1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鉴定人博卡病毒的引物组、试剂盒及应用。
背景技术：2.人博卡病毒(human bocavirus，hbov)属于细小病毒科博卡病毒属，是一种dna病毒，容易感染2岁以下的婴幼儿，主要引起肺炎、支气管炎、鼻炎、咽喉炎等呼吸道疾病；通过空气传播，感染率高，病征与普通感冒相似，很难与普通感冒区分开。根据世界范围内对其广泛的流行病学报道，检出率一般介于2-19％。因此，快速、准确的人博卡病毒的鉴定对于及时诊断病因，做到早发现早治疗，减少病情恶化具有重要意义。
3.另外，人博卡病毒也是实验室进行研究常用的模式病原微生物。其作为群体生物，在和宿主、环境的互作中，群体内个体会发生变异，导致检测或治疗方法的失效；对于实验室的研究来说，这种不易被察觉的变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌毒株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。人hella细胞实验室间的异质性已经导致大量的实验结果的不可比较和数据浪费。因此，开发快速、准确的、可监测变异的金黄葡萄球菌人博卡病毒鉴定分析方法对于人博卡病毒的临床治疗、防疫鉴定和科学研究和应用都具有重要意义。
4.经典的人博卡病毒鉴定方法，包括分离培养和基于核酸序列的pcr技术等，人博卡病毒难以分离培养，而且基于分离培养的鉴定技术耗时长、操作复杂、鉴定通量低、不能鉴定变异；基于pcr的鉴定技术鉴定人博卡病毒的准确性和灵敏度低，也不能鉴定序列变异，不利于人博卡病毒的鉴定。
技术实现要素：5.为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种鉴定人博卡病毒的引物组、试剂盒及应用。所述技术方案如下：
6.一方面，本发明提供了一种鉴定人博卡病毒的引物组，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第九引物对、第十引物对、第十一引物对、第十二引物对、第十三引物对、第十四引物对和第十五引物对中的至少一对，每对所述引物对均包括正向引物和反向引物，
7.所述第一引物对的正向引物如序列表中seq id no：1所示，所述第一引物对的反向引物如序列表中seq id no：2所示，所述第二引物对的正向引物如序列表中seq id no：3所示，所述第二引物对的反向引物如序列表中seq id no：4所示，所述第三引物对的正向引物如序列表中seq id no：5所示，所述第三引物对的反向引物如序列表中seq id no：6所示，所述第四引物对的正向引物如序列表中seq id no：7所示，所述第四引物对的反向引物如序列表中seq id no：8所示，所述第五引物对的正向引物如序列表中seq id no：9所示，所述第五引物对的反向引物如序列表中seq id no：10所示，所述第六引物对的正向引物如
序列表中seq id no：11所示，所述第六引物对的反向引物如序列表中seq id no：12所示，所述第七引物对的正向引物如序列表中seq id no：13所示，所述第七引物对的反向引物如序列表中seq id no：14所示，所述第八引物对的正向引物如序列表中seq id no：15所示，所述第八引物对的反向引物如序列表中seq id no：16所示，所述第九引物对的正向引物如序列表中seq id no：17所示，所述第九引物对的反向引物如序列表中seq id no：18所示，所述第十引物对的正向引物如序列表中seq id no：19所示，所述第十引物对的反向引物如序列表中seq id no：20所示，所述第十一引物对的正向引物如序列表中seq id no：21所示，所述第十一引物对的反向引物如序列表中seq id no：22所示，所述第十二引物对的正向引物如序列表中seq id no：23所示，所述第十二引物对的反向引物如序列表中seq id no：24所示，所述第十三引物对的正向引物如序列表中seq id no：25所示，所述第十三引物对的反向引物如序列表中seq id no：26所示，所述第十四引物对的正向引物如序列表中seq id no：27所示，所述第十四引物对的反向引物如序列表中seq id no：28所示，所述第十五引物对的正向引物如序列表中seq id no：29所示，所述第十五引物对的反向引物如序列表中seq id no：30所示。
