1.本发明属于电化学分析技术领域，更具体地说，本发明涉及一种铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法。
背景技术：2.血糖检测对糖尿病的诊断和治疗具有重要意义，电化学生物传感器以其高灵敏度、快速的测定速度和高的选择性以及低成本而引起了人们对血清样品中葡萄糖浓度检测的极大兴趣。近年来，半导体纳米结构材料由于其独特的化学、物理和机械性能而受到了广泛的关注。硫化铋(bi2s3)作为一类重要的半导体，具有低的带隙能，高的吸附系数和合理的入射光子至电子的转换效率，被广泛应用于电子光电器件、储氢材料、锂离子电池及传感器中。到目前为止，研究人员已经用溶剂热方法、化学沉积法、超声辐射辅助方法及机械化学合成方法合成了不同形貌的bi2s3材料。铂(pt)具有较好导电性和催化性能。本发明结合复合软模板策略与微波法，利用硫脲作为硫源，硝酸铋作为铋源，氯铂酸为铂源，利用ctab-偏苯三酸为软模板制备新型的刺猬状硫化铋(hs-bi2s3)，结合微波法制备铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料(pt nps/hs-bi2s3)。首次将所得的hs-bi2s3纳米结构用于gox的固定化，以构建灵敏的葡萄糖生物传感器。
3.葡萄糖电化学生物传感器是利用固定在电极表面的葡萄糖氧化酶(gox)的直接电子转移(det)，根据待测物浓度对电流信号变化的影响关系葡萄糖含量检测。本发明所制备的葡萄糖电化学生物传感器可以提高检测灵敏度。
4.用于促进电极表面的葡萄糖氧化酶(gox)的直接电子转移的材料有例如碳纳米材料、贵金属纳米颗粒和半导体纳米结构。其中，半导体纳米结构材料具有许多特殊性能，如：高比表面积、高催化活性、超小尺寸和生物兼容性，同时，由于其独特的结构、组分和性质而广泛应用于生物传感器中。由于bi2s3材料具有强大的吸附能力、特殊的结构、高稳定性和低电阻等特性，已成为构建光电化学生物传感器的潜在材料。铂(pt)具有较好导电性和催化性能。然而，到目前为止，尚未报道过pt nps/hs-bi2s3可用于电化学葡萄糖生物传感应用。本发明所制备的pt nps/hs-bi2s3具有现出优异的高比表面积、良好的生物相容性、良好催化性和导电性。基于该纳米材料的优良性能，可以很好的应用在生物传感器领域。
技术实现要素：5.为了克服上述缺陷，本发明提供一种基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器的制备方法，其基本思路为：先合成刺猬状硫化铋纳米材料，进一步合成铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料。利用包埋法将葡萄糖氧化酶固定于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料上并修饰清洗吹干后的玻碳电极，然后晾干，再滴涂nafion溶液，低温晾干后获得葡萄糖电化学生物传感器。以该传感电极为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在磷酸缓冲液测试液中，加入不同浓度葡萄糖，会引起相应电流信号增大。利用电流信号变化与葡萄糖浓度之间的直接线性关系，可用于高灵敏
的电化学生物传感器检测血糖含量。
6.具体采用如下的技术方案：
7.一种铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，利用两步法制备得到铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料，利用铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料修饰玻碳电极固定葡萄糖氧化酶分子，制备得到该葡萄糖电化学生物传感器。
8.利用铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料修饰玻碳电极固定葡萄糖氧化酶分子，，包括以下步骤：
9.(1)将铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料超声分散于去离子水，得到均匀的分散液；
10.(2)取步骤(1)中的铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料分散液加入到定量的葡萄糖氧化酶中，震荡分散得到均匀的混合液；
11.(3)将玻碳电极依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，接着将玻碳电极用氧化铝粉抛光，用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，然后在氮气下吹干；
12.(4)取步骤(2)中制得的固定了葡萄糖氧化酶的铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的混合溶液滴涂于步骤(3)中所得洁净的玻碳电极表面，并置于冷藏低温的环境下晾干；
13.(5)在步骤(4)所修饰后的玻碳电极表面滴涂nafion溶液，置于冷藏低温的环境下晾干，得到该葡萄糖电化学生物传感器。
14.优选的，步骤(1)中，所述铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的浓度为0.5-2mg/ml。
15.优选的，步骤(2)中，所述刺猬状硫化铋纳米材料分散液用量为100μl,所述葡萄糖氧化酶质量为1mg。
16.优选的，步骤(3)中，所述的氧化铝粉粒径为0.05mm。
17.优选的，步骤(4)中，所述冷藏低温为4℃；步骤(5)中，所述nafion膜溶液的浓度为0.5％-1％。
18.优选的，步骤(7)中，所述抗原浓度为0.005～1μg/ml。
19.优选的，步骤(8)中，所述au@pd-ab2浓度为10μg/ml。
