桃褐腐病菌lamp检测引物及其应用
技术领域
1.本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及桃褐腐病菌的lamp检测引物及其应用，用于桃褐腐病菌的快速、灵敏和特异分子检测，同时可应用于桃褐腐病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
背景技术：2.由链核盘菌属真菌（monilinia spp.）侵染引起的桃褐腐病是严重影响桃树产量和质量的重要真菌病害之一，该病害在世界范围内广泛分布，在温润潮湿地区发生尤为严重，主要危害成熟果实，造成大量烂果。据报道，引起桃褐腐病的病原真菌主要有3种，即美澳型核果褐腐菌（monilinia fructicola）、核果褐腐菌（monilinia laxa）和仁果褐腐菌（monilinia fructigena）。虽然3种病原菌均可在桃上侵染引起褐腐病，但3种病原菌的分布和寄主偏好存在一定的差异，其中美澳型核果褐腐菌（monilinia fructicola）在我国分布范围最广，是桃褐腐病菌优势菌群，该病原菌能侵染所有李属（prunus）栽培作物，除了危害桃果实之外，还危害李、杏、樱桃等核果类果树及苹果和梨等仁果类果树，侵染果树花、茎和果实，引起花朵、果实腐烂和枝条枯死，发病严重地区，果实采摘后的损失甚至高达90%，导致严重的经济损失。因此，加强桃褐腐病防治，对于挽回经济损失、提高果农收入和促进桃产业健康发展等具有重要意义。
3.病原菌的准确鉴定与前期检测是病害有效防控的基础，病原菌传统的鉴定和检测方法从发病组织中分离病原菌、采用形态学特征对病原菌进行初步鉴定、再通过柯赫氏法则对病原菌进行最终确定。这种传统鉴定方法不仅耗时、费力，而且鉴定人员的经验还将影响结果的准确必，显然不能满足病害大批量和准确鉴定需求。随着科学技术的不断发展，pcr系列技术以其快速、准确和特异性强等优势在植物病害的鉴定、诊断和快速检测中广泛地得到了应用，但该方法也存在了一些缺陷，如需要依赖精密、贵重的pcr扩增仪、凝胶成像系统等仪器设备，操作步骤较为复杂，操作人员需具备一定的分子生物学技术等，这些缺陷使得该技术在经济欠发达地区和基层农业部门的使用、推广受到很大的限制。
4.目前应用于植物病原微生物快速、准确检测的最新技术为环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，lamp）技术。该技术特异性强，因为所设计的检测引物是针对靶标基因6个特异区，此外，lamp方法对设备要求低，仅需要简单的水浴锅或其它加热设备，同时该方法反应时间短，具高效性，整个反应在1小时内完成，并且可用肉眼观察判断结果。截至目前为止，尚未见有lamp技术用于桃褐腐病菌检测的相关报道。本发明的目就是设计桃褐腐病菌的lamp检测引物，并基于所设计引物的基础上，建立桃褐腐病菌lamp检测体系。
技术实现要素：5.为解决现有技术中对桃褐腐病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流
行的问题，以及现有pcr分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，本发明提供了一种桃褐腐病菌的lamp检测引物及其应用，本发明检测周期短、准确性高、灵敏性高、可肉眼观察检测结果。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：1. 桃褐腐病菌lamp检测特异性引物的设计：通过测定桃褐腐病菌（美澳型核果褐腐菌monilinia fructicola）和其它病原菌的internal transcribed spacer （its）序列，对its序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primer software explorer v5 ( https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html; eiken chemical co., japan )设计桃褐腐病菌特异性lamp引物组，其包括f3、b3、fip和bip4条引物，引物序列如下：f3：5
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ctttttattaatgtcgtctgagtac-3’，b3：5
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taccaagctg tgcttgag-3’，fip：5
’‑
atttcgctgcgttcttcatcg-tagttaaaactttca acaacggatc-3’，bip：5
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tgcagaattcagtgaatcatcgaat-aaatgacg ctcgaacagg-3’。
7.2. 桃褐腐病菌lamp检测方法的建立，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组dna：用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab 法进行提取基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900
ꢀµ
l 2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% ctab；100 mmol/l tris-hcl, ph 8.0；20 mmol/l edta，ph8.0；1.4 mol/l nacl）和90
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l sds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000 r
·
min-1
离心15 min；取上清液700
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l，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r
·
min-1
离心9 min；取上清液500
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l，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r
·
min-1
离心5 min；取上清液350
ꢀµ
l，加入1/10体积3 mol
·
l-1 naac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r
·
min-1
