莴苣lswox3l基因在控制莴苣刺有无性状中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及莴苣lswox3l基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，本发明的基因来源于莴苣qtl qspn，位于莴苣的第5号染色体上。该基因控制莴苣刺有无的重要性状。
背景技术：2.莴苣(lactuca sativa l.)是我国栽培的重要的经济作物之一，具有多样的栽培类型和丰富的营养及经济价值。莴苣起源于地中海沿岸，其野生种为lactuca serriola。其野生种在进化为栽培种的过程中，有多种性状受到了驯化，包括分支减少、种子落粒性消失、苦味减少、茎部膨大等等。其中野生莴苣中大部分在茎部和叶脉富含大量的刺，该性状也是莴苣受驯化的重要性状之一。
3.野生莴苣大部分表皮存在多细胞木质化的毛状体—“刺”。其对莴苣具有保护作用，既可以防止动物及昆虫的取食还可以降低空气流通速度，降低水分蒸发，提高莴苣的抗旱性。由此可见，分离并利用控制莴苣刺形成的关键基因，不仅有助于阐明该性状在莴苣驯化机制，也可以为莴苣育种提供基因资源和理论支撑。
4.鉴于此，本发明利用图位克隆技术，分离了一个位于莴苣第5号染色体上，控制莴苣刺的qtl qspn，该基因为lswox3l，编码一种wuschel related homeobox 3相关的转录因子。基于连锁分析、自然群体中等位基因的效应分析、莴苣遗传转化分析和相关分子生物学分析，证实了该基因在在控制莴苣茎刺性状上的生物学功能及其作用机理。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供了莴苣lswox3l基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，所述莴苣lswox3l基因编码的蛋白质为seq id no.3所示，对应的cds序列为seq id no.2所示，基因全长为seq id no.1所示。
6.本发明的另一个目的在于提供了一种基于基因lswox3l分子标记的引物，所述引物为：te-f：5
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ctgatgatgaggaggataaaggtg-3’和gene-r：5
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tctaagcaagctttgactgc-3’，通过分子标记辅助选择方法，能够在苗期准确快捷的区分自然群体莴苣的表型。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
7.本发明是利用图位克隆技术分离位于莴苣第5染色体的莴苣刺性状的qtl qspn，并对候选基因进行生物学功能验证，将获得的该基因命名为lswox3l(在以下描述中，当出现qtl qspn时，即为lswox3l基因)。
8.本发明通过利用多刺莴苣pi491245(https://www.wur.nl/)和栽培无刺栽培莴苣w111(袁焕然，生菜叶裂与茎刺性状的遗传定位)杂交获得f1代杂交种后(图1)，进一步自交获得f2代群体。利用f2代群体，联合bsr-seq和图位克隆的方法，对控制莴苣刺有无的基因进行定位。对定位区间进行基因注释及候选基因分析，确定了候选基因，成功克隆了控制莴苣刺有无关键基因lswox3l，该基因为seq id no.1所示，cds序列为seq id no.2所示，编码的
蛋白质为seq id no.3所示。序列分析发现，无刺的栽培莴苣中存在一个失活的cacta-like的转座子插入到lswox3l基因的第一个外显子上使该基因丧失原有功能，表型为无刺。lswox3l与其栽培莴苣中的等位基因区别就在于其序列在栽培莴苣基因组中是否存在转座子的插入。
9.莴苣lswox3l基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，是将有刺莴苣中的lswox3l基因进行敲除，突变或者沉默，获得的转基因莴苣表现为无刺性状。
10.莴苣lswox3l基因分子标记引物在莴苣育种中的应用，是利用引物te-f：5
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ctgatgatgaggaggataaaggtg-3’和gene-r：5
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tctaagcaagctttgactgc-3’对待测植株的基因组进行检测，若能扩出1090bp的莴苣，则为无刺莴苣。
11.与现有技术相比，本发明具有以下优点
