi-1640培养基吹打形成单细胞悬液；
②
把胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液,胸腺细胞沉淀用10ml rpmi-1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬；
③
把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；
④
细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100
µ
l，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；
⑤
放入co2培养箱中培养；
⑥
两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。
43.（10）取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，1000g离心3min，弃去上清，加冻存液（9份rpmi-1640培养基+1份二甲亚砜），使最终细胞密度为5
×
106个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80℃超低温冰箱内过夜（8~12h）后，再浸入液氮内长期保存。
44.3、单克隆抗体中和活性的检测为探究制备的抗wssv-vp28单克隆抗体能否在凡纳滨对虾体内中和wssv的感染，取杂交瘤细胞株分泌上清液与浓缩的wssv 悬液等体积混合，于室温孵育2小时后分别注射感染对虾，通过计算对虾存活率来评估其中和活性。
45.（1）实验分组，分别设置3个实验组，3b7、5g3、8d2三株单克隆抗体与等体积的 wssv 稀释液混匀，室温孵育 2小时，准备注射感染对虾，阳性对照组选择骨髓瘤细胞培养上清与wssv混合，阴性对照组选择骨髓瘤细胞上清与等体积的pbs混合孵育。
46.（2）凡纳滨对虾购于青岛胶州某养殖场，约8～10cm，养殖于不断充气的水槽内，每日投喂；按照 oie 推荐方法检测为 wssv 阴性；暂养一周后用于wssv 的攻毒实验。
47.（3）取暂养一周后健康对虾分别注射等体积的wssv 与单抗的混合液，通过腹节皮下注射，每只50μl，对照组注射同等体积的wssv/pbs与骨髓瘤上清混合液，每个组各30只对虾。
48.（4）感染后每 24 小时观察记录对虾死亡情况，计算并绘制存活率曲线。
49.结果：制备3株能够识别wssv-vp28的单克隆抗体。并且在肌肉注射病毒感染对虾后，所有实验处理组在攻毒实验结束后（15 天）均达到 100%死亡率，但单抗混合组中对虾的死亡时间出现明显延迟，表明制备的3株单抗均具有一定病毒中和活性。与其他两株单抗相比，3b7实验组对虾开始死亡的时间以及达到100%死亡率的时间均显著延迟，表明该株单
克隆抗体具有较高的中和活性，可用于后续制备单链可变区抗体（图1）。
50.实施例2：白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体3b7的单链可变区抗体基因克隆1、杂交瘤细胞株的复苏、总rna的提取和cdna模板的合成（1）将冻存的抗 wssv-vp28 的中和单抗3b7杂交瘤细胞株从-80
°
c 冰箱中取出，立即放入提前预热的 37
°
c 水浴锅融化，至完全融解后，1000 rpm 室温离心3分钟，超净工作台内小心倒掉上清，加入 1ml 37
°
c 预热的 git 细胞培养基轻轻悬起细胞，转移到24孔细胞培养板内，置 4.5% co2细胞培养箱内培养。
51.（2）取处于对数生长期的细胞用于总 rna 提取，处于对数生长期的细胞透明、形状规则、浑圆透亮。收集约1
×
l07个杂交瘤细胞，1000 rpm室温离心3分钟，弃上清，加入1ml trizol 反复吹打裂解细胞至均一状态。然后加入氯仿，剧烈震荡后12000g、4
°
c离心15分钟。取上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀后12000g、 4
°
c离心15分钟，所得沉淀即总rna。
52.（3）获得杂交瘤细胞的总 rna 后，直接通过反转录 pcr 合成对应的 cdna，用于目的序列的扩增。
53.2、单克隆抗体重轻链可变区基因的扩增以获得的cdna为模板，以用于特异性扩增鼠源抗体可变区序列的 pcr 引物扩增3b7抗体的重轻链可变区序列（vh，v
l
），以商品化的heavy primers 1 和 2 扩增 vh，以商品化的 light primers mix 扩增 v
l
。琼脂糖凝胶电泳检测 pcr 扩增结果并确认获得预期目的条带后，使用 pcr 产物回收试剂盒回收pcr 产物，nano drop 8000 微量核酸测定仪测定dna 片段浓度（图2）。利用 taq dna聚合酶扩增后的 dna 片段 3’末端添加了一个 "a" 的特性，将目的片段连接至pmd-19t 载体进行 t-a 克隆，并通过筛选阳性菌株的方法对目的基因测序，获取其 cdna 序列。