8.另一方面，本发明实施例提供了一种人博卡病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
9.具体地，所述试剂盒还包括多重pcr预混液。
10.又一方面，本发明实施例提供了一种引物组的应用，所述应用包括：利用所述引物组对人博卡病毒基因组上的15个mnp标记位点中的至少一个进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行非诊断目的的人博卡病毒的定性鉴定、人博卡病毒内部的遗传变异鉴定、人博卡病毒毒株间的遗传变异鉴定、mnp指纹数据库的构建和人博卡病毒的精细分型鉴定，所述15个mnp标记位点的序列如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示。
11.本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的引物组具有较高的特异性和稳定性，使用该引物组的试剂盒具有良好的灵敏度、重现率和准确率。该试剂盒通过引物组检测15个mnp标记位点，根据获得的mnp标记位点的序列进行非诊断目的的人博卡病毒的定性鉴定、人博卡病毒内部及毒株间的遗传变异鉴定、mnp指纹数据库的构建和人博卡病毒的精细分型鉴定。
具体实施方式
12.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
13.本发明实施例提供的人博卡病毒的来源为湖北省疾病预防控制中心赠予。
14.实施例一
15.本发明提供了一种鉴定人博卡病毒的引物组，该引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第九引物对、第十引物对、第十一引物对、第十二引物对、第十三引物对、第十四引物对和第十五引物对中的至少一对，每对引物对均包括正向引物和反向引物，
16.第一引物对的正向引物如序列表中seq id no：1所示，第一引物对的反向引物如序列表中seq id no：2所示，第二引物对的正向引物如序列表中seq id no：3所示，第二引
物对的反向引物如序列表中seq id no：4所示，第三引物对的正向引物如序列表中seq id no：5所示，第三引物对的反向引物如序列表中seq id no：6所示，第四引物对的正向引物如序列表中seq id no：7所示，第四引物对的反向引物如序列表中seq id no：8所示，第五引物对的正向引物如序列表中seq id no：9所示，第五引物对的反向引物如序列表中seq id no：10所示，第六引物对的正向引物如序列表中seq id no：11所示，第六引物对的反向引物如序列表中seq id no：12所示，第七引物对的正向引物如序列表中seq id no：13所示，第七引物对的反向引物如序列表中seq id no：14所示，第八引物对的正向引物如序列表中seq id no：15所示，第八引物对的反向引物如序列表中seq id no：16所示，第九引物对的正向引物如序列表中seq id no：17所示，第九引物对的反向引物如序列表中seq id no：18所示，第十引物对的正向引物如序列表中seq id no：19所示，第十引物对的反向引物如序列表中seq id no：20所示，第十一引物对的正向引物如序列表中seq id no：21所示，第十一引物对的反向引物如序列表中seq id no：22所示，第十二引物对的正向引物如序列表中seq id no：23所示，第十二引物对的反向引物如序列表中seq id no：24所示，第十三引物对的正向引物如序列表中seq id no：25所示，第十三引物对的反向引物如序列表中seq id no：26所示，第十四引物对的正向引物如序列表中seq id no：27所示，第十四引物对的反向引物如序列表中seq id no：28所示，第十五引物对的正向引物如序列表中seq id no：29所示，第十五引物对的反向引物如序列表中seq id no：30所示。
17.在实现时，可以对引物组的碱基进行修饰。
18.本发明实施例提供了一种人博卡病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。
19.具体地，该试剂盒还可以包括多重pcr预混液。
20.本发明实施例提供的引物具体如表1所示。