20.优选的，步骤(9)中，所述苯胺和h2o2的混合溶液中苯胺的浓度为30mm，h2o2的浓度为5mm。
21.优选的，步骤(2)～(9)中，通入流速为5μl/min，温育时间为30min。
22.优选的，利用两步法制备得到铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料：
23.复合软模板法合成刺猬状硫化铋纳米材料的制备工艺如下：
24.在烧杯中，分别加入偏苯三甲酸、十六烷基三甲基溴化铵ctab、硫脲、硝酸铋水溶液和二次蒸馏水，将体系超声30min，混合使其均匀后得淡黄色溶液，将溶液转入聚四氟乙烯材质的反应釜内衬中，将内衬放入钢制材料的反应釜内并拧紧反应釜上盖，然后将反应釜置于恒温鼓风干燥箱中设置温度为120℃，反应12h；反应结束后取出反应釜，自然冷却后将反应釜内衬底部的黑色沉淀bi2s3取出，以8000rpm离心，并依次用蒸馏水和无水乙醇各洗涤3次，最后于60℃条件下真空干燥12h得黑色粉末；
25.微波法合成铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的制备工艺如下：
26.将60.0mg刺猬状硫化铋溶解于20.0ml的乙二醇中并超声10min，在超声下，逐滴加
入2190μl的氯铂酸，以1mol l-1
的naoh将溶液ph调至11.0，接着放入微波炉中加热6min；待反应体系自然冷却至室温后取出，抽滤，用去离子水和无水乙醇清洗数次，抽滤完将样品置于80℃烘箱内干燥12h。
27.本发明至少包括以下有益效果：
28.(1)本发明使用的材料为铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料，一方面刺猬状硫化铋纳米材料具有高比表面积、良好的生物相容性和优异的光电化学性能等优点，能够在界面上固定更多的葡萄糖氧化酶，大大地促进电极表面与葡萄糖氧化酶间的电子转移。另一方面，铂纳米粒子具有较好的导电性和催化性，铂纳米粒子与刺猬状硫化铋复合可协同促进葡萄糖氧化酶对葡萄糖的催化及电子转移。本发明合成的铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料界面具有大的比表面积，良好的生物相容性，较好的导电性和催化性，表现出优异的光学性能。
29.(2)另外，所制备的电化学传感器操作简单，抗干扰性好，合成的较好的导电性和催化性大大地促进电极表面与葡萄糖氧化酶间的电子转移以提高灵敏度，本发明可实时且灵敏检测。
30.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
31.图1为本发明基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器的制备示意图；
32.图2为本发明所制备刺猬状硫化铋纳米材料、铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料与以铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料固定gox后的电镜图；
33.图3为本发明基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器的可行性研究图；
34.图4为本发明基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器检测葡萄糖标准样品的线性曲线。
具体实施方式
35.以下将参照附图，通过实施例方式详细地描述本发明的技术方案。在此需要说明的是，对于这些实施例方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
36.本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，单独存在b，同时存在a和b三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，a/和b，可以表示：单独存在a，单独存在a和b两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”关系。
37.本发明提供一种基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器的具体实施方法，利用两步法制备得到铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料，利用其修饰玻碳电极固定葡萄糖氧化酶分子，制备得到该葡萄糖电化学生物传感器。
38.复合软模板法合成刺猬状硫化铋纳米材料：
39.在50ml烧杯中，分别加入0.0210g偏苯三甲酸、0.0365g ctab、0.3806g硫脲(5.0
×
10-4
mol)、0.50ml(0.20m)的硝酸铋水溶液和9.50ml二次蒸馏水，将体系超声混合30min,使其均匀后得淡黄色溶液，将溶液转入聚四氟乙烯材质的反应釜内衬中，将内衬放入钢制材料的反应釜内并拧紧反应釜上盖，然后将反应釜置于恒温鼓风干燥箱中设置温度为120℃，反应12h。反应结束后取出反应釜，自然冷却后将反应釜内衬底部的黑色沉淀bi2s3取出，以8000rpm离心，并依次用蒸馏水和无水乙醇各洗涤3次，最后于60℃条件下真空干燥12h得黑色粉末。
40.微波法合成铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料：
41.将60.0mg刺猬状硫化铋(hs-bi2s3)溶解于20.0ml的乙二醇中并超声10min。在超声下，逐滴加入2190μl的氯铂酸(h2ptcl6(10mg ml-1
))，以1mol l-1
的naoh将溶液ph调至11.0。接着放入微波炉(800w,2450mhz)中加热6min(分6次加热，每次加热1min)。待反应体系自然冷却至室温后取出，抽滤，用去离子水和无水乙醇清洗数次，抽滤完将样品置于80℃烘箱内干燥12h。