54.最终确定了3b7抗体的重链可变区序列核苷酸序列如下：caggtgaagcttcagcaatcaggacctgagctggtgaagcctggagcttcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaacatgcactgggtgaaacagagccatggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgctactaggtacaaccagaaattcaaggacaaggccacattgagtgcagacaaatcttccagcacagcctacatgcagctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagggggggcagctcgggcgcttttgactactggggccaagggaccatggtcatcgtctccgca （seq id no:1）。
55.3b7抗体的轻链可变区序列核苷酸序列如下：gacattgtgatgacccagtctccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctttctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactaaaaatcatcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttccttgtacacgttcgggaggggggaccaagctggaaataaaacggtag （seq id no:2）。
56.确定了3b7抗体的重链可变区氨基酸序列如下：qvklqqsgpelvkpgasvkmsckasgysftgynmhwvkqshgkslewigyidpyngatrynqkfkdkatlsadkssstaymqlnsltsedsavyycarggssgafdywgqgtmvivsa （seq id no：3）。
57.确定了3b7抗体的轻链可变区氨基酸序列如下：divmtqspltlsvtigqpasisckssqslldsdgktylnwllqrpgqspkrliflvskldsgvpdrft
gsgsgtdftlkiirveaedlgvyycwqgthfpctrsgggtkleikr（seq id no：4）。
58.3、soe-pcr 构建单链抗体基因本发明研制的 scfv 基因采用v
h-linker-v
l
的顺序，所以在扩增用于soe-pcr 的 v
h 和 v
l
序列时，需要在原有vh序列的3’端和和原有v
l
序列的5’端分别加入部分 linker 序列，便于后续的重叠延伸；另外，为方便后续对 scfv基因的克隆可表达，引入限制性酶切位点及相应的保护碱基。设计的用于扩增各单抗含 linker 序列的 vh和v
l
序列的引物整理于表1。pcr分别扩增单抗3b7含连接肽基因的vh和v
l
，经回收测序后，利用重叠延伸pcr进行全长延伸扩增。取重叠延伸pcr产物，利用表2中的引物 scfv-3b7vhf 和 scfv-3b7v
l
r 来进行 scfv-3b7 基因的扩增。
59.表2 扩增3b7抗体的重轻链可变区序列所用的引物
scfv-3b7vhfccggaattccaggtgaagcttcagcaatcag*scfv-3b7vhraccgccggatccaccacctcccgagccaccgccacctgcggagacgatgaccatggscfv-3b7v
l
fggtggtggatccggcggtggcggttccgacattgtgatgacccagtcscfv-3b7v
l
rcccaagcttttaccgttttatttccagcttgg*
最终确定了3b7抗体的单链可变区抗体基因的核苷酸序列如下：（seq id no:5）caggtgaagcttcagcaatcaggacctgagctggtgaagcctggagcttcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaacatgcactgggtgaaacagagccatggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgctactaggtacaaccagaaattcaaggacaaggccacattgagtgcagacaaatcttccagcacagcctacatgcagctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagggggggcagctcgggcgcttttgactactggggccaagggaccatggtcatcgtctccgcaggtggcggtggctcgggaggtggtggatccggcggtggcggttccgacattgtgatgacccagtctccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctttctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactaaaaatcatcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttccttgtacacgttcgggaggggggaccaagctggaaataaaacggtag。