12.本发明在莴苣中克隆并证实了一个控制莴苣刺的qtl的基因qspn，证实了莴苣刺的有无与lswox3l基因的序列多态性之间的关系。
13.本发明为解释莴苣的驯化提供了新基因，也为菊科作物如莴苣的表皮性状表型改良，提供了新基因。
14.本发明为莴苣从头驯化育种提供了功能标记。
15.lswox3l是一个调控莴苣刺的重要基因，具有专一性，通过其序列的变异正调控莴苣刺的有无。pi491245和w111之间的表型差异，是由于一个cacta-like的te插入到w111的第一个外显子上，改变lswox3l基因编码的氨基酸序列进而是该基因丧失原有的功能。
附图说明
16.图1为多刺野生莴苣pi491245和无刺栽培莴苣w11的表型示意图。
17.图2为莴苣5号染色体的约307mb处有一个控制莴苣刺有无的遗传位点示意图。
18.图3为用于莴苣刺基因遗传定位的重组单株、标记以及基因模型示意图。
19.图4为利用te引物和基因特异引物对自然群体的10株栽培无刺莴苣叶14株野生有刺莴苣的检测。
20.图5为在多刺莴苣中敲除lswox3l基因可以使其表型变为无刺
21.图6纯合敲除lswox3l基因的植株lswox3l-ko#1，lswox3l-ko#2与lswox3l基因核苷酸序列的对比。
具体实施方式
22.以下实施实例进一步定义本发明，并描述了qspn的精细定位、克隆、功能验证、作用机理及分子标记开发的方法。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规分子生物学技术。
23.实施例1：lswox3l基因的克隆
24.为分析莴苣刺的有无的遗传规律，本发明采用多刺莴苣pi491245与栽培无刺莴苣w111(图1)进行杂交获得f1代杂交种f1代杂交种自交获得f2代群体。对214株f2代群体中的每一个个体进行刺有无的表型统计分析，结果显示，有刺和无刺的分离比是167：47≈3：1
(χ2＝0.39，p》0.05)，为单基因控制的性状。利用bsa+rna-seq技术分析，将lswox3基因初定位到5号染色体的304.36mb-311.96mb(图2)。
25.本技术利用图位克隆的方法，开发一系列分子标记，利用f2群体中的3500株个体，最终将基因定位于306.31mb和307.31mb之间，约1mb的范围内(图3)。对该区间序列进行注释分析，该区间共编码10个基因，其中基因lg5467832在两个混池中存在序列变异，该基因编码一个wuschel related homeobox 3相关的转录因子。因此，我们将该基因作为候选基因，并将其命名为lswox3l。
26.根据野生莴苣serriola参考基因组序列设计相关引物，ctab法提取pi491245植株叶片总dna，并测定dna的质量和浓度(表1所示，id:1)，获得的pcr产物送公司进行一代测序，测序结果为seq id no.1所示，cds序列为seq id no.2所示，编码的蛋白质为seq id no.3所示。pcr扩增程序：95预变性1min，然后以95℃变性15s，变温内循环60℃5s、62℃5s、64℃5s、66℃5s、68℃5s、70℃5s后跳转到60℃循环2次，70℃1s后跳转到95℃循环20次；第二轮变温内循环95℃变性15s，继续变温内循环60℃5s、62℃5s、64℃5s、66℃5s、68℃5s、70℃5s后跳转到60℃循环4次，70℃1s后跳转到95℃循环18次；最后68℃最终延伸3min。pcr扩增体系如下
[0027][0028][0029]
表1
[0030][0031]
实施例2：
[0032]
基因lswox3l在调控莴苣刺有无中的应用，其应用过程如下：
[0033]
本发明利用pi491245中的lswox3l基因的cds序列，进行crispr-cas9的grna设计。合成相关引物，在grna上加上相应的中间载体接头序列和bsai的酶切接头序列，加了接头的grna为lswox3l-bsf所示，以pcbc-dt1t2(xing et al.,2014)为模板进行四引物pcr扩增。pcr扩增程序：95℃预变性3min，然后以95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s,进行35个循环，最后72℃延伸5min。lswox3l-bsf/-bsr为正常引物浓度；lswox3l-f0/-r0稀释20倍(表1所示，所用引物id:3)，最后一步将扩增得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带纯化回收，连接至bsai酶切后线性化的phse401之上。反应程序：37℃3min；16℃4min；前两步循环50次；50℃5min；80℃5min。连接后过夜转化，筛选约5个阳性克隆送至tsingke公司进行测序。
[0034]
pcr反应体系如下：
[0035][0036]
酶切连接体系如下：
[0037][0038]