42.由图2a可清晰看出硫化铋纳米材料为刺猬状，由长度约为2μm的细棒组成，细棒尖端直径约为70nm，且分散均匀。图2b可清晰看出刺猬状硫化铋的细棒尖端及细棒间隙间出现细小的铂纳米颗粒。图2c为该材料固定葡萄糖氧化酶后，可清晰看出葡萄糖氧化酶覆盖了铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料表面。综合上述，可证明成功制备了铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料并用该材料成功固定了葡萄糖氧化酶。
43.制备基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器具体包括以下步骤：
44.(1)将1mg铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料超声分散于1ml去离子水中，
45.(2)取步骤(1)中的分散液100μl加入1mg葡萄糖氧化酶中，震荡分散均匀；
46.(3)将玻碳电极依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，接着将玻碳电极用氧化铝粉抛光，用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，然后在氮气下吹干；
47.(4)取步骤(2)中制得的固定了葡萄糖氧化酶的铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的混合溶5μl滴涂于步骤(3)中所得洁净的玻碳电极表面，并置于冷藏低温的环境下晾干；
48.(5)在步骤(4)所修饰后的玻碳电极表面滴涂5μl 0.5％nafion溶液，置于4℃的环境下晾干，得到该葡萄糖电化学生物传感器。
49.图3中显示不同电极在氮气饱和下的0.1m ph 6.0的pbs缓冲溶液中的循环伏安曲线。曲线a、b分别是裸电极和铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料修饰电极的循环伏安曲线，图中无明显的氧化还原峰。曲线c、d、e分别是gox/nafion,gox/hs-bi2s3/nafion和gox/pt nps/hs-bi2s3/nafion修饰电极的循环伏安曲线，可以看到两条曲线呈现出明显的氧化还原峰，相比之下，e曲线的峰电流是d曲线的峰电流的3.5倍，是c曲线的峰电流的6.5倍。说明该铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料更有利于葡萄糖氧化产物与电极表面之间的电子传递。综合以上数据，可以证明所制备的基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器是可行的。
50.(6)a.以制得的该葡萄糖电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在含0.1m的na2hpo4和nah2po4磷酸缓冲液测试液中，连续加入
不同体积的葡萄糖溶液，用循环伏安法及安培法检测电化学信号。
51.如图4为检测葡萄糖标准样品的线性曲线。图4a中显示了gox/nafion,gox/hs-bi2s3/nafion和gox/pt nps/hs-bi2s3/nafion修饰的电极在饱和空气下ph为6.0的pbs中,连续滴加葡萄糖溶液得到的电流响应曲线。从图4b中可以看到对应的电流响应随着葡萄糖浓度成线性增加。而gox/nafion/gce的线性响应范围仅为0.035mm-1.3mm，gox/hs-bi2s3/nafion/gce的线性范围为0.005mm-1.7mm，gox/ptnps/hs-bi2s3/nafion/gce的线性范围达到了0.003mm-0.1mm和0.1mm-1.9mm,ptnps/hs-bi2s3固定的gox仍有较高的活性且对葡萄糖有较好的线性响应范围。由上可知，基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器具有较宽的线性范围和较高的灵敏度。
52.为考察该传感器的实际应用的可靠性，进行了人血清实际样品的检测。与现有参考方法检测含量相比，本发明方法检测的相对误差小于8％，说明该传感器在实际血清样本中可以准确检测葡萄糖，如表1所示：
53.表1.血清样本中葡萄糖含量的测定
[0054][0055][0056]
由上所述，本发明提供一种基于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的葡萄糖电化学生物传感器的制备方法，涉及电化学生物传感器领域。首先，本发明以ctab与偏苯三甲酸为复合软模板，以硝酸铋为铋源，硫脲为硫源，二次蒸馏水作为溶剂合成了刺猬状硫化铋(hs-bi2s3)。进一步地，本发明以所制备的刺猬状硫化铋为基底，以氯铂酸为铂源，以乙二醇为溶剂，通过微波法制备得到pt nps/hs-bi2s3。其中，刺猬状硫化铋是由长约2μm的bi2s3细棒组成，细棒的尖端直径约为70nm。细棒尖端的明显颗粒为铂纳米粒子。本发明以葡萄糖氧化酶为模型，将葡萄糖氧化酶固定于pt nps/hs-bi2s3上并修饰玻碳电极，制备了葡萄糖电化学生物传感器以直接人体血清中的检测葡萄糖含量。本发明所合成的pt nps/hs-bi2s3具备的刺猬状结构使其具有较大的比表面积，良好的生物相容性，能够负载更多的葡萄糖氧化酶，且pt纳米粒子提高催化效率，使得该传感器表现出优异的电化学性能。以该pt nps/hs-bi2s3材料所构建的葡萄糖电化学生物传感器在磷酸缓冲溶液体系中，可快速简便地实现对葡萄糖的高灵敏度检测。本发明具有稳定性好，检测限低，灵敏度高和特异性好等优点。
[0057]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限
于特定的细节和这里示出与描述的图例。