60.确定了3b7抗体的单链可变区抗体的氨基酸序列（seq id no: 6）如下：qvklqqsgpelvkpgasvkmsckasgysftgynmhwvkqshgkslewigyidpyngatrynqkfkdkatlsadkssstaymqlnsltsedsavyycarggssgafdywgqgtmvivsaggggsggggsggggsdivmtqspltlsvtigqpasisckssqslldsdgktylnwllqrpgqspkrliflvskldsgvpdrftgsgsgtdftlkiirveaedlgvyycwqgthfpctrsgggtkleikr。
61.4、抗体可变区序列分析将获得的抗体可变区基因在 imgt（http://www.ebi.ac.uk/imgt）中 imgt/v
ꢀ‑
quest 进行分析，克隆的基因符合小鼠免疫球蛋白可变区基因的特征，轻、重链可变区基因均具有 3 个 cdr ，并有维持抗体可变区结构所必需的特征性半胱氨酸残基且位置正确。
62.（1）重链可变区序列信息：
①
重链可变区cdr1的核苷酸序列：ggttactcattcactggctacaac（seq id no: 7）；氨基酸序列：gysftgyn（seq id no: 8）。
63.②
重链可变区cdr2的核苷酸序列：attgatccttacaatggtgctact（seq id no: 9）；氨基酸序列：idpyngat（seq id no: 10）。
64.③
重链可变区cdr3的核苷酸序列：tgtgcaagggggggcagctcgggcgcttttgactac（seq id no: 11）；氨基酸序列：carggssgafdy（seq id no: 12）。
65.（2）轻链可变区序列信息：
①
轻链可变区cdr1的核苷酸序列：cagagcctcttagatatagtgatggaaagacatat（seq id no: 13）；氨基酸序列：qslldsdgkty（seq id no: 14）。
66.②
轻链可变区cdr2的核苷酸序列：ctggtgtct（seq id no: 15）；氨基酸序列：lvs（seq id no: 16）。
67.③
轻链可变区cdr3的核苷酸序列：tggcaaggtacacattttccttgtacacgt（seq id no: 17）；氨基酸序列：wqgthfpctr（seq id no: 18）。
68.实施例3：本发明单链可变区抗体的重组表达（1）使用引物 scfv-3b7vhf 和 scfv-3b7v
l
r 来进行 scfv-3b7基因的扩增，pcr 产物回收试剂盒回收目的基因，备用。
69.（2）取上步获得的 dna 片段和 pet28a 载体分别进行双酶切实验。
70.（3）按照载体与目的基因摩尔比 1：10 比例（0.03pmol: 0.3pmol）配置t4 dna ligase连接体系，16
°
c 反应过夜。
71.（4）全部连接体系加入 dh5α感受态细胞，进行转化操作，菌落 pcr 筛选阳性克隆，并送至公司测序。
72.（5）挑取平板上经测序正确的菌株，于含卡那霉素的液体 lb 培养基内培养过夜，提取质粒，并转化至 bl21 (de3)感受态细胞，同样菌落 pcr 鉴定阳性克隆，准备重组蛋白的诱导表达。
73.（6）挑取上步获得的阳性克隆菌株于新鲜的含卡那霉素的液体 lb 培养基内培养至 od600=0.8 左右，加入 iptg 至终浓度为 1mm，继续培养 4-5 小时后 8000 rpm 离心 5 分钟收获菌体，0.1m 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, pbs）重悬菌体，经过超声波破碎后用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
74.（8）超声波破碎后的菌体加入等体积的 2
×
loading buffer 后沸水中煮沸 5 分钟，移液器小心加样至凝胶孔径中，电泳槽内 30ma 恒流至溴酚蓝跑出凝胶底部，凝胶经染色、脱色后于凝胶电泳系统分析目的蛋白的表达。
75.（9）重组蛋白通过ni-nta（ge healthcare, chicago）亲和层析进行纯化，并通过逐步透析对纯化的scfv重组蛋白进行复性，最后经超纯水透析后，冻干，调整浓度后通过sds-page检测纯度及蛋白浓度。
76.结果：sds-page显示经iptg诱导的菌株中出现明显的蛋白条带加粗，同时经纯化、复性的scfv重组蛋白条带单一，浓度较高，表明3b7单抗的scfv重组表达成功，能够用于后续实验（图3）。
77.实施例4:本发明单链可变区抗体的间接酶联免疫吸附实验鉴定（1）包被抗原：将浓缩的wssv悬液用碳酸盐包被液（ph 9.6）稀释至浓度为50
µ
g/ml，加入96孔酶标板中（100
µ
l/孔），4℃下包被过夜；（2）吸出包被液，用pbst洗涤，每次5min，洗三次；
（3）每孔加入200
µ
l 3%bsa封闭液， 37℃下封闭1h；同（2）洗涤三次；（4）将上述制备的单链可变区抗体作为第一抗体，按每孔100
