1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种与宁都黄鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用。
背景技术：2.睾丸是公鸡的重要生殖器官，具有产生精子和分泌雄激素的功能，发育良好的睾丸是获得出色繁殖力的基础。睾丸生长发育是一个精细又复杂的过程，受众多因素调控影响，其中占主导地位的是遗传调控。gh作为垂体分泌的主要激素之一，能够在性腺各种细胞中表达，参与机体性别分化、性激素合成、生殖细胞发生等生理过程，是一种调节机体性腺生长发育的重要激素。研究表明基因上游序列中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)丰富，一些位点与鸡生产性状显著关联。如果能够从gh基因5’调控区snps入手，筛选睾丸性状相关的遗传标记，可为鸡繁殖力的分子辅助选育积累理论基础，对种公鸡科学培育是非常必要的。
3.宁都黄鸡肉质鲜美、口感丰富，是优良的江西省地方品种。它具有早熟性，公鸡最早在20日龄左右开啼，55-70日龄性成熟，是地方鸡种质资源中性成熟最早品种之一。鸡的性成熟标志着繁殖活动的开始，是重要的经济性状。研究和培育早熟型个体是优质肉鸡育种的重要方向。生产中公鸡的性早熟主要通过鸡冠来判别，鸡冠作为重要的第二性征，其发育程度与性腺发育紧密关联，但尚缺乏宁都黄公鸡睾丸性状选育的分子标记。由此，运用分子遗传标记选择方法，筛选gh基因5’调控区与宁都黄公鸡睾丸性状相关联的snps，选育高繁殖力的优质鸡，有重要的商业价值。
技术实现要素：4.本发明的目的是提供一种与宁都黄鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明从gh基因5’调控区筛选得到了3个snp位点，并将其与宁都黄鸡睾丸性状进行相关性分析，从而得到了适合宁都黄鸡睾丸性状选育的分子标记。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种与宁都黄鸡睾丸性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述分子标记有三个snp位点，snp1位于所述分子标记的1039bp处，存在c/t突变，snp2位于所述分子标记的，653bp处，存在g/a突变，snp3位于所述分子标记的509bp处，存在t/c突变。
7.进一步地，所述snp1的基因型为tt、tc或cc，所述snp2的基因型为gg或ga，所述snp3的基因型为tt或tc。
8.本发明还提供一种上述分子标记的扩增引物对，所述引物对包括如seq id no.2所示的上游引物和如seq id no.3所示的下游引物。
9.本发明还提供一种利用上述的分子标记鉴别宁都黄鸡睾丸性状的方法，包括以下步骤：
10.(1)提取待测宁都黄鸡基因组dna，利用权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获得扩增产物；
11.(2)对所述扩增产物测序，检测snp1-3位点的基因型，当snp1位点的基因型为tc时，睾丸重量大于tt和cc；当snp2位点的基因型为gg时，睾丸重量大于ga；当snp3位点的基因型为tt时，睾丸重量大于tc。
12.进一步地，所述pcr扩增的体系为：dna模板1μl，2*pcr mix 7.5μl，混合引物2μl，h2o补至15μl。
13.进一步地，所述pcr扩增的扩增程序为：95℃3min；94℃15s，55℃15s，72℃30s，20个循环；72℃3min。
14.本发明还提供一种鉴别宁都黄鸡睾丸性状的试剂盒，包含上述的引物对。
15.本发明还提供一种利用上述的分子标记筛选具有优良睾丸性状的宁都黄鸡的方法，包括以下步骤：
16.(1)提取待测宁都黄鸡基因组dna，利用权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获得扩增产物；
17.(2)对所述扩增产物测序，检测snp1-3位点的单倍型组合，当snp1-3位点的单倍型组合为cgt/cat时，即为所述具有优良睾丸性状的宁都黄鸡。
18.本发明还提供一种筛选具有优良睾丸性状的宁都黄鸡的试剂盒，包含上述的引物对。
19.本发明还提供上述的引物对、鉴别宁都黄鸡睾丸性状的试剂盒或筛选具有优良睾丸性状的宁都黄鸡的试剂盒在宁都黄鸡遗传育种中的应用。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.本发明从gh基因5’调控区筛选得到了3个snp位点，并以3个snp为分子标记，检测这几个位点在宁都黄公鸡中的多态性，并分析其与睾丸性状的关系，旨在为地方鸡种公鸡选育及标记辅助选择提供依据。这种选育方法相较于现在的表型数据选育，不仅成本低、操作简便，并且结果准确。本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为实施例2的基因分型图。
具体实施方式
24.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
