一种百合病毒lav-1特异性检测靶序列、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种百合病毒lav-1特异检测靶序列、试剂盒及检测方法。
背景技术：2.百合植物因其美丽的花色和花香而成为国际上受欢迎的观赏型花卉，并培育出超过4500个栽培品种。但是百合经常感染病毒而导致百合叶片出现花叶，黄化，卷曲变形，严重时甚至不开花，严重影响了百合市场的经济发展。已报道的侵染百合的病毒有20多种，常见病毒有黄瓜花叶病毒(cmv)、百合斑驳病毒(lmov)、百合无症状病毒(lsv)、百合病毒x(lvx)、车前草花叶病毒(plamv)等等。已报道的百合病毒大部分是通过指示植物法、电镜观察法和血清学技术等鉴定出来的，但通常受限于费时、病毒粒子提取困难等很难高效、全面的发现潜在的病毒或新病毒。高通量技术(hight-throughput sequencing，hts)可同时对几十万到几百万个dna分子进行序列鉴定，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。hts被广泛应用于新病毒的发现、已知病原鉴定及基因组遗传多样性和进化的分析与比较，hts在百合上的应用随着技术的进步也越来越广泛。
3.amalgaviridae科是最近发现的一种分类群，amalgaviridae科包括amalgavirus和zybavirus两个属，其中amalgavirus属报道了一些植物病毒，例如蓝莓潜伏病毒、杜鹃花病毒a、南方番茄病毒等。这些植物病毒具有小的dsrna基因组，尚未显示形成真正的病毒粒子。相反，它们通过种子垂直传播，被认为不太可能进行有效的细胞外传播，除非可能通过载体。植物amalgavirus属病毒的基因组正链包含两个部分重叠的长开放阅读框(orf)，下游orf2在+1框架中与orf1重叠。因此，它们被认为仅编码两种蛋白质，一种未知特定功能的orf1编码产物和orf1+2编码的融合蛋白，该蛋白在+1程序性核糖体移码(prf)后被翻译。该融合蛋白的orf2编码部分由保守序列基序指示为病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)。
4.本发明通过了高通量测序发现了一种百合新病毒lily amalgavirus 1(lav-1)，并通过系统进化树和多重比对等方法，认为该病毒可能是amalgaviridae科amalgavirus属的新成员；并且通过田间样品检测结果来看，lav-1的检出率较高。但由于多为多种病毒复合侵染，由该病毒导致的症状尚未明确，而百合是鳞茎繁殖材料，长期积累病毒对百合生长产生的影响较大，故建立快速诊断技术对于后续研究和试验有较大的影响。
技术实现要素：5.有鉴于此，本发明的目的在于实现该百合病毒lav1的快速、特异以及低含量的检测。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
7.本发明第一方面提供了一个适合百合病毒lav1特异性检测的靶序列，该靶序列的碱基序列如seq id no:1所示。
8.本发明第二方面提供了一个针对上述靶序列的百合病毒lav1特异性检测试剂盒，
该试剂盒中包括碱基序列如seq id no:2和seq id no:3所示的引物对。
9.本发明第三方面提供了一种百合病毒lav1的检测方法，具体包括以下步骤：
10.s1、提取百合样品的总rna；
11.s2、取总rna通过逆转录酶合成cdna；
12.s3、以cdna为模板，使用上述引物对进行pcr扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
13.优选地，步骤s1具体为：将百合叶片研磨后与trizol混匀，离心取上清，加入氯仿抽提；离心取上清，加入异丙醇混匀，沉降后离心弃上清；采用乙醇洗涤沉淀，再在沉淀中加入depc水使沉淀溶解，即为样品总rna。
14.优选地，步骤s2具体为：取步骤s1制备的总rna，加入随机引物pd(n)6和depc水，先沸水浴再迅速冷却后，加入反转录混合液，吸打混匀、瞬离；37℃水浴1～1.5h后，先沸水浴再迅速冷却，瞬离即得。
15.更加优选地，所述反转录混合液包括：4μl5
×
m-mlv反应缓冲液、1μl2.5mm dntps、0.5μl40u/μl rna酶抑制剂、0.5μl200u/μl m-mlv和4μldepc水，按总体积10μl计。
16.优选地，步骤s3所述pcr扩增的体系为：共15μl，7.5μl 2
×
taq master mix，0.2μm引物对，1.0μl cdna，ddh2o余量。
