1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用。
背景技术：2.细菌纤维素，是由细菌合成的纳米级生物聚合物。它具有高结晶度、高聚合度、高拉伸强度、高持水性、生物相容性和可降解性等优良品质，使其能够广泛应用于生物医药、食品、纺织、功能膜、化妆品和音响设备等行业。产纤维素的细菌菌株包括农杆菌、根瘤菌、假单胞菌和醋酸杆菌等。其中，木葡萄糖醋杆菌因其高产细菌纤维素的能力而成为研究最广泛的产细菌纤维素菌株。随着生物技术的不断发展，对醋酸杆菌进行代谢工程改造来提高其细菌纤维素产量的报道逐渐增多，这些改造包括加强细菌纤维素合成途径相关酶的表达，减弱竞争性途径相关酶的表达等等。
3.木葡萄糖醋杆菌，是工业产品的重要生产菌株，它能够高效合成细菌纤维素，培养条件较为简单，且是食品安全菌株，被安全地用于细菌纤维素的大规模工业生产。但是，缺乏高效的表达元件限制了其应用价值。目前对木葡萄糖醋杆菌来源启动子开发较少，对启动子的认知不足，更多的是利用外源的启动子，包括lac启动子、j
23104
启动子、p
bla
启动子等。
4.由于发酵过程的复杂性和多样性，目前的组成型启动子和诱导型启动子在应用中存在诸多问题，如诱导剂成本较高，组成型启动子在特定条件下无法开启等，而木葡萄糖醋杆菌来源的启动子则不存在该类问题，该类启动子能很好的用于菌株自身的基因工程改造，准确的开启基因的表达。目前对木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子的功能尚不清楚。木葡萄糖醋杆菌作为一种优良的细菌纤维素生产菌株，开发其来源的表达元件，拓展其启动子库具有重大意义。
5.磷酸果糖激酶pfka是embden meyerhof parnas(emp)途径的关键酶，木葡萄糖醋杆菌中缺少pfka基因，而pfka基因编码的是磷酸果糖激酶，pfka基因缺失是komagataeibacter种的一个非常著名的基因型特征。研究表明，pfka基因的表达在完整的糖酵解过程中产生了更多的atp，为菌体生长及细菌纤维素的生产提供能量。利用pfka基因表达komagataeibacter突变株作为基础生产菌株，可以进一步提高细菌纤维素的产量。
技术实现要素：6.针对上述现有技术的不足和需求，本发明人研究鉴定一种木葡萄糖醋杆菌来源序列，而完成本发明。
7.第一方面，本发明鉴定一种木葡萄糖醋杆菌来源序列，该序列具有强启动子的功能，该序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.具体的seq id no.1的序列为：5
’‑
ttccctgccctgagggaggggctgcaatctttagtaatgtttcagttcttgagattgtggtcccc
ttgcggcaagtagatgatgctttccataaatttagaaattttaattcgagacaaccctcctgcggcatgttacagcatgggggtcggttcgggtctggcgattcgccccctgatagacatattgggatgagaagtccc-3’9.进一步的，上述序列来源于木葡萄糖醋杆菌基因组。
10.进一步的，所述的木葡萄糖醋杆菌为komagataeibacter xylinus cgmcc2955。
11.进一步的，上述序列具有完整的启动子功能。
12.进一步的，上述序列具有强启动子活性。
13.进一步的，上述序列具有的强启动子的表达强度峰值不低于pbla质粒启动子p
bla
的255倍。
14.一种表达载体，包含所述的具有木葡萄糖醋杆菌来源启动子功能的序列。
15.优选的，所述的表达载体将基于木葡萄糖醋杆菌来源启动子功能的序列构建到表达载体上，便于在微生物体内复制以及表达。
16.优选的，表达载体为prbs。
17.进一步的，表达载体prbs骨架质粒是以去掉启动子、核糖体结合位点(rbs)和终止子的pbla载体为基础构建。
18.一种基因工程菌，具有上述木葡萄糖醋杆菌来源启动子功能的序列或者上述表达载体。
19.进一步的，上述基因工程菌利用木葡萄糖醋杆菌来源启动子功能的序列实现开启红色荧光蛋白表达的功能。
20.优选的，上述红色荧光蛋白为rfp。
21.进一步的，上述基因工程菌来源于木葡萄糖醋杆菌。
22.第二方面，本发明提供了包含所述木葡萄糖醋杆菌来源的启动子功能的序列的表达盒、重组载体。
23.所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。
24.术语“载体”指的是dna构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的dna序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒、噬菌体，例如本发明具体实施例中使用的prbs质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
25.第三方面，本发明提供了含有所述木葡萄糖醋杆菌来源的启动子功能的序列的突变体的重组宿主细胞。
26.重组宿主细胞具体例如通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、转导、磷酸钙(capo4)沉淀法、氯化钙(cacl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-dmso法。
27.本发明所述“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的序列的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的序列，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选