25.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的
中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
26.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
27.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
28.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
29.实施例1
30.采用pcr方法对相应的变异位点进行分型，根据被检鸡血液目的位点的基因型来选择优良睾丸性状的种公鸡，具体步骤如下：
31.步骤1：样本dna准备
32.(1)采集499只16周龄宁都黄公鸡血液，采用苯酚-氯仿抽提法提取血液dna。
33.(2)dna质量检测与稀释：取质量合格的dna样品，稀释至100ng/μl，-20℃保存备用。
34.步骤2：pcr扩增
35.pcr扩增引物：f:tggtgacaaaagcagtttc(seq id no.2)；r:agccgcacgaggtagaacgt(seq id no.3)。
36.将合成好的引物f和r分别用1*te溶解到浓度为10pmol，将溶解后的引物加到一起，混匀，离心。
37.配制pcr体系：dna 1μl(浓度为200ng/μl)，2*pcr mix 7.5μl，混合引物2μl，h2o补至15μl。
38.将配制的pcr总管分装到200μl pcr中，离心，每孔加入2μl dna样品，离心，上pcr仪。
39.扩增条件：
40.95℃3min；94℃15s，55℃15s，72℃30s，20个循环；72℃3min。
41.(4)测序分型
42.将扩增得到的pcr产物送生物公司测序。用dnastar软件的seqman模块读取实验结果，查看目的位点基因型。3个位点g.1272755、g.1272611、g.1272225的基因型分别表现为：g.1272755对应tt和tc，g.1272611对应gg和ga、g.1272225对应tt、tc和cc。
43.扩增产物序列(seq id no.1)：
44.tggtgacaaaagcagtttcggtgaccccagttccgctctgctgcctggctgctctcagcacagggcctcagcttcctttgaaatgccagaagcaaataaatatttctgcatttctgcgtggtgttaagcgctcagattggcttcaaggaagcagagagaagggttttgttttagttttatactgattttgcctggtttgtatcccaccgtcggggggtggttggacacacacacacctgcaggaaacattgcctcctctgtccaaacactgctggggtgctcacagcaaagcaagt
ggatgtgggaccaccagggaaggaaaggggaatggggggaagggggtaagagaagggaaggacataatgggaaagggaagggaagggaagggaagggggaaagaagaagggggaaaggaagggaaaggggaagggaaggattccctctttcaaatacaagcattttggaggttactgagcgtcatgctgctttctgacatgatcctttgggt[t/c]gcacacgtgggcacgtgaaaggcagaagaatgccaagctgatatttgagagctgcttatgcaactgtcattgtgccagtggcatgcaatctcagtcacacaccgccttctgccccactgaatgcaagcaggggaaacaaaaca[g/a]ccccctggcgcagtgcacagcctggaacatggcatctcctggctgcaagatagaaaatgttgtcttagcatgccatgcttttactgacagagctgcaggggcggcagggcagcggtgcagtggggctcagtgccgctgctgtggcatcgtcactaccagcagcagagctggggtgcccactgctctgctcacctctgacaaacatggacatatttaaacacgacctggagcagaaaaacacccccagatgttgctggctattgggtgaccggatacctgatagctgcaggacccactgttccctctcctctggggactgacatttacgcgcgcaaacaccgcggggcttctcggaacagctcgtttattaacgagctctcacacc[c/t]tgtgctccggtgatgatgctgctcttggaaatcagagccaaaccaggggcaggtcggacccacagccaggggggcaaagtgctgttagttccctatggggagtgaaagccctcctgcggttgtccatcccacgttctacctcgtgcggct.