17.优选地，步骤s3所述pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火，72℃延伸20s，30个循环；72℃完全延伸10min。
18.优选地，所述产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，其中阳性样品能扩增出大小约650bp的目的片段。
19.本发明的有益效果为：通过对百合新病毒lav-1的序列分析，筛选得到能够用于病毒检测的特异性靶序列；根据靶序列设计特异性引物，实现了对lav-1病毒的快速、准确的检测，且检测灵敏度高，为lav-1病毒的深入研究提供了支持。相较于elisa检测，电镜检测等方法，本发明提供的检测方法更为简便快速，并且不需要昂贵仪器和试剂，大大节约了检测经费。
附图说明
20.图1为百合新病毒lav-1的系统发育进化树，其中，a图为基于orf1编码的假定蛋白(p44)的氨基酸序列系统进化树分析，b图为基于rdrp的氨基酸序列系统进化树分析；采用nj法，重复1000次；
21.图2为百合新病毒lav-1编码的rdrp保守结构域与amalgavirus属成员编码的保守结构域比对图；
22.图3为实施例1中凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
23.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
24.本发明通过对百合叶片样品高通量测序，编号hzau1：采自湖北省武汉市的6株百合(编号xbly-10，xbly-13，seb，mm-10，mm-9，mm-1)的叶片混合样品，其中包括2株“西伯利亚”品种百合、1株“索尔邦”百合、三株“木门”百合，其中xbly10，xbly13和seb叶片样品无明
显症状，mm10，mm9叶片样品有明显褪绿条斑，mm1叶脉有轻微褪绿症状。。所有样品经过液氮快速冷冻后送至上海派森诺公司进行高通量测序。经拼接得到的contig逐一在ncbi数据库进行blastx和blastn比对，从上述样品中鉴定到的植物病毒除已报道的常见病毒外，还鉴定到尚未报道的能侵染百合的病毒为lily amalgavirus 1(lav-1)。
25.与amalgaviridae、双分病毒科和单分病毒科部分成员构建系统进化树(如图1所示)，结果表明lav-1是amalgaviridae科amalgavirus属的一个新成员。
26.将其rdrp氨基酸序列与amalgavirus属成员进行比对，发现有7条保守序列，分别如图2中的motifⅰ～ⅶ所示。
27.针对该新病毒，本发明提供的检测方法具体如下面实施例所示。
28.实施例1
29.首先筛选得到了能用于lav-1病毒检测的特异性靶序列，其碱基序列如seq id no:1所示。然后设计特异性引物，其序列具体如下：
30.lav1-f：5
’‑
agaggaggatgtggaggatt-3’(seq id no:2)；
31.lav1-r：5
’‑
ggagacatacccctcgtagc-3’(seq id no:3)。
32.利用上述引物对检测百合病毒，具体步骤如下：
33.(1)采用改进的trizol法提取百合叶片样品中的总rna。
34.取0.1g百合叶片，液氮研磨后迅速加入管中，加800μl trizol，上下颠倒混匀；12000rpm 4℃离心15min；小心吸取上清，加入等体积氯仿抽提两次，剧烈震荡后，冰上静置5min后，12000rpm 4℃离心15min；小心吸取上清，加入等体积提前预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，-20℃沉降30min；12000rpm 4℃离心15min；弃上清，加入75％乙醇，上下颠倒，洗涤沉淀2-3次，12000rpm 4℃离心1min；12000rpm 4℃空离1min；用枪头吸干残余乙醇，超净工作台中晾干沉淀约5min，加入25μldepc水，轻轻吸打，直至沉淀完全溶解，即为样品总rna，于-80℃保存备用。
35.采用氯仿对提取过程中的大分子蛋白质2-3次抽提后得到高纯度、高质量以及完整度较好的rna。
36.(2)cdna的合成，具体为：取6～8μl约(1μg)的总rna或者dsrna，加入1μl随机引物pd(n)6(80nmol)，depc h2o补足10μl，加入到无酶的0.5ml离心管中；沸水浴10min，置于冰上迅速冷却3～5min；加入10μl配好的反转录混合溶液(包含4μl5
×
m-mlv反应缓冲液、1μldntps(2.5mm)、0.5μlrna酶抑制剂(rri)(40u/μl)、0.5μlm-mlv(200u/μl)和4μldepc h2o)，吸打混匀、瞬离，37℃水浴1～1.5h，85℃沸水浴5min；迅速置于冰上，瞬离，-20℃保存备用。