21.表1为引物组的序列
[0022][0023]
评估该引物组的性能，具体如下：
[0024]
将拷贝数已知的人博卡病毒样本的核酸加入到人基因组dna中，该人基因组dna的来源为本实验室保存的人huh-7细胞系，分别制备成1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应的人博卡病毒模拟样本，同时，设置等体积的无菌水作为空白对照(即0拷贝/反应的样本)。结果共计鉴定了如表2所示的0拷贝/反应、1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应4个样本，每个样本每天使用本发明实施例提供的试剂盒构建3个重复文库，连续构建4天，即每个样本获得12个文库，4个样本共计获得48个文库。48个文库按照等摩尔量进行混合，混合后进行二代测序，每个样本获得12个测序片段组，4个样本获得共计48个测序片段组。
[0025]
文库构建时采用本发明实施例提供的试剂盒对样本进行扩增，得到扩增产物，将该扩增产物连接上购买的商业化样本标签，获得适用于高通量测序的文库并对该文库进行高通量测序，测序结果具体如表2所示。
[0026]
表2为试剂盒鉴定人博卡病毒的48个文库的分析结果
[0027][0028]
表2中：0拷贝/反应的样本均为空白对照组，其它3个梯度的样本均为阳性样本组。
[0029]
针对稳定性和灵敏度的评估
[0030]
结合表2可知，在每个样本的12组重复实验中(每天3个重复，共计重复4天)，空白对照和人博卡病毒核酸标准品中均稳定地检出数目接近的人博卡病毒的mnp标记位点，可见本发明实施例提供的试剂盒鉴定人博卡病毒的稳定性良好。在10拷贝/反应的样本能稳定地检出6个以上本发明实施例提供的mnp标记位点，而在0拷贝/反应的部分样本且最多能检出1的mnp标记位点，可见本发明实施例提供的试剂盒鉴定人博卡病毒的灵敏度可低至10拷贝/反应。
[0031]
针对重现率和准确率的评估
[0032]
基于每个样本的12组重复实验，任意两次重复实验中，采用共同检出的mnp标记位点的基因型是否可重现用于评估鉴定人博卡病毒的重现率和准确率。具体地，对100拷贝/反应的样本的12组数据分别进行成对比较，主基因型存在差异的mnp标记位点数目都为0；依据2组重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则进行评估，准确率a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r，式中r代表重现率，重现率为主基因型可重现的位点数目占共有位点数目的比率。结果如表3所示。
[0033]
表3为重现率和准确率的评估
[0034][0035]
由表3可知，重现率实验中每个样本的不同文库间和不同建库批次间共同鉴定mnp标记的主基因型存在差异的数目为0，即重现率r＝100％，准确率a＝100％。
[0036]
针对质控方案和检出判定阈值的制定
[0037]
由于mnp标记位点鉴定方法的极度灵敏，致使在部分空白对照中也检出了人博卡病毒的序列，可见该鉴定过程中的数据污染容易出现假阳性的结果。本组实验设置了0拷贝/反应的样本的空白对照样本，1个拷贝/反应和10拷贝/反应的弱阳性的样本，并进行了连续4天的重复鉴定，可用于质控体系污染和目标病原体检出的阈值和判定标准。
[0038]
质控方案具体如下：
[0039]
1)测序数据量大于20兆碱基。基于对空白对照样本，1个拷贝/反应和10拷贝/反应的弱阳性样本的多次检验，当测序数据量不大于20兆碱基时，含人博卡病毒10拷贝/检验及以上的样品会出现检出mnp标记位点不足3个，且增加测序量也不能满足检出mnp标记位点达到3个的情况；而当测序数据量大于20兆碱基时，所有含人博卡病毒10拷贝/检验及以上的样品的检出mnp标记位点都不少于3个。
[0040]
2)根据测试样本中的人博卡病毒的信号指数s
t
和空白对照中人博卡病毒的噪音指数sc判定污染是否可以接受，其中：
[0041]
空白对照的噪音指数sc＝nc/nc，其中nc和nc分别代表空白对照中的人博卡病毒的测序片段的数量和总测序片段的数量。
[0042]
测试样本的信号指数s
t
＝n
t
/n
t
，其中n
t
和n
t
分别代表测试样本中的人博卡病毒的测序片段的数量和总测序片段的数量。
[0043]
根据预期的检测下限，根据在含人博卡病毒的量呈梯度的测试样本和平信测定的空白对照中的人博卡病毒信噪比r值，即s