[0045]
其中上述序列中，509bp、653bp和1039bp处分别存在t/c、g/a和c/t突变，即“[]”内标注的位点。
[0046]
步骤3：性状关联分析
[0047]
采用sas 9.0glm程序进行统计分析gh基因3个位点g.1272755、g.1272611和g.1272225与睾丸性状，包括16w左睾丸重、16w右睾丸重、总睾丸重、左睾丸指数(16w左睾丸重/活重)、右睾丸指数(16w右睾丸重/活重)和睾丸总重指数(16w总睾丸重/活重)的相关性。结果表明为3个位点与6个睾丸性状指标均显著相关，具体结果如下表1。
[0048]
表1gh基因5’调控区与宁都黄公鸡睾丸性状显著相关的3个snps
[0049][0050][0051]
注：表中数据为gh基因5’调控区3个snps与宁都黄公鸡6个睾丸性状关联分析显著性的p值。
[0052]
位点c1272225t对睾丸性状的影响达到显著水平(p＜0.05)，多重比较分析发现，tc基因型个体的6个睾丸性状均显著高于tt与cc基因型个体；从该位点对于睾丸性状的作用方式看，该位点主要是以显性方式起作用，杂合基因型tc有利于这个性状。位点g1272611a对睾丸性状的影响达到显著水平(p＜0.05)，多重比较分析发现，gg基因型个体的6个睾丸性状均显著高于ga基因型个体。位点t1272755c对睾丸性状的影响达到显著水平(p＜0.05)，多重比较分析发现，tt基因型个体的6个睾丸性状均显著高于tc基因型个体。
[0053]
表2 3个位点不同基因型与宁都黄鸡睾丸性状的相关性
[0054][0055]
注：表中数据为最小二乘均值
±
标准误；()内数字数字表示基因型的个体数；各位点基因型间相同字母表示差异不显著(p》0.05)，不同字母表示差异显著(p《0.05)；加性效应＝(aa-bb)/2；显性效应＝ab-(aa+bb)/2。
[0056]
利用phase 2.1软件构建3个多态位点t1272755c、g1272611a和c1272225t在宁都黄公鸡个体中的单倍型，频率大于1％的单倍型有4种，分别是h1(tgc，78.63％)、h2(tgt，13.53％)、h3(tac，3.53％)和h4(cgc，1.96％)；排除单倍型组合小于1％的个体，构建单倍型组合7种；占比例较大的单倍型组合是h1h1(tgc/tgc)、h1h3(tgc/tac)和h3h4(tac/cgc)。对这3组单倍型组合个体，进行性状相关性分析，发现这3种单倍型组合与左侧睾丸重量、左侧睾丸系数和睾丸系数显著关联，结合与睾丸性状相关的优势基因结合分析，h1h3个体为最优组合(表3)。
[0057]
表3三种单倍型组合与睾丸性状的相关性
[0058][0059]
注：各单倍型组合间相同字母表示差异不显著(p》0.05)，不同字母表示差异显著(p《0.05)。
[0060]
实施例2
[0061]
通过gh基因3个位点g.1272755、g.1272611、g.1272225基因型选择具有优良睾丸性状的鸡：
[0062]
1.样本采集与准备
[0063]
(1)孵化200只宁都黄种鸡蛋，出生当天鉴别雌雄；
[0064]
(2)采集雄性个体血液。
[0065]
2.dna提取
[0066]
基因组dna的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊f等，1998)，具体步骤如下：
[0067]
(1)取全血30μl置于1.5ml离心管，分别加入470μl 1
×
set缓冲液、12.5μl 20％sds和6μl 10mg/ml蛋白酶k，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
[0068]
(2)取出样本于1.5ml离心管，加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
[0069]
(3)取上清，再次加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
[0070]
(4)取上清，加入500μl氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；
[0071]
(5)取上清，加入1ml冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀dna，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
[0072]
(6)用1ml75％乙醇清洗dna一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
[0073]
(7)待dna完全干燥后加入300μl灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解dna；
[0074]
(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。
[0075]
3.目的位点分型
[0076]
pcr扩增
[0077]
将合成好的引物用1*te溶解到浓度为10pmol，将一组中的引物加到一起，混匀，离心。
[0078]
配制pcr体系：dna 1μl(浓度为200ng/μl)，2*pcrmix 7.5μl，混合引物2μl，h2o补至15μl。
