1.本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及木蹄层孔菌发酵物及其制备方法。
背景技术：2.木蹄层孔菌(拉丁名为fomes fomentarius)，又名火绒层孔菌，隶属于担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，层孔菌属，是一种白腐菌，通常寄生在桦树、杨树、梨、苹果等阔叶树上，其子实体为药用部位，可用于消积、化淤。木蹄层孔菌是一种具有重要应用价值的真菌，其子实体和菌丝中均含有多种具有生物活性的物质，其代表物质就是木蹄多糖，中外医药研究成果证明，该多糖具有抗氧化、利尿、退烧、止痛、消炎、抗肿瘤等作用。
3.但是，关于木蹄层孔菌应用于化妆品方面的报道目前还是空白。发明人经过大量研究发现将木蹄层孔菌与珍珠协同发酵所得发酵物具有优良的皮肤抗炎修复作用以及美白效果，可以作为功效成分用于化妆品。
技术实现要素：4.在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
5.为解决上述技术问题，本公开提供的技术方案是：
6.第一方面，本公开提供一种木蹄层孔菌发酵物的制备方法，包括：
7.步骤一，将木蹄层孔菌经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液；
8.步骤二，将所述种子液接种至发酵底物进行发酵培养处理得到发酵液；所述发酵底物为土豆匀浆；
9.步骤三，对所述发酵液进行分离处理、灭菌处理得到上清液。
10.进一步地，上述木蹄层孔菌发酵物的制备方法中，所述发酵底物中还添加有珍珠粉；所述珍珠粉的含量为土豆匀浆的1-10wt％(比如2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％等)；更优选为1-5wt％(比如1.5wt％、2wt％、3wt％、4wt％、4.5wt％等)。
11.进一步地，上述木蹄层孔菌发酵物的制备方法中，所述土豆匀浆为新鲜土豆切块与水经匀浆机匀浆，溶解而成，其中，土豆的含量为1-5wt％(比如1.2wt％、1.5wt％、2.0wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％等)。
12.进一步地，上述木蹄层孔菌发酵物的制备方法中，所述土豆匀浆中还包括0.3wt％磷酸二氢钾，0.15wt％硫酸镁，0.05wt％葡萄糖，0.2wt％大豆肽。
13.所述发酵底物在接种前需经常规灭菌处理，比如在115℃下高温灭菌20min。
14.进一步地，上述木蹄层孔菌发酵物的制备方法中，所述种子液其菌丝体积百分比为80％以上(比如82％、85％、90％等)；所述鲍姆木层孔菌的接种比例，即所述菌液与所述
珍珠液体发酵培养基(发酵底物)的体积比为1％-10％(比如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％等)。
15.进一步地，所述木蹄层孔菌购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，选自以下至少一种：cgmcc5.1494，cgmcc 5.983,gcmcc5.96或gcmcc5.913。
16.进一步地，上述木蹄层孔菌发酵物的制备方法中，所述发酵培养处理的温度为25-35℃(比如26℃、28℃、30℃、32℃、34℃等)，时间为48-96h(比如52h、60h、72h、84h、88h、92h等)。
17.更进一步地，所述发酵培养处理在摇床中进行，摇床中转速为150r/min-200r/min(比如155r/min、160r/min、165r/min、170r/min、180r/min、190r/min、195r/min等)。
18.进一步地，上述木蹄层孔菌发酵物的制备方法中，所述分离处理采用离心方法；更优选地，离心转速为4500r/min-5500r/min(比如4600r/min、4800r/min、5000r/min、5200r/min、5400r/min等)，离心时间为10min-20min(比如12min、15min、18min等)。
19.第二方面，本公开提供一种由上述制备方法制得的木蹄层孔菌发酵物。上述木蹄层孔菌珍珠发酵物包括木蹄层孔菌发酵液及其干粉，干粉可以采用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得。
20.第三方面，本公开还提供一种含有上述木蹄层孔菌发酵物的化妆品。所述化妆品可以是面膜、精华液、面霜、乳液等。