t
和sc的比值，设置污染是否可以接受的阈值。
[0044]
为了保证准确，并兼顾灵敏度，本发明实施例设置的r值至少要达到10，即样本中信号指数至少是空白对照中噪音指数的10倍。
[0045]
3)统计每个样本中mnp标记位点的检出数目。
[0046]
在本实施例中，信号指数/噪音指数的比值(信噪比)具体如表4所示，在本实施例
表4中，信噪比中的信号指数和噪音指数均为12组实验数据的平均值。表4为样本中人博卡病毒的信噪比
[0047][0048][0049]
结合表4可知，人博卡病毒1个拷贝/反应的样本和空白对照的信噪比的平均值是5.5，最大值是6(最大信号指数/平均噪音指数)，因此，本发明规定当信噪比不小于10时，可判定鉴定体系中的污染是可接受的，且样本中含有人博卡病毒。为了避免少数污染位点过度扩增带来的高信噪比，本发明同时将检出位点数目作为判定条件之一。结合表2可知，在1拷贝/反应的样本能检出最多2个mnp标记位点，在10拷贝/反应的样本能稳定地检出至少6个mnp标记位点，因此本发明规定：
[0050]
1)当信噪比不小于10，且位点检出数目不小于3个时，判定样本中检出人博卡病毒的核酸；
[0051]
2)当信噪比不大于1，且检出标记数目为0个时，判定样本中未检出人博卡病毒的核酸；
[0052]
3)其余情况判为样本中疑似检出人博卡病毒的核酸。
[0053]
由此可见，该引物组能灵敏地鉴定到低至10拷贝/反应的人博卡病毒，具有极高的鉴定灵敏度和稳定性。
[0054]
针对特异性的评估
[0055]
将人博卡病毒和结核分枝杆菌、金黄葡萄球菌、不动杆菌属菌株、百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、eb病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、肺炎克雷伯杆菌、军团菌属、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、立克次氏体属、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌的dna按照等拷贝数混在一起，制备成混合模板，以空白样本作为对照，采用本发明实施例提供的引物组对混合模板中的人博卡病毒
进行检测。并进行3次重复实验，按照上述质控方案和判定阈值进行分析后，在3次重复实验中都能检出混合模板中的人博卡病毒的15个mnp标记位点，3次重复实验中，信噪比最小的达到689.4，按照本发明提供的质控方案，在3次重复中人博卡病毒均判为检出，检出率均达到100％。对于其它菌的信噪比均小于10，可见本发明实施例提供的引物组在复杂模板中鉴定人博卡病毒的特异性较高。
[0056]
实施例二
[0057]
本发明实施例提供了一种引物组的应用，该应用包括：利用引物组对人博卡病毒基因组上的15个mnp标记位点进行鉴定，根据获得的mnp标记位点的序列进行人博卡病毒菌株间的遗传变异鉴定，15个mnp标记位点的序列如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示。
[0058]
下面简单介绍一下mnp(多核苷酸多态性)标记位点的制备方法：
[0059]
基于网上公开的3794个人博卡病毒不同分离株的基因组完整或部分序列，通过序列比对，获得15个mnp标记位点。对于网上不存在基因组数据的物种，也可以通过高通量测序获得待鉴定微生物物种代表小种的基因组序列信息，其中高通量测序可以是全基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性，一般使用至少10个遗传上具有代表性的分离株的基因组序列作为参考。选择人博卡病毒的一个或多个代表株的基因组序列作为参考基因组，将该基因组序列和参考基因组进行序列比对，获得人博卡病毒各毒株的单核酸多态性位点；
[0060]
在参考基因组上，以100-300bp为窗口，以1bp为步长进行窗口平移，筛选获得多个候选mnp标记位点区域，其中，候选mnp标记位点区域含有≥2个单核苷酸变异位点，且两端各30bp的序列上均不存在所述单核酸多态性位点；
[0061]