技术特征：1.一种铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，利用两步法制备得到铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料，利用铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料修饰玻碳电极固定葡萄糖氧化酶分子，制备得到该葡萄糖电化学生物传感器。2.根据权利要求1所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，利用铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料修饰玻碳电极固定葡萄糖氧化酶分子，包括以下步骤：(1)将铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料超声分散于去离子水，得到均匀的分散液；(2)取步骤(1)中的铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料分散液加入到定量的葡萄糖氧化酶中，震荡分散得到均匀的混合液；(3)将玻碳电极依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，接着将玻碳电极用氧化铝粉抛光，用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，然后在氮气下吹干；(4)取步骤(2)中制得的固定了葡萄糖氧化酶的铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的混合溶液滴涂于步骤(3)中所得洁净的玻碳电极表面，并置于冷藏低温的环境下晾干；(5)在步骤(4)所修饰后的玻碳电极表面滴涂nafion溶液，置于冷藏低温的环境下晾干，得到该葡萄糖电化学生物传感器。3.根据权利要求2所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的浓度为0.5-2mg/ml。4.根据权利要求3所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述刺猬状硫化铋纳米材料分散液用量为100μl,所述葡萄糖氧化酶质量为1mg；步骤(3)中，所述的氧化铝粉粒径为0.05mm。5.根据权利要求4所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述冷藏低温为4℃；步骤(5)中，所述nafion膜溶液的浓度为0.5％-1％。6.根据权利要求5所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述抗原浓度为0.005～1μg/ml。7.根据权利要求6所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤(8)中，所述au@pd-ab2浓度为10μg/ml。8.根据权利要求7所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤(9)中，所述苯胺和h2o2的混合溶液中苯胺的浓度为30mm，h2o2的浓度为5mm。9.根据权利要求8所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤(2)～(9)中，通入流速为5μl/min，温育时间为30min。10.根据权利要求1所述的铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，其特征在于，利用两步法制备得到铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料，包括以下步骤：复合软模板法合成刺猬状硫化铋纳米材料的制备工艺如下：在烧杯中，分别加入偏苯三甲酸、十六烷基三甲基溴化铵ctab、硫脲、硝酸铋水溶液和二次蒸馏水，将体系超声30min，混合使其均匀后得淡黄色溶液，将溶液转入聚四氟乙烯材质的反应釜内衬中，将内衬放入钢制材料的反应釜内并拧紧反应釜上盖，然后将反应釜置于恒温鼓风干燥箱中设置温度为120℃，反应12h；反应结束后取出反应釜，自然冷却后将反
应釜内衬底部的黑色沉淀bi2s3取出，以8000rpm离心，并依次用蒸馏水和无水乙醇各洗涤3次，最后于60℃条件下真空干燥12h得黑色粉末；微波法合成铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料的制备工艺如下：将60.0mg刺猬状硫化铋溶解于20.0ml的乙二醇中并超声10min，在超声下，逐滴加入2190μl的氯铂酸，以1mol l-1
的naoh将溶液ph调至11.0，接着放入微波炉中加热6min；待反应体系自然冷却至室温后取出，抽滤，用去离子水和无水乙醇清洗数次，抽滤完将样品置于80℃烘箱内干燥12h。
技术总结本发明公开了一种铂纳米粒子-硫化铋复合物葡萄糖电化学传感器制备方法，先合成刺猬状硫化铋纳米材料，进一步合成铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料。利用包埋法将葡萄糖氧化酶固定于铂纳米粒子-刺猬状硫化铋复合材料上并修饰清洗吹干后的玻碳电极，然后晾干，再滴涂Nafion溶液，低温晾干后获得葡萄糖电化学生物传感器。以该传感电极为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在磷酸缓冲液测试液中，加入不同浓度葡萄糖，会引起相应电流信号增大。利用电流信号变化与葡萄糖浓度之间的直接线性关系，可用于高灵敏的电化学生物传感器检测血糖含量。学生物传感器检测血糖含量。学生物传感器检测血糖含量。
技术研发人员：杨占军 石凤 李娟 王建平
受保护的技术使用者：镇江普瑞赛思智能科技有限公司
技术研发日：2022.03.28
技术公布日：2022/7/5
