分枝杆菌jy-1及其在降解有机污染物中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种分枝杆菌及其在降解有机污染物中的应用，属于有机污染物降解技术领域，尤其是c8以下烷烃降解技术领域。
背景技术：2.石化产业是我国的支柱产业，在国民经济发展中有着举足轻重的地位。石化行业排放的大气污染物主要包括so2、nox和挥发性有机物（vocs）等。其中，vocs种类繁多，毒性强，危害大，是臭氧和二次有机颗粒物生成的重要前体物，也是引发光化学烟雾、雾霾等区域性环境问题的罪魁祸首，严重威胁人类健康与生态安全，已成为石化行业重点防控的对象。
3.2-甲基戊烷（2-methylpentane），又称异己烷，作为一种典型的挥发性有机物被广泛用作石油炼制、化工原料、合成橡胶等石化行业，具有高毒性、刺激性。人体接触后会出现烧灼感、咳嗽、喘息、喉炎、气短、头痛、恶心和呕吐，危害人体健康，对环境如大气、土壤等也有一定的危害。
4.2-甲基戊烷在环境中能被生物降解。生物法净化是通过微生物代谢将vocs转化为co2、h2o的过程，具有成本低、去除效率高、无二次污染等优点，已成为大气污染控制技术领域的研究热点之一。然而，目前尚未发现能以2-甲基戊烷及其类似物为碳源和能源的高效降解菌株。
技术实现要素：5.为了解决上述技术问题，本发明提供了分枝杆菌jy-1。本发明提供的分枝杆菌jy-1，能以2-甲基戊烷及其类似物为碳源和能源，实现2-甲基戊烷的高效降解，对生物法净化2-甲基戊烷的工程应用具有重要意义。
6.本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一株可利用2-甲基戊烷作为碳源和能源的分枝杆菌，所述分枝杆菌命名为jy-1。所述分枝杆菌jy-1已于2022年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022152，微生物分类命名为分枝杆菌mycobacterium sp.。
7.上述分枝杆菌分离自浙江某污水处理厂的活性污泥，为好氧的革兰氏阳性菌，菌落呈小点状、黄色、不透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。经16s rdna测序后，判断其为分枝杆菌属，命名为mycobacterium sp. jy-1。
8.本发明的分枝杆菌jy-1能以2-甲基戊烷作为碳源和能源进行生长繁殖，并高效降解2-甲基戊烷，且能适应的温度和ph范围较广。此外，分枝杆菌jy-1还能以3-甲基戊烷和正己烷作为碳源和能源进行生长繁殖，并高效降解3-甲基戊烷和正己烷。
9.第二方面，本发明提供了所述的分枝杆菌jy-1在降解有机污染物中的应用。
10.作为上述技术方案的优选，所述有机污染物选自2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷
中的至少一种。
11.第三方面，本发明提供了降解有机污染物中的方法。
12.降解有机污染物的方法，包括以下步骤：a、将权利要求1所述分枝杆菌接种于固体斜面培养基，25～30℃培养48～72 h，获得斜面菌体；b、将所述斜面菌体接种至无机盐培养基中，25～30℃培养24～36 h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液；c、将所述菌液和有机污染物混合，制成混合液；d、使所述混合液于20～40℃下进行降解反应。
13.作为上述技术方案的优选，所述无机盐培养基的ph为4.0～9.0。
14.作为上述技术方案的优选，所述无机盐培养基的ph为6.0～7.0。
15.作为上述技术方案的优选，所述降解反应的温度为25～30℃。
16.当初始ph为6.0～7.0，温度为25～30℃时，分枝杆菌jy-1繁殖速度较快，并能实现2-甲基戊烷的快速降解。
17.作为上述技术方案的优选，所述混合液中的有机污染物为选自2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷中的至少一种。
18.作为上述技术方案的优选，所述有机污染物的浓度为30~300mg/l。
19.作为上述技术方案的优选，所述混合液中含有浓度为27～135 mg/l的2-甲基戊烷、浓度为54 mg/l的3-甲基戊烷和/或53 mg/l的正己烷。
20.作为上述技术方案的优选，所述混合液中含有浓度为54～135 mg/l的2-甲基戊烷。
21.当2-甲基戊烷含量为54～135 mg/l时，分枝杆菌jy-1能在短时间内快速生长繁殖，实现2-甲基戊烷的高效降解。
22.作为上述技术方案的优选，所述固体斜面培养基包含以下质量份的组分：酵母粉0 .50~1.00 g/l、可溶性淀粉0.50~1.00 g/l、mgso
4 0.50~1.00 g/l、胰蛋白胨0 .50~1.00 g/l、葡萄糖0.50~1.00 g/l、丙酮酸钠0.30~0.60 g/l、k2hpo
4 0.45~0.90 g/l、琼脂18～20 g/l，溶剂为去离子水。
23.作为上述技术方案的优选，所述无机盐培养基包含以下质量份的组分：na2hpo
4 4.0～5.0 g/l、kh2po
4 0.8～1.2 g/l，(nh4)2so
4 2.3～2.8 g/l，mgso
4 0.18～0.23 g/l、cacl
2 0.022～0.24 g/l、微量元素母液0.8～1.2 ml/l，溶剂为去离子水。
24.作为上述技术方案的优选，所述无机盐培养基包含以下质量份的组分：na2hpo