在候选多核苷酸多态性位点区域中筛选区分度dp≥0.2的区域作为mnp标记位点；其中，dp＝d/t，t是在候选多核苷酸多态性位点区域中所有小种两两比较时的比较对数，d是在候选多核苷酸多态性位点区域中至少两个单核酸多态性差异的样本对数。获得如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示的mnp标记位点(mnp_1～mnp_15)，mnp_1～mnp_15在参考序列上的起始位置如表5所示，且mnp_1～mnp_15的序列如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示。
[0062]
表5为mnp标记位点在参考序列上的起始位置
[0063][0064][0065]
利用本发明实施例提供的引物组对同一个人博卡病毒的不同时期的6份拷贝毒株进行鉴定，6份拷贝毒株依次命名为s-1～s-6，每个拷贝毒株的测序平均覆盖倍数达1503倍，每个拷贝毒株均可以检出表5中全部15个mnp标记位点。将6个拷贝毒株的指纹图谱进行两两比对，结果如表6所示。
[0066]
表6为6份拷贝毒株的鉴定分析
[0067][0068]
由表6可知，有1份(s-2)拷贝毒株和同批次一起鉴定的5份拷贝毒株均存在部分位点的主基因型差异，可见同一个人博卡病毒的不同时期存在毒株间变异。使用引物组鉴定菌株间遗传变异可以用于保证不同实验室相同命名人博卡病毒毒株的遗传一致性，从而保证研究结果的可比较性，这对于人博卡病毒的科学研究具有重要意义。而在临床上，可针对差异位点是否影响抗药性斟酌诊断方案。
[0069]
实施例三
[0070]
本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对人博卡病毒基因组上的15个mnp标记位点进行人博卡病毒内部的遗传变异鉴定，15个mnp标记位点的序列如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示。
[0071]
人博卡病毒作为群体生物，在保存和繁殖的过程中，部分个体会发生变异，形成杂合的群体，从而影响试验用人博卡病毒表型的稳定性和一致性。这种变异体在对群体进行分子标记检测时，表现为位点的主基因型以外的等位基因型。当变异个体占群体的极少部分时，变异个体表现为低频率的等位基因型。低频率的等位基因型和技术错误混在一起，导致现在的技术难以区分，需要判定鉴定到的次等位基因型的真实性。
[0072]
本实施例次等位基因型的真实性评估按如下进行：首先按照以下规则排除具有链偏好性(在dna双链上覆盖的测序序列数的比值)的等位基因型：链偏好性大于10倍，或者与主等位基因型的链偏好性之差大于5倍。
[0073]
不存在链偏好性的基因型基于表7测序序列数目和比例判定其真实性。表7列出了在部分测序深度下，在各个位点中次等位基因型的测序序列数目需满足的临界值。
[0074]
表7为部分测序深度下进行判定次等位基因型的临界值
[0075][0076][0077]
表7涉及到的参数emax(n＝1)和emax(n≥2)指的是在本实施例中调查的930个纯合mnp标记位点中，获得的和主基因型存在n个snp的次等位基因的频率的最大值。次等位基因型的频率是指该次等基因型的测序序列数占所在mnp标记位点总测序序列数的比例。
[0078]
具体地，由表7可知，基于binom.inv函数计算在α＝99.9999％的概率保障下，与主基因型存在1个(n＝)或多个(n≥2，即mnp)snp的等位基因型的技术错误率emax(n＝1)和emax(n≥2)分别为1.03％和0.0994％时，在各个位点中次等位基因型的测序序列数目需满足的临界值。只有次等位基因型的测序序列数目超过临界值时判定为真实的次等位基因型。当存在多个候选次等位基因时，对各候选等位基因型的p值进行多重校正，fdr(false discovery rate，错误发现率)《0.5％的候选等位基因判定是真实的次等位基因型。
[0079]
按照上述参数，将表6中提供的基因型存在差异的两个毒株的核酸分别按照以下8
个浓度比例：1/1000、3/1000、5/1000、7/1000、1/100、3/100、5/100和7/100进行混合，得到人工杂合样本，每个人工杂合样本重复检测3次，获得共计24个测序数据。通过和两个毒株的如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示的mnp标记位点的基因型进行精准比对，在24个人工杂合样本中均鉴定到了存在真实次等位基因型的位点，这说明本发明实施例提供的如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示的mnp标记位点适用于人博卡病毒内部的遗传变异鉴定。在本实施例中，采用上述15个mnp标记位点共同进行人博卡病毒内部的遗传变异鉴定，在其他实施例中，还可以采用上述15个mnp标记位点中的任一个或任意几个的组合进行人博卡病毒内部的遗传变异鉴定。