21.相比于现有技术，本公开的有益效果包括但不限于：
22.1、本公开提供的木蹄层孔菌发酵物制备方法，通过将木蹄层孔菌接种于土豆匀浆中发酵，所得发酵物具有良好的皮肤抗炎保护修复作用；
23.2、本公开提供的木蹄层孔菌发酵物制备方法，通过将木蹄层孔菌与珍珠协同发酵，制得抗炎性能和美白性能优异的发酵物，可以作为功效成分加入到化妆品配方中，制备面膜、精华液、防晒霜、乳液等化妆品；
24.3、本公开提供的木蹄层孔菌发酵物作为化妆品功效成分具有功效性强、成本低、操作简单、绿色安全等特征，具有较强的实用性和推广价值。
附图说明
25.图1为实施例2中木蹄层孔菌珍珠发酵物的保护处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β；
26.图2为实施例2中珍珠土豆提取物的保护处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β；
27.图3为实施例2中不同浓度木蹄层孔菌珍珠发酵物的保护处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β；
28.图4为实施例2中木蹄层孔菌珍珠发酵物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β；
29.图5为实施例2中珍珠土豆提取物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β；
30.图6为实施例2中不同浓度木蹄层孔菌珍珠发酵物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β；
31.图7为实施例2中珍珠土豆提取物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-8；
32.图8为实施例2中不同浓度木蹄层孔菌珍珠发酵物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-8。
具体实施方式
33.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。再不背立本发明精神和实质的情况下，本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，属于本发明的范围。
34.在下文中将结合示范性实施例对本公开的技术方案进行描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.实施例中所用木蹄层孔菌为市售产品，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：cgmcc5.1494。
36.实施例1木蹄层孔菌发酵物的制备
37.(1)菌种活化：从保藏的木蹄层孔菌cgmcc5.1494(实验室编号5372)斜面中挑取菌落置于葡萄糖马铃薯琼脂培养基28℃培养7d活化，然后将得到的单菌落接种至100ml葡萄糖马铃薯液体培养基，28℃、180rpm培养7d，得到木蹄层孔菌种子液，菌丝体体积比占整个种子液的80％。
38.(2)发酵底物配制：按照下文表1的设置，分别添加一定质量比例的珍珠粉(1-10wt％，比如1wt％、5wt％、10wt％)至土豆匀浆液中，其中，土豆匀浆液的制备方法为20g的土豆切块加入1000ml的矿物质水(含有0.3％磷酸二氢钾，0.15％硫酸镁，0.05％葡萄糖，0.2％大豆肽)中加入匀浆机进行匀浆，溶解，分装。发酵底物在接种前灭菌处理。
39.(3)接菌和摇菌：按照体积百分比5％的接种量，将种子液5ml接种于装有100ml发酵底物的250ml三角瓶中，并且在摇床中发酵，转速为180r/min，培养温度为28℃，发酵时间为48h。
40.(4)离心：离心处理发酵液，4800r/min离心10min，取上清液，灭菌，所得样品编号参照表1。
41.本实施例还设有对照组，单纯发酵底物为上述2％土豆匀浆，其中，添加0.3％磷酸二氢钾，0.15％硫酸镁，0.05％葡萄糖，0.2％大豆肽。具体情况参见表1。
42.表1实施例1的发酵制度和实验组标号
43.实验组编号发酵底物接种情况td-0单纯发酵底物未接种td-5372单纯发酵底物接种5372菌种1％zz-td-5372含1％珍珠粉的发酵底物接种5372菌种5％zz-td-5372含5％珍珠粉的发酵底物接种5372菌种10％zz-td-5372含10％珍珠粉的发酵底物接种5372菌种1％zz-td含1％珍珠粉的发酵底物未接种5％zz-td含5％珍珠粉的发酵底物未接种