离心5 min；弃去上清液，加入700
µ
l 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60
ꢀµ
l te（10 mmol/l tris-hcl，0.1 mmol/l edta，ph 8.0） 溶液进行溶解，得到 dna 溶液，用紫外分光光度计检测 dna 浓度并稀释至100 ng/
µ
l待用；用于检测植物叶部组织中是否存在桃褐腐病菌时，采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10
µ
l 0.5 mol/l naoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5
ꢀµ
l加入495
µ
l 0.1 mol/l tris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0
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l作为pcr模板进行扩增；（2）lamp反应体系的建立：以步骤（1）提取的dna为模板，利用外侧引物f3/b3和内侧引物fip/bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25 μl，包括4 μm引物f3和b3各1.0 μl，32 μm引物fip和bip各1.0 μl，lamp反应混合液（40 mm tris-hcl，20 mm (nh4)2so4，20 mm kcl，16 mm mgso4，1.6 mol/l甜菜碱(betaine)，2.0 mm dntps，0.2wt.% trion x-100）12.5μl，8 u bst聚合酶1.0 μl，dna模板1.0 μl，用灭菌超纯水补足至25μl；（3）lamp反应条件：64.5 ℃温育60 min；（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应
的扩增产物中加入显色剂sybr greenⅰ1.0 μl，在自然光照下反应产物为蓝绿色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在桃褐腐病菌，在自然光照下反应产物为橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在桃褐腐病菌。
8.本发明的有益效果在于：本发明建立了桃褐腐病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的lamp检测技术体系，可用于桃褐腐病菌的检测，或用于桃褐腐病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。
9.与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势和积极效果：1、特异性强：本发明针对桃褐腐病菌its序列的6个区域设计了4个特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性极高；2、灵敏度高：本发明对桃褐腐病菌的检测灵敏度在dna水平上可达到10fg/ μl，具有很高的灵敏性；3、检测高效快速：应用本发明检测方法，可在1～1.5h 得到检测结果，而以往的pcr或巢式pcr检测需4～6h才可得到检测结果，本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速；4、应用性强：本发明lmap扩增反应在一个温度下扩增，不需要昂贵的pcr扩增仪，只要简单的水浴锅或加热设备即可，检测结果可通过肉眼观察，且操作简单，便于基层推广使用；5、成本低：本方法无需pcr仪等昂贵、精密的试验仪器设备，仅需要恒温水浴锅或其它恒温设备，且实验过程所用均为常规试剂，价格低廉。
附图说明
10.图1为本发明桃褐腐病菌lamp特异引物在internal transcribed spacer（its）基因序列中的位点。
11.图2为本发明桃褐腐病菌的lamp特异性检测结果。图2a为自然光照下的检测结果，其中，1-3呈蓝绿色；图2b为波长365nm紫外光照射下的检测结果，其中，1-3呈白色浑浊沉淀状。图中1-3为桃褐腐病菌（monilinia fructicola），4-7分别桃炭疽病菌（colletotirchum gloeosporioides）、桃炭疽病菌（colletotrichum acutatum）、桃细菌性穿孔病菌（xanthomonas campestris pv. pruni (smith) dye.）、番茄灰霉病菌（botrytis cinerea），8为阴性对照。
12.图3为本发明桃褐腐病菌lamp检测灵敏性。图3a为自然光照下的检测结果，其中，1-4呈蓝绿色；图3b为波长365nm紫外光照射下的检测结果，其中，1-4呈白色浑浊沉淀状。图中1-7模板dna浓度分别为10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10ag，8为阴性对照。
13.图4为本发明检测方法对发病果实中桃褐腐病菌的检测。图4a为自然光照下的检测结果，其中，4-5呈蓝绿色；图4b为波长365nm紫外光照射下的检测结果，其中，4-5呈白色浑浊沉淀状。图中1为阳性对照，2、6-8为未发病健康桃果实，3-4为桃褐腐病发病桃果实，5为阴性对照。
具体实施方式
14.以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
15.实施例 1：桃褐腐病菌环介导等温扩增（lamp）检测特异性引物的设计及引物特异性验证1.供试菌株基因组dna的提取采用ctab 法提取供试菌株（表1）基因组 dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900
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l 2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% ctab；100 mmol/l tris-hcl, ph 8.0；20 mmol/l edta，ph8.0；1.4 mol/l nacl）和90
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l sds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000 r
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离心15 min；取上清液700
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l，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r