[0080]
实施例四
[0081]
本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对人博卡病毒基因组上的15个mnp标记位点进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行mnp指纹数据库的构建，15个mnp标记位点的序列如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示。
[0082]
将实施例二提供的6份拷贝毒株s-1～s-6,利用常规ctab法提取用于构建人博卡病毒dna指纹数据库的所有毒株的dna，采用琼脂糖凝胶电泳进行收集，得到产物，将产物通过紫外分光光度计检测dna的质量。若所提取的dna在230nm与260nm处的吸光度值的比值大于2.0，260nm与280nm吸光度值比值介于1.6与1.8之间，且dna电泳主带明显，则说明基因组dna达到相关的质量要求，可进行后续序列比对。
[0083]
将实施例二提供的6份拷贝毒株s-1～s-6的测序数据进行序列比对后，获得每个毒株的序列表中seq id no：31至seq id no：45所示的mnp标记位点位点的主基因型，从而形成每个毒株的mnp指纹图谱，录入数据库文件，构建成人博卡病毒dna指纹数据库。所构建的mnp指纹数据库基于检测的毒株的基因序列，因此和所有的高通量测序数据兼容。通过将每次检测获得的毒株的mnp指纹图谱同已构建的mnp指纹数据库进行比对，将主基因型存在差异的毒株的mnp指纹图谱所构建的mnp指纹数据库，实现数据库的共建共享和时时更新。在本实施例中，采用上述15个mnp标记位点共同进行mnp指纹数据库的构建，在其他实施例中，还可以采用上述15个mnp标记位点中的任一个或任意几个的组合进行mnp指纹数据库的构建。
[0084]
实施例五
[0085]
本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对人博卡病毒基因组上的15个mnp标记位点进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行人博卡病毒精细分型中的应用，15个mnp标记位点的序列如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示。
[0086]
利用本发明实施例一提供的引物组对上述6份人博卡病毒毒株进行检测，获得了每个毒株mnp指纹图谱。将每个毒株的dna指纹图谱进行两两比对和与构建的指纹数据库以及公开的人博卡病毒分离株的基因组序列进行比对，与已有的指纹数据库相同的，为已有的变异株；至少在一个mnp标记位点存在主基因型差异的，定义为新的变异株，实现对人博卡病毒的精细分型。对6份人博卡病毒毒株的检测如表7所示，所检测的6份人博卡病毒有1份和其它5份在5个mnp标记位点的主基因型存在差异，为不同的变异变型。5份指纹图谱一致的毒株和已有的菌株的基因型一致，为已有的变异株。因此，该应用对人博卡病毒的分辨率达到了单碱基的水平，可以实现对样本中人博卡病毒的精细分型。在本实施例中采用上述15个mnp标记位点共同进行人博卡病毒的精细分型，在其他实施例中也可以采用上述15
个mnp标记位点中的任一个或任几个的组合进行人博卡病毒的精细分型。
[0087]
实施例六
[0088]
本发明实施例提供了一种引物的应用，应用包括:分别应用15对引物对中的任意一对，采用本发明提供的试剂盒，对表2所示的100拷贝/反应的人博卡病毒样品进行检测，获得15组测序数据。对每组数据进行分析，每对引物对检测到的序列都仅能比对到对应的mnp标记，表明每个引物对都能检出对应的mnp标记。而本发明所筛选的mnp标记是人博卡病毒基因组上特异的，如特异性评价部分实施例所示，从而表明每对引物对都可以用来鉴定100拷贝/反应及以上浓度的人博卡病毒。
[0089]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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技术特征：1.一种鉴定人博卡病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对、第七引物对、第八引物对、第九引物对、第十引物对、第十一引物对、第十二引物对、第十三引物对、第十四引物对和第十五引物对中的至少一对，每对所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第一引物对的正向引物如序列表中seq id no：1所示，所述第一引物对的反向引物如序列表中seq id no：2所示，所述第二引物对的正向引物如序列表中seq id no：3所示，所述第二引物对的反向引物如序列表中seq id no：4所示，所述第三引物对的正向引物如序列表中seq id no：5所示，所述第三引物对的反向引物如序列表中seq id no：6所示，所述第四引物对的正向引物如序列表中seq id no：7所示，所述第四引物对的反向引物如序列表中seq id no：8所示，所述第五引物对的正向引物如序列表中seq id no：9所示，所述第五引物对的反向引物如序列表中seq id no：10所示，所述第六引物对的正向引物如序列表中seq id no：11所示，所述第六引物对的反向引物如序列表中seq id no：12所示，所述第七引物对的正向引物如序列表中seq id no：13所示，所述第七引物对的反向引物如序列表中seq id no：14所示，所述第八引物对的正向引物如序列表中seq id no：15所示，所述第八引物对的反向引物如序列表中seq id no：16所示，所述第九引物对的正向引物如序列表中seq id no：17所示，所述第九引物对的反向引物如序列表中seq id no：18所示，所述第十引物对的正向引物如序列表中seq id no：19所示，所述第十引物对的反向引物如序列表中seq id no：20所示，所述第十一引物对的正向引物如序列表中seq id no：21所示，所述第十一引物对的反向引物如序列表中seq id no：22所示，所述第十二引物对的正向引物如序列表中seq id no：23所示，所述第十二引物对的反向引物如序列表中seq id no：24所示，所述第十三引物对的正向引物如序列表中seq id no：25所示，所述第十三引物对的反向引物如序列表中seq id no：26所示，所述第十四引物对的正向引物如序列表中seq id no：27所示，所述第十四引物对的反向引物如序列表中seq id no：28所示，所述第十五引物对的正向引物如序列表中seq id no：29所示，所述第十五引物对的反向引物如序列表中seq id no：30所示。2.一种鉴定人博卡病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重pcr预混液。4.一种如权利要求1所述的引物组的应用，其特征在于，所述应用包括：利用所述引物组对人博卡病毒基因组上的15个mnp标记位点中的至少一个进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行非诊断目的的人博卡病毒的定性鉴定、人博卡病毒毒株间及毒株内的遗传变异监测、mnp指纹数据库的构建和人博卡病毒的精细分型鉴定，所述15个mnp标记位点的序列如序列表中seq id no：31至seq id no：45所示。
技术总结本发明公开了一种鉴定人博卡病毒的引物组、试剂盒及应用，属于生物技术领域。所述引物组包括如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：30所示的引物。本发明提供的MNP标记位点是人博卡病毒特异的且在物种内部多态的基因组区域。所述引物组对所述MNP标记位点的扩增具有较高的稳定性和特异性；使用该引物组的试剂盒对人博卡病毒的鉴定具有良好的灵敏度、稳定性、较高的重现率和准确率。所述引物组和试剂盒能够用于非诊断目的的人博卡病毒的定性鉴定、毒株内部及毒株间的遗传变异监测、数据库的构建和精细分型。精细分型。
技术研发人员：彭海 江永忠 刘琳琳 李论 高利芬 方斌 张婷 蔡昆 雷亚克 余晓
受保护的技术使用者：湖北省疾病预防控制中心（湖北省预防医学科学院）
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2022/7/5