4 4.0～5.0 g/l、kh2po
4 0.8～1.2 g/l，(nh4)2so
4 2.3～2.8 g/l，mgso
4 0.18～0.23 g/l、cacl
2 0.022～0.24 g/l、微量元素母液0.8～1.2 ml/l，溶剂为去离子水。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1）、本发明的分枝杆菌jy-1能以2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷为碳源和能源，实现2-甲基戊烷和3-甲基戊烷的高效降解；48 h对2-甲基戊烷的降解率可达99%以上，对 3-甲基戊烷的降解率可达80%以上，对正己烷降解率可以达到60%以上；2）、本发明的分枝杆菌jy-1能适应的温度和ph范围较广，在20～40℃、ph 4.0～9.0下均能生长繁殖并在一定程度上降解2-甲基戊烷。
附图说明
26.图1为分枝杆菌jy-1的系统发育树；图2为分枝杆菌jy-1的透射电镜照片；图3为分枝杆菌jy-1的菌体生长、2-甲基戊烷降解曲线图；图4为不同ph值培养液对分枝杆菌jy-1的2-甲基戊烷降解（图a）、生长（图b）、矿化（图c）的影响柱形图；图5为不同温度对分枝杆菌jy-1的2-甲基戊烷降解（图a）、生长（图b）、矿化（图c）的影响柱形图；图6为分枝杆菌jy-1对不同初始浓度2-甲基戊烷的降解曲线图；图7为分枝杆菌jy-1在不同初始2-甲基戊烷浓度下的生长曲线。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
28.以下实施例中所使用的各培养基的成分如下：无机盐培养基：na2hpo4·
12h2o 4.5 g/l、kh2po
4 1.0 g/l、(nh4)2so
4 2.5 g/l、mgso4·
7h2o 0.2 g/l、无水cacl
2 0.023 g/l，微量元素母液1 ml/l，ph 7.0，溶剂为去离子水；所述微量元素母液的成分如下：feso4·
7h2o 1.0 g/l、cuso4·
5h2o 0.02 g/l、h3bo
3 0.014 g/l、mnso4·
4h2o 0.10 g/l、znso4·
7h2o 0.10 g/l、na2moo4·
2h2o 0.02 g/l、cocl2·
6h2o 0.02 g/l，溶剂为去离子水；r2a固体斜面培养基：酵母粉0 .50 g/l、可溶性淀粉0.50 g/l、mgso4· 7h2o 0 .50 g/l、胰蛋白胨0 .50 g/l、葡萄糖0.50 g/l、丙酮酸钠0.30 g/l、k2hpo4·
3h2o 0.45 g/l，琼脂18 g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
29.实施例1：分枝杆菌jy-1的分离、纯化与鉴定（1）分枝杆菌jy-1的分离及纯化现场采集浙江某污水处理厂的活性污泥，取静置后的下层污泥与无机盐培养基按1:2(v/v)混合，将3 l混合物接入5 l污泥驯化罐，以2-甲基戊烷为底物作为碳源和能源，室温下驯化培养，将近20天后，从驯化罐取5 ml污泥加入装有50 ml无机盐培养基的摇瓶中，发现驯化的污泥在摇瓶中每天可稳定降解27 mg/l 2-甲基戊烷，降解率可达80-90%（摇瓶实验条件：30℃、160 r/min），获得驯化样品。
30.将摇瓶中的污泥样品分别取1、2 ml转接入其他摇瓶进一步测试性能，发现转接后的污泥在摇瓶中每天可稳定降解27 mg/l 2-甲基戊烷，将此污泥样继续转接富集6代（每次转接1 ml），然后将富集6代后的污泥按10-1
～10-6
倍数进行平板涂布，挑取单菌落，再以2-甲基戊烷为底物，进行降解活性测定，分离纯化，获得一株具有2-甲基戊烷降解活性的菌株jy-1。
31.（2）分枝杆菌jy-1的鉴定菌株jy-1的菌落呈小点状、黄色、不透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。
32.菌株jy-1的生理生化特征为：好氧，革兰氏染色为阳性。
33.对菌株jy-1进行16s rdna测序，测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完
成。菌株jy-1的16s rdna(seq id no .1)如下(genbank登录号为om721770):catggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacggaaaggcccttcggggtactcgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccctgcactttgggataagcctgggaaactgggtctaataccgaatatgatcatggcctgcatgggttgtggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagtagggacgaagcgcaagtgacggtacctatagaagaaggaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtccgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgtaggtggtttgtcgcgttgttcgtgaaaactcacagctcaactgtgggcgtgcgggcgatacgggcagacttgagtactgcaggggagactggaattcctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggtactaggtgtgggtttccttccttgggatccgtgccgtagctaacgcattaagtaccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatgcacaggacgccggcagagatgtcggttcccttgtggcctgtgtgcaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtctcatgttgccagcacgttatggtggggactcgtgagagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccggtacaaagggctgcgatgccgtgaggtggagcgaatcctttcaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcctaacccct通过将菌株jy-1的16s rdna序列上传到ezbiocloud.net网站，与网站上的标准菌株进行比对，并用mega-x软件，采用neighbor-joining 法构建细菌发育进化树,并用bootstrap法(重复1000次)进行评估，构建的系统发育树如图1，从而确定该菌株jy-1为分枝杆菌属，命名为分枝杆菌(mycobacterium sp. )jy-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年2月25日，保藏编号cctcc no：m 2022152，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
34.实施例2：分枝杆菌jy-1的扩大培养将分枝杆菌jy-1扩大培养后，获得含有分枝杆菌jy-1的菌液，具体过程如下：1）斜面培养：将分枝杆菌jy-1接种于r2a固体斜面培养基，30℃培养72 h，获得斜面菌体；2）扩大培养：用接种环挑取步骤1）获得的斜面菌体接种至无机盐培养基中，30℃，培养24 h，获得od
600
＝0.1的菌液。
35.实施例3：分枝杆菌jy-1降解2-甲基戊烷的性能取实施例2中制得的菌液，接种至新鲜的含54 mg/l2-甲基戊烷的50 ml无机盐培养基（ph＝7），使初始菌体浓度以od
600
计为0.02。设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。放入温度为30℃、转速为160 r/min的摇床中培养，每隔3~6 h取样测定2-甲基戊烷降解率，并用5 ml注射器抽出一部分菌液，测定菌体od值，结果见图3。
36.从图3可以看出：随着时间的延长，菌体浓度逐渐增大，培养30 h菌体浓度达到最大（约为od
600
=0.15）， 2-甲基戊烷降解率达到80%以上。说明分枝杆菌jy-1可利用2-甲基戊
烷作为碳源和能源进行生长繁殖，并且具有稳定高效降解2-甲基戊烷的能力。
37.实施例4：初始ph值对分枝杆菌jy-1降解2-甲基戊烷的影响用1 mol/l naoh水溶液或1 mol/l h2so4水溶液调节无机盐培养基为不同ph值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）；取实施例2中制得的菌液，接种至新鲜的含54 mg/l 2-甲基戊烷的50 ml调节ph后的无机盐培养基中，使初始菌体浓度以od
600
计为0.02。设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。将样品于30℃、160 r/min 恒温摇床里振荡培养，培养48 h 后取样，测反应液中2-甲基戊烷降解率、od
600
值和co2值，结果见图4。
38.从图4可以看出：在ph=4.0～9.0范围内，分枝杆菌jy-1均能以2-甲基戊烷为碳源和能源生长繁殖，并在一定程度上降解2-甲基戊烷；在ph=6.0～7.0范围内，分枝杆菌jy-1对2-甲基戊烷均有较高的降解率（99%以上）。同时分枝杆菌jy-1的生长量和产生的co2值也呈现与2-甲基戊烷降解率一致的趋势。
39.实施例5：温度对分枝杆菌jy-1降解2-甲基戊烷的影响取实施例2中制得的菌液，接种至新鲜的含54 mg/l 2-甲基戊烷的50 ml无机盐培养基（ph＝7），使初始菌体浓度以od
600
计为0.02。将各个样品分别置于温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃摇床中恒温振荡培养（摇床转速均为160 r/min）。各温度下分别设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。培养20 h后取样，测反应液中2-甲基戊烷降解率、od
600
值和co2值，结果见图5。
40.从图5可以看出：在20～40℃温度范围内，分枝杆菌jy-1均能以2-甲基戊烷为碳源和能源生长繁殖，并在一定程度上降解2-甲基戊烷；在25～30℃温度范围内，分枝杆菌jy-1对2-甲基戊烷均有较高的降解率（99％以上），同时分枝杆菌jy-1的生长量和产生的co2值也有与2-甲基戊烷降解率一致的趋势。
41.实施例6：底物浓度对分枝杆菌jy-1降解2-甲基戊烷的影响在新鲜的无机盐培养基中加入不同浓度的底物2-甲基戊烷，使底物初始浓度分别为27、54、81、108、135 mg/l，分别接种实施例2中制得的菌液，使初始菌体浓度以od