醋酸杆菌，包括但不限于komagataeibacter xylinus cgmcc 2955，以及由该菌株制备的产生细菌纤维素的突变体或菌株。
28.在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养和静置培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的ph值等。
29.第四方面，本发明提供了一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将所述木葡萄糖醋杆菌来源的启动子功能的序列与目的基因可操作地链接，优选地增强细菌代谢及细菌纤维素合成相关基因的表达。
30.本发明中的术语“可操作地连接”是指本发明的木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本发明的木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本发明所述的增强目的基因表达的方法中，利用本发明所述的木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。
31.第五方面，本发明提供了一种以增强菌体能量代谢提高细菌纤维素产量的生产方法，所述方法包括培养含有所述木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列与以增强菌体能量代谢相关的基因可操作地连接的宿主细胞，并收集产生的细菌纤维素。其中，以增强菌体能量代谢相关的基因包括但不限于磷酸果糖激酶pfka。
32.在一个具体实施方式中，所述木葡萄糖醋杆菌经过下述改良，所述木葡萄糖醋杆菌中的磷酸果糖激酶编码基因与上述的木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列可操作连接，并导入木葡萄糖醋杆菌中，获得细菌纤维素生产菌株。
33.本发明所述的以增强菌体能量代谢提高细菌纤维素产量的生产方法中，利用本发明的所述木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从培养液中回收目标产物的步骤。从细胞或培养基中回收目标产物的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、naoh浸泡、洗涤、烘干、压片、冻干等。
34.本发明有益的技术效果在于：
35.本发明克服现有发酵过程中部分组成型启动子无法表达等问题，提供木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列及其在促进细菌纤维素合成中的应用。本发明提供了p
01095
启动子序列的功能、基因序列、各组件构建方法与转入工程菌的方法、基于木葡萄糖醋杆菌表达系统的工作用途及具体应用；具体为：
36.1、本发明具体通过木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列和表达载体prbs，构建优良的高效表达系统。
37.2、本发明所述木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列，具有强启动子表达强度的特性。
38.3、本发明所述木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列，具有启动子表达强度峰值不低于pbla质粒启动子p
bla
的255倍的特性。
39.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
40.本发明在木葡萄糖醋杆菌中发现了一种具有强启动子表达强度的序列，并将其开发成表达系统，增加了对木葡萄糖醋杆菌调控的认知，促进了d细菌纤维的素合成，为优良
标准化生物元件的开发提供了一定的基础。
31.本发明提供的木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列表现出比一般组成型启动子更高的启动子活性，可以用于目标基因的表达，尤其是与细菌纤维素生产相关基因的表达，例如与pfka基因可操作地连接，可以增强磷酸果糖激酶的表达强度，由此提高了重组菌株的细菌纤维素生产效率，具有较高的应用价值。
附图说明
42.图1为prbs-p
01095-mrfp和prbs-p
bla-mrfp的单酶切验证图、p
01095
基因序列及prbs-p
01095-mrfp质粒的质粒图谱。
43.图2为具有木葡萄糖醋杆菌来源启动子功能的序列的荧光筛选板。
44.下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
45.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。
46.实施例1
47.木葡萄糖醋杆菌来源序列的启动子强度表征质粒的构建。
48.为了表征木葡萄糖醋杆菌来源的序列的启动子表达强度，本发明首先构建一个表征载体，在prbs质粒骨架基础上，由启动子p
01095
表达红色荧光蛋白基因。首先构建一个骨架质粒pbrs用于后续研究。骨架质粒是以去掉启动子、核糖体结合位点(rbs)和终止子的pbla载体为基础，加入bamhi酶切位点、rbs、mrfp、trrnb终止子组成。根据已公开的木葡萄糖醋杆菌cgmcc 2955基因组序列及p
01095
启动子注释信息，设计引物p