10％zz-td含10％珍珠粉的发酵底物未接种
44.对实施例1制得产物的主要成分，包括蛋白质、氨基酸、钙含量进行检测，结果参见下表2-表4。
45.表2原液或发酵原液样品氨基酸含量(umol/ml)
[0046][0047]
表3原液或发酵原液样品蛋白含量(ug/ml)
[0048][0049]
表4原液或发酵原液含钙量
[0050]
实验组编号钙(mg/kg)实验组编号钙(mg/kg)td-012.4td-53721.31％zz-td39.01％zz-td-5372179.55％zz-td33.15％zz-td-5372167.710％zz-td28.210％zz-td-537225.3
[0051]
实施例2木蹄层孔菌发酵物的功效性分析
[0052]
一、木蹄层孔菌发酵物对人皮肤成纤维细胞(hsf细胞)的毒性和保护作用
[0053]
1.氧化应激模型的建立
[0054]
将hsf细胞以每孔1
×
104个接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养过夜，弃去培养基，分别添加100μl含不同浓度h2o2(50～1000μmol
·
l-1
)的培养基，各组均设5个重复，对照组不添加h2o2。刺激1、2、3、4h后，采用mtt法，于490nm波长下测定各孔od值。得出hsf细胞存活率(参见图1)，选择细胞存活率为50％的双氧水浓度作为建模浓度。本实施例中，100μmol
·
l-1
的h2o2处理hsf细胞2h建模，细胞存活率为(49.74
±
2.99)％。
[0055]
2.样品对h2o2诱导的氧化应激模型的保护与修复作用检测
[0056]
将hsf细胞以每孔1
×
104个接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养过夜，实验设置空白对照组(control)、模型组(model)、各个样品组(为实施例1中各组原液或发酵原液)，每组设3个重复。
[0057]
修复作用检测，是指细胞损伤后，用样品进行作用，通过测定il-1β等含量来评价
样品是否具有修复作用。本实施例中修护处理组：先加入h2o2刺激2h后，每孔加入100μl样品培养24h；
[0058]
保护作用检测，是指样品作用细胞后，再次损伤细胞，观察细胞的il-1β的等分泌情况，判断是否样品是否具有保护作用。本实施例中保护处理组：先加入样品培养24h后，再以h2o2刺激2h。
[0059]
测试指标：il-1β、il-8(测试方法参考试剂盒说明书)。结果参见图1-图8。
[0060]
图1为实施例2中木蹄层孔菌发酵物的保护处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β。从图中可以看出，模型组(model)组il-1β极显著高于空白对照组(control)，表示模型建立成功；1％zz-td与模型组相比无显著性差异，接种发酵之后，1％zz-td-5372极显著低于模型组，表示接种后发酵液有助于降低il-1β的分泌，具有抗炎作用。
[0061]
图2为实施例2中珍珠土豆提取物的保护处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β。从图中可以看出模型组il-1β极显著高于空白对照组，表示模型建立成功，不同比例的珍珠土豆提取物对il-1β的影响变化差异较大。珍珠比例为0时，并没有降低il-1β的作用，表示无抗炎作用，添加1％～5％的珍珠粉的珍珠土豆提取物，具有极显著的降低il-1β的作用，表示具有抗炎作用，当珍珠添加比例增加到10％时，对il-1β的影响无显著性差异，不具有抗炎作用。
[0062]
图3为实施例2中不同浓度木蹄层孔菌珍珠发酵物的保护处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β。从图中可以看出模型组il-1β极显著高于空白对照组，表示模型建立成功，5372接种到无珍珠添加的土豆培养基中发酵产物，也能够显著性降低il-1β的分泌，具有抗炎作用；当按照比例添加1％～5％的珍珠后，抗炎作用更为显著；但是当添加到10％珍珠时接种5372并不能够降低il-1β。
[0063]