[0079]
将配制的pcr总管分装到200μl pcr中，离心，每孔加入2μl dna样品，离心，上pcr
仪。
[0080]
扩增条件：
[0081]
95℃3min；94℃15s，55℃15s，72℃30s，20个循环；72℃3min。
[0082]
pcr扩增引物
[0083]
f:tggtgacaaaagcagtttc；
[0084]
r:agccgcacgaggtagaacgt。
[0085]
测序分型：
[0086]
将扩增得到的pcr产物送生物公司测序，采用下游引物r进行序列测序。用dnastar软件的seqman模块读取实验结果，查看目的位点基因型，采用chromas软件查看峰图，分型结果见图1。
[0087]
4.结果判定。
[0088]
根据3个snp位点基因分型为下游引物测序结果，3个位点对应基因型分别表现为：g.1272755为tt和tc，g.1272611为gg和ga、g.1272225为tt、tc和cc。依照基因型对个体进行标号，饲养至16周龄，屠宰实验数据表明(表4)，不同位点基因型组合个体的睾丸性状差异极显著，h1h3(tgc/tac)个体为最优组合，与预测结果相一致。
[0089]
表4不同单倍型的宁都黄鸡睾丸性状统计分析
[0090][0091]
注：表中数据为最小二乘均值
±
标准误；各单倍型间相同字母表示差异不显著(p》0.05)，不同字母表示差异显著(p《0.05)。
[0092]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术特征：1.一种与宁都黄鸡睾丸性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述分子标记有三个snp位点，snp1位于所述分子标记的1039bp处，存在c/t突变，snp2位于所述分子标记的，653bp处，存在g/a突变，snp3位于所述分子标记的509bp处，存在t/c突变。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述snp1的基因型为tt、tc或cc，所述snp2的基因型为gg或ga，所述snp3的基因型为tt或tc。3.一种权利要求1或2所述的分子标记的扩增引物对，其特征在于，所述引物对包括如seq id no.2所示的上游引物和如seq id no.3所示的下游引物。4.一种利用权利要求1或2所述的分子标记鉴别宁都黄鸡睾丸性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测宁都黄鸡基因组dna，利用权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获得扩增产物；(2)对所述扩增产物测序，检测snp1-3位点的基因型，当snp1位点的基因型为tc时，睾丸重量大于tt和cc；当snp2位点的基因型为gg时，睾丸重量大于ga；当snp3位点的基因型为tt时，睾丸重量大于tc。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的体系为：dna模板1μl，2*pcr mix 7.5μl，混合引物2μl，h2o补至15μl。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 30s，20个循环；72℃ 3min。7.一种鉴别宁都黄鸡睾丸性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物对。8.一种利用权利要求1或2所述的分子标记筛选具有优良睾丸性状的宁都黄鸡的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测宁都黄鸡基因组dna，利用权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获得扩增产物；(2)对所述扩增产物测序，检测snp1-3位点的单倍型组合，当snp1-3位点的单倍型组合为cgt/cat时，即为所述具有优良睾丸性状的宁都黄鸡。9.一种筛选具有优良睾丸性状的宁都黄鸡的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物对。10.一种如权利要求3所述的引物对、如权利要求7所述的试剂盒或如权利要求9所述的试剂盒在宁都黄鸡遗传育种中的应用。
技术总结本发明公开了一种与宁都黄鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用，涉及基因工程技术领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记有三个SNP位点，SNP1位于所述分子标记的509bp处，存在T/C突变，SNP2位于所述分子标记的，653bp处，存在G/A突变，SNP3位于所述分子标记的1039bp处，存在C/T突变。本发明从GH基因5’调控区筛选得到了3个SNP位点，并将其与宁都黄鸡睾丸性状进行相关性分析，从而得到了适合宁都黄鸡睾丸性状选育的分子标记，为地方鸡种公鸡选育及标记辅助选择提供了依据。据。据。
技术研发人员：马荆鄂 周敏 许继国 朱学农 谭玉文 杨艳北
受保护的技术使用者：南昌师范学院
技术研发日：2022.05.07
技术公布日：2022/7/5