01095-f/r，以cgmcc 2955基因组为模板，通过pcr扩增获得p
01095
启动子片段。使用bamhi酶切载体prbs，获得线性载体，再将以上两个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得prbs-表征载体，质粒图谱如图1所示。以上所用引物序列如表1所示。
49.表1
[0050][0051]
实施例2
[0052]
木葡萄糖醋杆菌来源序列的启动子筛选质粒的构建及强度表征。
[0053]
以红色荧光蛋白基因mrfp为报告基因，对照为常用的pbla质粒上的p
bla
启动子，考察表达元件p
01095
荧光蛋白表达特性，测定其在96h时的荧光强度。
[0054]
1.荧光蛋白表达强度测定
[0055]
荧光蛋白表达测定方法为：用接种环从固体培养基平板上挑取单菌落于5ml液体培养基中，180r/min，30℃培养24h。取1ml发酵液转移至含有4
‰
(v/v)纤维素酶(celluclast 1.5l,novozymes)的75ml种子培养基中，180r/min，30℃培养至od
600
为0.5～0.6。取750μl种子液转接到75ml液体培养基(初始ph 6.0，初始葡萄糖糖浓度10g/l)中，使其初始od
600
＝0.05，30℃条件下培养4天，取400μl菌液，4000r/min离心10min，弃上清，重悬于400μl pbs中，取200μl样品于黑色96孔板，将96孔板放置到tecan酶标仪，设置激发波长为590nm，发射波长为630nm，测定表达mrfp蛋白菌株的荧光强度值rfu1，同时测定未表达mrfp蛋白菌株的荧光强度值rfu0。此外，分别测定新鲜培养基以及菌悬液的od
600
值od0和od1。
[0056]
mrfp红色荧光蛋白的荧光强度表示为：
[0057][0058]
2.其荧光蛋白表达特性为(图2)：从表2可以看出，p
01095
启动子组菌体荧光强度远大于p
bla
启动子组菌体荧光强度，从对数生长期开始，p
01095
启动子组菌体荧光强度随时间快速增长，在稳定期增长相对缓慢，与菌体生长曲线一致。最终荧光强度与od
600
的比值达到1021。最终本发明鉴定出该序列p
01095
具有木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能，不小于pbla质粒启动子p
bla
的255倍。
[0059]
表2
[0060]
菌株荧光强度/od
600
k.xylinus-p
bla-mrfp4
±
0.21k.xylinus-p
01095-mrfp1021
±
13
[0061]
实施例3
[0062]
木葡萄糖醋杆菌来源强启动子功能的序列应用于木葡萄糖醋杆菌中细菌纤维素的合成。
[0063]
1.木葡萄糖醋杆菌中木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列的重组载体构建。
[0064]
根据已报道的木葡萄糖醋杆菌cgmcc 2955基因组序列，分别以cgmcc2955基因组为模板，以p
01095-pfka-f/r、p
bla-pfka-f/r为引物，pcr扩增目的基因pfka，片段回收后，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得重组载体prbs-p
01095-pfka和prbs-p
bla-pfka。以上所用引物序列如表3所示。
[0065]
表3
[0066][0067]
2.具有木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列的细菌纤维素生产菌的构建。
[0068]
将上述构建的重组载体prbs-p
01095-pfka和prbs-p
bla-pfka转化到大肠杆菌dh5α中，涂布含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上，37℃培养获得重组转化子。正确的重组转化子接种到含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基，过夜培养，提质粒送测序，测序正确的质粒电转化到木葡萄糖醋杆菌中，涂布到含有25g/l的葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的hs固体培养基上，30℃培养获得重组转化子。菌落pcr验证正确的菌株即为正确的转化子k.xylinus-p
01095-pfka和k.xylinus-p
bla-pfka。
[0069]
3.具有木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列的木葡萄糖醋杆菌细菌纤维素生产能力评价。
[0070]
为了测试木葡萄糖醋杆菌中木葡萄糖醋杆菌来源的强启动子功能的序列对菌株产细菌纤维素的影响，分别对k.xylinus-p
01095-pfka、k.xylinus-p
bla-pfka和野生菌进行发
酵测试，种子培养基成份为：葡萄糖，10g/l；酵母粉，7.5g/l；蛋白胨，10g/l；na2hpo4，10g/l；初始ph 6.0。发酵培养基成份为：葡萄糖，25g/l；酵母粉，7.5g/l；蛋白胨，10g/l；na2hpo4，10g/l；初始ph6.0。将上一步得到的两个重组转化子和野生菌分别接种到含有50μg/ml卡那霉素的hs种子培养基和不含卡那霉素的种子培养基，30℃培养24h，然后分别转接到含有50μg/ml卡那霉素的发酵培养基和不含卡那霉素的发酵培养基，初始od
600