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离心9 min；取上清液500
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l，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r
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离心5 min；取上清液350
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l，加入1/10体积3 mol
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l-1 naac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r
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离心5 min；弃去上清液，加入700
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l 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60
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l te（10 mmol/l tris-hcl，0.1 mmol/l edta，ph 8.0） 溶液进行溶解，得到 dna 溶液，用紫外分光光度计检测 dna 浓度并稀释至100 ng/
µ
l待用。
16.表1 供试菌株
2. 桃褐腐病菌环介导等温扩增（lamp）特异引物的设计通过测定桃褐腐病菌（美澳型核果褐腐菌monilinia fructicola）和其它病原菌的internal transcribed spacer （its）序列，对its序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primer software explorer v5 ( https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html; eiken chemical co., japan )设计桃褐腐病菌特异性lamp引物组。引物组由4条引物组成，包括2条外引物（f3、b3）和2条内引物（fip、bip）。其引物序列及其在its基因序列中的位点详见表2和图1。
17.表2用于monilinia fructicola lamp检测的引物
3. 桃褐腐病菌lamp检测方法的建立及引物特异性验证以表1供试菌株的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25 μl，包括4 μm引物f3和b3各1.0 μl，32 μm引物fip和bip各1.0 μl，lamp反应混合液【40 mm tris-hcl，20 mm (nh4)2so4，20 mm kcl，16 mm mgso4，1.6 mol/l甜菜碱(betaine)，2.0 mm dntps，0.2% trion x-100】12.5μl，8 u bst聚合酶1.0 μl，dna模板1.0 μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：64.5℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybr greenⅰ1.0 μl，在自然光照下反应产物为蓝绿色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在桃褐腐病菌，在自然光照下反应产物为橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在桃褐腐病菌。
18.4.引物特异性验证结果lamp扩增结果表明，供试的菌株中只有桃褐腐病菌反应产物在自然光照下反应产物为蓝绿色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状，其余供试菌株反应产物在自然光照下反应产物均为橙色且在波长为365nm的紫外光照射下呈透明状（附图2），说明所设计的桃褐腐病菌引物f3/b3和引物fip/bip可以将桃褐腐病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于桃褐腐病菌快速可靠的检测和鉴定。
19.实施例2：桃褐腐病菌环介导等温扩增（lamp）检测灵敏度测定1.不同浓度基因组dna的制备用无菌超纯水对桃褐腐病菌基因组dna进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；2. lamp检测方法灵敏度测定及结果观察以不同浓度的桃褐腐病菌基因组dna为模板，利用引物f3/b3和引物fip/bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25 μl，包括4 μm引物f3和b3各1.0 μl，32 μm引物fip和bip各1.0 μl，lamp反应混合液【40 mm tris-hcl，20 mm (nh4)2so4，20 mm kcl，16 mm mgso4，1.6 mol/l甜菜碱(betaine)，2.0 mm dntps，0.2% trion x-100】12.5μl，8 u bst聚合酶1.0 μl，不同浓度dna模板1.0 μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：64.5 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybr greenⅰ1.0 μl，在自然光照下反应产物为蓝绿色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，在自然光照下反应产物为橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性。
20.3. lamp扩增灵敏度检测结果
lamp扩增灵敏度检测结果表明，10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μl浓度的桃褐腐病菌基因组dna反应产物在自然光照下为蓝绿色和且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊状沉淀，其余浓度及阴性对照反应产物在自然光照下均为橙色且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状，说明所建立的的桃褐腐病菌lamp检测体系对桃褐腐病菌基因组dna的检测灵敏度可达10 fg/μl（附图3）。