µ
l（浓度分别为1000、100、10、1
µ
g/ml）加入酶标板，37℃温箱孵育1h；以亲代抗体杂交瘤培养上清代替梯度稀释的scfv重组蛋白为阳性对照组，以pbs代替梯度稀释的 scfv 重组蛋白为阴性对照组。
78.（5）同（2）洗涤三次；碱性磷酸酶标记的鼠抗 his-tag单抗（1:4000稀释）作为第二抗体，按每孔50
µ
l加入酶标板，37℃温箱孵育1h；（6）同（2）洗涤三次；然后每孔加入100
µ
l pnpp反应液，暗处反应5~20min，每孔加入50
µ
l 2m的naoh，稳定3~5min即可用405nm工作波长测定od值。计算各孔与对照孔吸收值之比（p/n），当p/n≥2.1时为阳性。
79.结果：浓缩的wssv悬液作为底物中，1000、100
µ
g/ml孔的吸光值显著高于阴性对照，略高于阳性对照；10，1
µ
g/ml孔的吸光值尽管低于阳性对照孔，但仍高于阴性对照；此结果证实本发明单链可变区抗体能与天然wssv发生特异性结合反应（图4）。
80.实施例5：本发明单链可变区抗体的免疫印迹实验鉴定（1）十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳：
①
将浓缩的wssv悬液分别加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3~5min。
81.②
将
①
处理过的样品加入上样孔，每孔内加样品10
µ
l，在恒流条件下进行电泳；起始时用低电流(30-40ma)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流（50-70ma），直至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；凝胶部分用于转膜，部分放置在考马斯亮蓝染液中染色1h。
82.③
剪取一块与电泳凝胶大小相同的硝酸纤维素膜(孔径0.22
µ
m)，置于转移缓冲液（25mmol/l tris-base，192mmol/l甘氨酸，20%甲醇，ph 8.3）中润湿后，放在电泳过的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的“三明治”；
④
将“凝胶三明治”置入盛有转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极，凝胶面向阴极，200ma恒流条件下电泳5h；
⑤
转移完毕，取出硝酸纤维素膜。
83.（2）免疫印迹：
①
将硝酸纤维素膜用pbs洗10min，然后置于3%bsa封闭液中，37℃下封闭1h，；
②
用pbst洗3次，每次5min；
ꢀ③
将硝酸纤维素膜置于scfv 重组蛋白溶液（100μg/ml）中，37℃缓慢摇动1h；使用亲代抗体杂交瘤培养上清为阳性对照，pbs作为阴性对照。
84.④
同
②
洗涤三次；
⑤
将硝酸纤维素膜置于碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 igg fc 段抗体（1：3000）中，37℃缓慢摇动1h；
⑥
同
②
洗涤三次；
⑦
把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液（nbt-bcip发色液）中发色，直到颜色清晰为止；
⑧
用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
[0085] 同时把放置在考马斯亮蓝中的凝胶在沸水中煮至条带清晰，硝酸纤维素膜上发出紫褐色条带的位置对应到凝胶上，将对应的条带小心切下送去质谱。
[0086]
结果：本发明单链可变区抗体与浓缩的wssv悬液28kda蛋白发生特异性反应，显示紫褐色条带，与阳性对照条带位置相同，而阴性对照无条带显示（图5）。将28kda对应的凝胶条带切下质谱，质谱肽指纹图谱结果显示单链可变区抗体所识别的蛋白与wssv-vp28具有7段重复片段，确为wssv-vp28（图6）。
[0087]
实施例6：本发明单链可变区抗体的间接免疫荧光实验鉴定（1）感染 wssv 对虾虾鳃冰冻切片的制备：取感染 wssv 后濒死对虾虾鳃，用冰冻包埋剂（oct）包埋，制备虾鳃冰冻切片，切片于预冷的丙酮溶液放置 10 分钟后室温晾干。
[0088]
（2）滴加约50μl稀释的重组scfv蛋白（100μg/ml）于载玻片，置37℃湿盒中孵育1小时；用pbst洗3次，每次5分钟。使用亲代抗体杂交瘤培养上清为阳性对照，pbs作为阴性对照。
[0089]
（3）加入鼠抗his-tag抗体（1：3000）50μl，37℃湿盒中孵育1小时；用pbst洗3次，每次5分钟。
[0090]
（4）最后加入fitc标记的羊抗鼠igg fc段抗体（1：128）50μl，37
°
c暗处孵育1小时；用pbst洗3次，每次5分钟。
[0091]
（5）甘油封片，荧光显微镜下观察。
[0092]
结果：本发明单链可变区抗体与wssv发生特异性结合，呈现绿色荧光信号，而阴性对照则没有观察到荧光信号（图7）。
[0093]
实施例7：本发明单链可变区抗体的体内中和wssv效果的检测为探究原核表达的抗wssv-vp28中和单抗3b7的 scfv 重组蛋白能否在凡纳滨对虾体内中和wssv的感染，设置100、10、1