37.(3)以cdna为模板，进行pcr反应。pcr反应体系(15μl)为：7.5μl 2
×
taq master mix，上下游引物lav1-f/r 0.2μm，1.0μl cdna，ddh2o补足15μl。pcr扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火，72℃延伸20s，30个循环，72℃完全延伸10min。
38.产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，置于0.5μg/ml的溴化乙锭(eb)中染色，在凝胶成像系统中观察。
39.判定标准：lily amalgavirus 1阳性样品能扩增出大小约650bp的目的片段(如图3)。将该序列构建在pmd18-t载体上，测序结果在ncbi上比对，能比对得到同属病毒。故根据样品中目的片段的有无、大小差异，快速、特异的确定百合样品中是否鉴定到lav-1。而且本
发明所设计的特异性引物扩增出来的谱带清晰，可根据条带亮度判断百合样品中lav-1病毒含量高低。
40.以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
41.42.
技术特征：1.一种百合病毒lav-1特异性检测靶序列，其特征在于，所述靶序列的碱基序列如seq id no:1所示。2.一种针对权利要求1所述靶序列的百合病毒lav-1特异性检测试剂盒，其特征在于，包括碱基序列如seq id no:2和seq id no:3所示的引物对。3.一种百合病毒lav-1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、提取百合样品的总rna；s2、取总rna通过逆转录酶合成cdna；s3、以cdna为模板，使用权利要求2所述引物对进行pcr扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.根据权利要求3所述百合病毒lav-1的检测方法，其特征在于，步骤s1具体为：将百合叶片研磨后与trizol混匀，离心取上清，加入氯仿抽提；离心取上清，加入异丙醇混匀，沉降后离心弃上清；采用乙醇洗涤沉淀，再在沉淀中加入depc水使沉淀溶解，即为样品总rna。5.根据权利要求3所述百合病毒lav-1的检测方法，其特征在于，步骤s2具体为：取步骤s1制备的总rna，加入随机引物pd(n)6和depc水，先沸水浴再迅速冷却后，加入反转录混合液，吸打混匀、瞬离；37℃水浴1～1.5h后，先沸水浴再迅速冷却，瞬离即得。6.根据权利要求5所述百合病毒lav-1的检测方法，其特征在于，所述反转录混合液包括：4μl5
×
m-mlv反应缓冲液、1μl2.5mm dntps、0.5μl40u/μlrna酶抑制剂、0.5μl200u/μl m-mlv和4μldepc水，按总体积10μl计。7.根据权利要求3所述百合病毒lav-1的检测方法，其特征在于，步骤s3所述pcr扩增的体系为：共15μl，7.5μl 2
×
taq master mix，0.2μm引物对，1.0μl cdna，ddh2o余量。8.根据权利要求3所述百合病毒lav-1的检测方法，其特征在于，步骤s3所述pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火，72℃延伸20s，30个循环；72℃完全延伸10min。9.根据权利要求3所述百合病毒lav-1的检测方法，其特征在于，所述产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，其中阳性样品能扩增出大小约650bp的目的片段。
技术总结本发明公开了一种百合病毒LAV-1特异检测靶序列、试剂盒及检测方法，所述靶序列的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述检测试剂盒包括碱基序列如SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对，所述检测方法为：将待测样品用改进的Trizol法对RNA进行提取，逆转录得到cDNA，使用引物对进行PCR扩增进行凝胶电泳检测分析。本发明能够实现百合病毒LAV-1的快速、特异性检测，为LAV-1病毒的进一步研究提供了技术支持。1病毒的进一步研究提供了技术支持。1病毒的进一步研究提供了技术支持。
技术研发人员：丁芳 霍妍妍 李晓婷 洪霓 王国平
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.03.28
技术公布日：2022/7/5