600
计为0.02。设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。在30℃、转速为160 r/min的摇床中培养，定时取样测定2-甲基戊烷浓度和分枝杆菌jy-1的od
600
，结果分别见图6和图7。
42.从图6和图7可以看出：当2-甲基戊烷浓度为27～135 mg/l时，分枝杆菌jy-1能在24 h内快速繁殖，并能在40 h后将2-甲基戊烷几乎完全降解；随着2-甲基戊烷浓度的增加，完全降解时间也在一定程度上增加。
43.实施例7：分枝杆菌jy-1对不同碳源底物的降解能力在新鲜的无机盐培养基中分别加入除2-甲基戊烷外的其他底物（底物浓度见表1），接种实施例2中制得的菌液，使初始菌体浓度以od
600
计为0.02。在30℃、转速为160 r/min的摇床中进行恒温振荡培养，培养48 h后检测od
600
和降解率，结果见表1。发现分枝杆菌jy-1对3-甲基戊烷和正己烷有不同程度的降解。
44.表1 分枝杆菌jy-1对不同碳源底物的降解能力
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
45.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
技术特征：1.分枝杆菌jy-1，其特征在于，所述分枝杆菌jy-1已于2022年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022152，微生物分类命名为分枝杆菌mycobacterium sp.。2.权利要求1所述的分枝杆菌jy-1在降解有机污染物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述有机污染物选自2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷中的至少一种。4.降解有机污染物的方法，包括以下步骤：a、将权利要求1所述分枝杆菌接种于固体斜面培养基，25～30℃培养48～72 h，获得斜面菌体；b、将所述斜面菌体接种至无机盐培养基中，25～30℃培养24～36 h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液；c、将所述菌液和有机污染物混合，制成混合液；d、使所述混合液于20～40℃下进行降解反应。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述无机盐培养基的ph为4.0～9.0。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述混合液中的有机污染物为选自2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷中的至少一种。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述有机污染物的浓度为30~300mg/l。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述固体斜面培养基包含以下质量份的组分：酵母粉0 .50~1.00 g/l、可溶性淀粉0.50~1.00 g/l、mgso
4 0.50~1.00 g/l、胰蛋白胨0 .50~1.00 g/l、葡萄糖0.50~1.00 g/l、丙酮酸钠0.30~0.60 g/l、k2hpo
4 0.45~0.90 g/l、琼脂18～20 g/l，溶剂为去离子水。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述无机盐培养基包含以下质量份的组分：na2hpo
4 4.0～5.0 g/l、kh2po
4 0.8～1.2 g/l，(nh4)2so
4 2.3～2.8 g/l，mgso
4 0.18～0.23 g/l、cacl
2 0.022～0.24 g/l、微量元素母液0.8～1.2 ml/l，溶剂为去离子水。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述微量元素母液包括以下成分：feso
4 0.8～1.2 g/l、cuso
4 0.015～0.025 g/l、h3bo
3 0.013～0.015 g/l、mnso
4 0.08～0.13 g/l、znso
4 0.08～0.13 g/l、na2moo
4 0.015～0.025 g/l、cocl
2 0.015～0.025 g/l，溶剂为去离子水。
技术总结本发明涉及一株分枝杆菌JY-1及其在降解有机污染物中的应用，属于有机污染物降解技术领域，尤其是C8以下有机污染物的降解。本发明的分枝杆菌，命名为分枝杆菌JY-1，已在2022年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022152，微生物分类命名为分枝杆菌Mycobacterium sp.本发明的分枝杆菌JY-1能以2-甲基戊烷为碳源和能源进行生长繁殖，并高效降解2-甲基戊烷，且能适应的温度和pH范围较广。此外，分枝杆菌JY-1还能以3-甲基戊烷和正己烷为碳源和能源，高效降解3-甲基戊烷和正己烷。烷和正己烷。烷和正己烷。
技术研发人员：陈东之 周佳宇 李钱 陈建孟
受保护的技术使用者：浙江海洋大学
技术研发日：2022.04.07
技术公布日：2022/7/5