µ
g/ml的重组蛋白浓度，与浓缩的wssv 悬液等体积混合，于室温孵育2小时后分别注射感染对虾，通过计算对虾存活率来评估其中和活性。
[0094]
（1）实验分组，分别设置 1、10、100μg/ml 三个不同的重组蛋白浓度梯度，scfv 重组蛋白与等体积的 wssv 稀释液混匀，室温孵育 2小时，准备注射感染对虾。
[0095]
（2）凡纳滨对虾购于青岛胶州某养殖场，约8～10cm，养殖于不断充气的水槽内，每日投喂；按照 oie 推荐方法检测为 wssv 阴性；暂养一周后用于wssv 的攻毒实验。
[0096]
（3）取暂养一周后健康对虾分别注射等体积的wssv 与 scfv的混合液，通过腹节皮下注射，每只50μl，对照组注射同等体积的pbs，每个稀释度各30只对虾。
[0097]
（4）感染后每 24 小时观察记录对虾死亡情况，计算并绘制存活率曲线。
[0098]
结果：不同浓度的原核表达 scfv 重组蛋白与 wssv 室温孵育 2 小时后肌肉注射感染对虾，所有处理组在攻毒实验结束时（15 天）均达到100%死亡率，但实验组中，当scfv蛋白浓度相对wssv足量（10μg/ml、100μg/ml）时，对虾开始出现死亡的时间出现明显延迟，表明scfv重组蛋白具对wssv感染具有显著的中和效果（图8）。
[0099]
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。
技术特征：1.一种白斑症病毒单链可变区重组抗体，包括重链可变区、轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no: 3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no: 4所示。2.如权利要求1所述白斑症病毒单链可变区重组抗体，其特征在于：所述重组抗体的重链可变区的编码核苷酸序列如seq id no: 1所示，所述轻链可变区的编码核苷酸序列如seq id no: 2所示。3.如权利要求1所述白斑症病毒单链可变区重组抗体，其特征在于：所述重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3分别如seq id no: 7、seq id no: 9和seq id no: 11所示。4.如权利要求1所述白斑症病毒单链可变区重组抗体，其特征在于：所述轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3分别如seq id no: 13、seq id no: 15和seq id no: 17所示。5.一种用于生产权利要求1所述白斑症病毒单链可变区重组抗体的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的名称为：escherichia coli wssv-vp28-3b7-scfv，保藏号为：cctcc no：m 2022421。6.一种如权利要求5所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）通过双酶切、连接将白斑症病毒囊膜蛋白vp28中和单克隆抗体的单链可变区抗体基因与原核表达质粒pet-28a进行重组；（2）将重组质粒转化进入质粒表达大肠杆菌bl21中，获得表达单链抗体的重组菌株。7.一种如权利要求1-4任意一项所述白斑症病毒单链可变区重组抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）提取白斑症病毒囊膜蛋白vp28单克隆抗体杂交瘤细胞株3b7总rna并通过反转录pcr获得cdna模板；（3）利用cdna模版经pcr扩增重、轻链可变区基因序列；（4）通过重叠延伸 pcr并利用短肽 linker(gly4ser)3将重、轻链可变区连接，获得3b7单克隆抗体对应的单链抗体基因。8.一种如权利要求1-4任意一项所述白斑症病毒单链可变区重组抗体在制备鉴定白斑症病毒试剂中的应用。9.一种如权利要求1-4任意一项所述白斑症病毒单链可变区重组抗体在制备防治白斑症病毒感染研究试剂中的应用。
技术总结本发明公开了一种白斑症病毒单链可变区重组抗体及其制备方法和应用。通过克隆抗WSSV-VP28中和性单克隆抗体3B7的scFv基因序列，制备高效表达该蛋白的菌株WSSV-VP28-3B7-scFv，从而获得WSSV-VP28中和性单克隆抗体的单链可变区重组抗体。所述重组单链可变区抗体能够特异性结合并识别白斑症病毒囊膜蛋白VP28的天然蛋白，也能够识别白斑症病毒粒子，并且可以有效中和白斑症病毒，延缓病毒造成的对虾死亡。本发明制备的白斑症病毒囊膜蛋白VP28中和单克隆抗体的单链可变区抗体，为基于单链可变区抗体的白斑症病毒快速检测、诊断以及防治的研究提供了重要工具。及防治的研究提供了重要工具。
技术研发人员：唐小千 崔闯 战文斌 邢婧 绳秀珍 迟恒
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2022.05.07
技术公布日：2022/7/5