21.实施例3：发病果实中桃褐腐病菌的lamp检测样品采集：从福建古田、福安、闽清采集桃褐腐病发病症状典型的果实及健康果实带回实验室备用；植物组织dna的提取：采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10
µ
l 0.5 mol/l naoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5
ꢀµ
l加入495
µ
l 0.1 mol/l tris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0
ꢀµ
l作为pcr模板进行扩增。
22.扩增检测及观察：以上述提取的dna为模板，利用引物f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25 μl，包括4 μm引物f3和b3各1.0 μl，32 μm引物fip和bip各1.0 μl，lamp反应混合液【40 mm tris-hcl，20 mm (nh4)2so4，20 mm kcl，16 mm mgso4， 1.6 mol/l甜菜碱(betaine)，2.0 mm dntps，0.2% trion x-100】 12.5μl，8 u bst聚合酶1.0 μl，dna模板1.0 μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：64.5℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybr greenⅰ1.0 μl，在自然光照下反应产物为蓝绿色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在桃褐腐病菌，在自然光照下反应产物为橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在桃褐腐病菌。
23.检测结果：检测结果（附图4）表明，桃褐腐病发病果实通过lamp扩增，在自然光照下反应产物为蓝绿色且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀，说明存在桃褐腐病菌，而健康果实及阴性对照通过lamp扩增，在自然光照下反应产物为橙色且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状，说明不存在桃褐腐病菌，该套技术能用于植物组织中桃褐腐病菌的快速分子检测。
24.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
技术特征：1.一种桃褐腐病菌lamp检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：f3：5
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ctttttattaatgtcgtctgagtac-3’；b3：5
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taccaagctgtgcttgag-3’；fip：5
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atttcgctgcgttcttcatcg-tagttaaaactttcaacaacggatc-3’；bip：5
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tgcagaattcagtgaatcatcgaat-aaatgacgctcgaacagg-3’。2.一种利用如权利要求1所述的引物进行桃褐腐病菌lamp检测的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：1）提取待测样品基因组dna；2）lamp反应体系的建立：lamp检测反应体系为25 μl，以步骤1）提取的dna为模板，反应体系包括4 μm引物f3和b3各1.0 μl，32 μm引物fip和bip各1.0 μl，lamp反应混合液12.5μl，8 u bst聚合酶1.0 μl，dna模板1.0 μl，用灭菌超纯水补足至25μl；3）lamp反应条件：64.5℃温育60 min；4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待lamp反应结束后，将1.0 μl显色剂sybr greenⅰ混合于lamp反应的扩增产物中，在自然光照下反应产物为蓝绿色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在桃褐腐病菌，在自然光照下反应产物为橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在桃褐腐病菌；其中，所述的lamp反应混合液由以下组分组成：40mm tris-hcl，20mm (nh4)2so4，20mm kcl，16mm mgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mm dntps，0.2% trionx-100。3.如权利要求1所述的桃褐腐病菌lamp检测引物在桃褐腐病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。4.如权利要求2所述的桃褐腐病菌lamp检测方法在桃褐腐病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。
技术总结本发明公开了一种桃褐腐病菌LAMP检测引物及其应用，本发明以桃褐腐病菌ITS基因为检测靶标，设计和筛选一套特异性检测的引物组，其由4条特异性引物F3、B3、FIP、BIP组成。本发明还提供了适用于该引物组的LAMP检测方法，包括以下步骤：1）提取待测样品DNA；2）使用本发明提供的引物组合物对待测样品DNA进行环介导等温扩增；3）结果检测，在自然光照下反应产物为蓝绿色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性。本发明解决了现有技术检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、操作复杂、仪器设备要求高的缺陷，能快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度、低成本地检测到桃褐腐病菌。病菌。
技术研发人员：林花 吴伯文
受保护的技术使用者：福建农业职业技术学院
技术研发日：2022.01.17
技术公布日：2022/7/5