图4为实施例2中木蹄层孔菌珍珠发酵物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β。从图中可以看出模型组il-1β极显著高于空白对照组，表示模型建立成功，比较了相同珍珠添加比例的土豆提取物发酵前后对il-1β的作用，可知接种5372之后发酵产物，具有显著的降低il-1β的作用，而发酵之前并不具有降低il-1β的作用。
[0064]
图5为实施例2中珍珠土豆提取物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β。从图中可以看出模型组组il-1β极显著高于空白对照组，表示模型建立成功；5％珍珠添加比例的珍珠土豆提取物具有修复作用，而1％珍珠添加量和10％珍珠添加量的珍珠土豆提取物对il-1β无降低作用。
[0065]
图6为实施例2中不同浓度木蹄层孔菌珍珠发酵物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-1β。从图中可以看出模型组il-1β极显著高于空白对照组，表示模型建立成功；无珍珠添加的土豆培养基中无论是发酵前还是发酵后，均不能降低il-1β的分泌，不具有抗炎修复作用；当按照比例添加1％～5％的珍珠后，抗炎修复作用显著；但是当添加到10％珍珠时接种5372发酵产物并不能够降低il-1β。
[0066]
图7为实施例2中珍珠土豆提取物的修复处理抗炎作用检测结果示意图，指标：il-8。从图中可以看出模型组il-8极显著高于空白对照组，表示模型建立成功；10％珍珠添加量的珍珠土豆提取液具有降低il-8的作用，即具有修复作用，但是1％和5％珍珠添加量的土豆提取液无抗炎作用。
[0067]
图8为实施例2中不同浓度木蹄层孔菌珍珠发酵物的修复处理抗炎作用检测结果
示意图，指标：il-8。从图中可以看出，模型组il-8极显著高于空白对照组，表示模型建立成功；无珍珠添加的5372土豆发酵液具有降低il-8的作用，表示具有修复作用；珍珠添加量在1％～5％的土豆发酵液也具有降低il-8的作用，表示具有修复作用；当添加量提高到10％时，无修护作用(对il-8无显著影响)。
[0068]
二、木蹄层孔菌发酵物抑制酪氨酸酶活性测试
[0069]
1.实验原理
[0070]
黑色素的形成在于皮肤黑色素细胞组织中的酪氨酸在酪氨酸酶等酶的作用下经多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等中间体逐步转化为真黑色素；进而，黑色素细胞组织将黑色素转移到角蛋白细胞中，并随着角质层周期换新而脱落，人体肤色的差异主要取决于真黑色素和褐黑素的含量及分布，但当真黑色素过速增长和分布不均时，就会造成局部皮肤过黑或色素沉着。参与黑色素合成主要有三种酶：酪氨酸酶，多巴色素互变酶和二羟基吲哚羧酸氧化酶。酪氨酸酶属氧化还原酶，是黑色素合成的主要限速酶，其活性大小决定黑色素形成的数量，目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶活性达到美白作用，故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。l
–
酪氨酸酶与其底物l
–
酪氨酸可以发生催化反应。当在实验体系中添加了有l
–
酪氨酸酶活性抑制作用的试剂后，对催化反应可以产生抑制作用，通过测定添加试剂前后于475nm处的吸光光度，来评价试剂对l
–
酪氨酸酶活性的抑制率。
[0071]
2.实验准备
[0072]
1)pbs磷酸缓冲液配制(ph＝6.8)：取17.91g十二水磷酸氢二钠溶于蒸馏水定容于500ml；取7.8g二水磷酸二氢钠溶于蒸馏水定容于500ml；分别取两种溶液92.6ml和107.4ml配成200ml，ph6.8的pbs磷酸缓冲液。
[0073]
2)0.1mol/l的盐酸溶液：用hcl含量为36％-38％的hcl溶液0.862ml，蒸馏水定容至100ml。
[0074]
3)0.05％l-酪氨酸溶液：取0.05g l-酪氨酸，先溶于35ml 0.1mol/l的hcl溶液，再加入65ml ph6.8的pbs磷酸缓冲液，共100ml。
[0075]
4)酪氨酸酶溶液：用pbs缓冲液稀释酪氨酸酶粉末得到酪氨酸酶溶液，酶活为100u/ml。
[0076]
3.实验步骤
[0077]
1)c2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。
[0078]
2)c1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定c1吸光度值。
[0079]
3)按1)和2)同样方法，以t2调零测定t1吸光度值。
[0080]