结合其对应的grna和载体序列拼接后获得了一种lswox3l的crispr-cas9的基因敲除载体，然后再用(表1所示，引物id：4)所示的引物对得到的克隆进行测序，确定grna连接到载体上。该载体具备camv35s启动子连接的egfp报告基因、多克隆位点和卡纳的筛选基因。
[0039]
将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌gv3101介导的莴苣遗传转化体系导入到pi491245
×
w111的高世代f7代纯合多刺材料中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有卡纳抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。(农杆菌介导的莴苣遗传转化体系参见：生菜散种与叶色性状的遗传分析及基因定位，贺淑萍硕士毕业论文)。
[0040]
t0代获得2株敲除lswox3l转基因的莴苣家系，一株纯合编辑，另外一株杂合编辑。t0代自交获得t1代种子，纯合编辑植株在t1代全部植株茎叶表型表现为无刺，杂合编辑材料的t1代表型存在有刺和无刺的表型分离且有刺植株和无刺植株的数量接近3:1。证实了lswox3l的敲除可以通过影响莴苣刺的发育改变其表型，并对每个株系的敲除事件进行sanger测序分析，lswox3l-ko#1(含有seq id no.4所示的突变序列)的编码序列存在一个
碱基的插入，lswox3l-ko#2(含有seq id no.5所示的突变序列)的编码区丢失了168bp(图6)。证实了lswox3l的敲除可以通过影响莴苣刺的发育(图5)。
[0041]
实施例3：
[0042]
lswox3l分子标记的引物在作为莴苣育种分子标记辅助选择中的应用，其应用过程如下：
[0043]
lswox3l基因的第一个外显子上(atg下游99bp处)插入了1个长5316bp的失活的cacta转座子(以下简称：te)是引起自然栽培群体中莴苣无刺变异的重要功能位点，因此根据该位点设计分子标记引物。利用转座子引物(te-f：5
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ctgatgatgaggaggataaa ggtg-3’)和基因特异引物(gene-r：5
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tctaagcaagctttgactgc-3’)组合检测te插入的存在(扩增出的片段长度1090bp)，
[0044]
对24株自然群体材料进行检测(图4)，其中10株栽培无刺莴苣(泳道2、3、4、5、6、8、12、13、17、19)，14株野生有刺莴苣(泳道1、7、9、10、11、14、15、16、18、20、21、22、23、24)。以转座子插入的等位基因作为优异的等位变异，它是控制莴苣无刺的功能位点之一，可应用于分子标记育种，予以选择保留。
技术特征：1.编码seq id no.3所示的蛋白的基因或seq id no.3所示蛋白在控制莴苣刺的有无中的应用。2.根据权利要求所述的应用，所述的基因为seq id no.1或seq id no.2所示。3.分子标记引物在莴苣育种中的应用，所述引物为te-f：5
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ctgatgatgaggaggataaaggtg-3’和gene-r：5
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tctaagcaagctttgactgc-3’。4.根据权利要求1所述的应用，应用过程包括将有刺莴苣中的编码seq id no.3所示的蛋白的基因进行敲除，沉默或突变。5.根据权利要求1所述的应用，应用后获得的莴苣含有seq id no.2所示基因或seq id no.3所示蛋白。
技术总结本发明属于植物工程技术领域，公开了莴苣LsWOX3L基因在控制莴苣刺有无性状中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过CRISPR-Cas9技术在茎和叶脉均多刺的莴苣中敲除LsWOX3L基因的结果表明，丢失功能的LsWOX3L基因能够使受体莴苣表型变为无刺。进一步分析表明在无刺的栽培莴苣中存在一个失活的CACTA-like的转座子插入到LsWOX3L基因的第一个外显子上使该基因丧失原有功能。LsWOX3L基因的克隆为研究植物的毛状体的发育调控开辟了新的方向，同时也为莴苣的品种选育提供了基因资源和理论指导。提供了基因资源和理论指导。
技术研发人员：陈炯炯 孙培楠 章成君 俞国平
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2022/7/5