控制为0.05，30℃静置发酵培养至稳定期。每个菌株3个平行，发酵结束后进行细菌纤维素膜的处理并检测产量，具体处理方式如下：细菌纤维素静置培养至稳定期，发酵终止，将细菌纤维素取出并用蒸馏水反复清洗以除去纤维素膜表面的发酵液和菌体残留。然后将其浸泡于0.1m naoh溶液中反复清洗至膜呈乳白色。再用蒸馏水浸泡并反复清洗至中性。最后将细菌纤维素放于80℃恒温干燥箱中干燥至恒重。细菌纤维素产量的表示为：g/l(纤维素/培养基)。结果如表4所示，具有木葡萄糖醋杆菌来源启动子功能的序列的菌株较之p
bla
启动子组菌株及野生型菌株的细菌纤维素产量明显提高。
[0071]
表4
[0072]
菌株细菌纤维素产量(g/l)底物转化率％野生型3.12
±
0.1312.48
±
0.52k.xylinus-p
bla-pfka4.35
±
0.1617.4
±
0.64k.xylinus-p
01095-pfka5.13
±
0.0620.52
±
0.24
[0073]
综合上述实施例1-3，可以发现，本发明木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，可以应用于在木葡萄糖醋杆菌中表达不同的目标基因并应用于细菌纤维素的生产。本发明提供了p
01095
启动子基因序列与功能鉴定、各组件构建方法与转入工程菌的方法、基于木葡萄糖醋杆菌表达系统的工作途径与具体应用；具体为：
[0074]
1.本发明具体通过木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定和表达载体prbs，构建优良的高效表达系统。
[0075]
2.本发明所述木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定，具有强启动子功能。
[0076]
3.本发明所述木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，具有开启目的基因大量表达的特性，极大地促进细菌纤维素的合成。
[0077]
以上仅为本发明的较佳实施例，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及
技术实现要素：所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
技术特征：1.一种木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，其特征在于，是木葡萄糖醋杆菌来源的具有启动子功能的序列。2.一种木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，其特征在于，对应于komagataeibacter xylinus cgmcc 2955基因组第232298位至第232501位，命名为p
01095
。3.如权利要求1所述的木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，其特征在于，具有强启动子表达强度。与野生型相比，可以促进细菌纤维素产量提高1.64倍，达到5.13g/l。4.如权利要求1所述的木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，其特征在于，所述序列的核苷酸序列为如下序列：ttccctgccctgagggaggggctgcaatctttagtaatgtttcagttcttgagattgtggtccccttgcggcaagtagatgatgctttccataaatttagaaattttaattcgagacaaccctcctgcggcatgttacagcatgggggtcggttcgggtctggcgattcgccccctgatagacatattgggatgagaagtccc。5.如权利要求1或2所述的木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，其特征在于，启动子表达强度强于pbla质粒启动子p
bla
。6.如权利要求3所述的木葡萄糖醋杆菌来源序列启动子功能的鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用，其特征在于，所述启动子的表达强度峰值不低于pbla质粒启动子p
bla
的255倍。7.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求1-6任一项所述的木葡萄糖醋杆菌来源序列。8.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求1-6或权利要求7所述的木葡萄糖醋杆菌来源序列的表达载体。9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌利用木葡萄糖醋杆菌来源序列，能够实现红色荧光蛋白的表达。10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌来源于木葡萄糖醋杆菌。11.如权利要求1-6任一项所述的木葡萄糖醋杆菌来源序列在木葡萄糖醋杆菌基因改造中的应用。
技术总结本发明公开一种木葡萄糖醋杆菌来源的具有启动子功能的序列及在促进细菌纤维素合成中的应用。所述序列比pBla质粒启动子具有更强的启动子活性。由此可以用于增强目的基因表达，例如将其与磷酸果糖激酶基因可操作地连接，增强了磷酸果糖激酶pfkA的表达强度，由此提高了菌株的细菌纤维素生产效率。提高了菌株的细菌纤维素生产效率。
技术研发人员：辛波 钟成 王旭 彭昭君 李文超 谢燕燕 贾士儒
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2022/7/5