4)计算发酵原液样品对酪氨酸酶的活性抑制率t(％)。
[0081]
表5酪氨酸酶抑制率实验试剂配比表
[0082]
编号l-酪氨酸样品pbs酪氨酸酶总体积c12ml——4ml1ml7mlc22ml——5ml——7mlt12ml2ml2ml1ml7mlt22ml2ml3ml——7ml
[0083]
4.数据处理
[0084]
公式：t(％)＝(c1-t1)/c1
×
100％。结果参见表6，从表中数据可以看出木蹄层孔菌与珍珠发酵，两者起到协同作用，对发酵物的美白性能有突出的改善。
[0085]
表6酪氨酸酶抑制率实验结果
[0086][0087][0088]
最后，还需要说明的是，在本公开中如有的话，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0089]
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。
技术特征：1.一种木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，包括：步骤一，将木蹄层孔菌经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液；步骤二，将所述种子液接种至发酵底物进行发酵培养处理得到发酵液；所述发酵底物为土豆匀浆；步骤三，对所述发酵液进行分离处理、灭菌处理得到上清液。2.根据权利要求1所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，所述土豆匀浆为新鲜土豆切块与水经匀浆机匀浆、溶解而成，其中，土豆的含量为1-5wt％。3.根据权利要求1或2所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，所述土豆匀浆中还包括0.3wt％磷酸二氢钾，0.15wt％硫酸镁，0.05wt％葡萄糖，0.2wt％大豆肽。4.根据权利要求1-3中任一项所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中还添加有珍珠粉；所述珍珠粉的含量为土豆匀浆的1-10wt％；优选为1-5wt％。5.根据权利要求1-4中任一项所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述种子液的菌丝体积百分比为80％以上。6.根据权利要求1-5中任一项所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述种子液与所述发酵底物的体积比为1％-10％。7.根据权利要求1-6中任一项所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述发酵培养处理的温度为25-35℃，时间为48-96h；优选地，所述发酵培养处理在摇床中进行，摇床中转速为150r/min-200r/min。8.根据权利要求1-7中任一项所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，所述分离处理采用离心方法；优选地，离心转速为4500r/min-5500r/min，离心时间为10min-20min。9.根据权利要求1-8中任一项所述的木蹄层孔菌发酵物的制备方法，其特征在于，所述木蹄层孔菌选自如下的至少一种：cgmcc5.1494，cgmcc 5.983，gcmcc5.96，gcmcc5.913。10.一种木蹄层孔菌发酵物，其特征在于，其根据权利要求1-9任一项所述的制备方法制得；所述木蹄层孔菌发酵物为木蹄层孔菌发酵液及其干粉。
技术总结本公开提供了一种木蹄层孔菌发酵物的制备方法，包括：步骤一，将木蹄层孔菌经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液；步骤二，将所述种子液接种至发酵底物进行发酵培养处理得到发酵液；所述发酵底物为土豆匀浆；步骤三，对所述发酵液进行分离处理、灭菌处理得到上清液。还披露了由此制得的木蹄层孔菌发酵物，包括木蹄层孔菌发酵液及其干粉。上述木蹄层孔菌发酵物制备方法，通过将木蹄层孔菌接种于土豆匀浆中发酵，所得发酵物具有良好的皮肤抗炎保护修复作用，可以作为功效成分加入到化妆品配方中。可以作为功效成分加入到化妆品配方中。可以作为功效成分加入到化妆品配方中。
技术研发人员：阮华君 陶俊俊 唐长明 詹国灿 顾佳峰
受保护的技术使用者：浙江长生鸟健康科技股份有限公司
技术研发日：2022.01.17
技术公布日：2022/7/5
