1.本发明涉及微生物领域，更具体地，涉及重金属抗性菌及其应用。
背景技术：2.重金属作为一种污染物，由于其具有较大的毒性，因而成为水体污染中危害极大的一种。水体重金属主要是指水体中的铅、锌、镍、锰、钴等金属离子的浓度超过了一定的浓度标准而引起的。重金属对人类的伤害主要表现在两个方面，一方面通过直接饮水造成重金属中毒而损害人类机体，另一方面是通过污染农产品或者水产品，通过食物链的方式间接危害人类健康。重金属能够抑制人体内酶活动使细胞中毒，从而影响人类神经组织以及肝肾等组织。
3.水体中的重金属大多来自工业领域，包括采矿业、冶金业、选矿业、制革、油漆和电镀业等。由于某些原因未经处理的废水就排入湖泊、河流以及海洋中，造成水体重金属污染。例如：锌主要来自纺织工业，镍來自微电子业，钴来自塑料工业等。水体中的重金属在其浓度很小时就会产生毒性，具有高度危害性和难治理性。
4.重金属铅元素的来源较为广泛，工业产生的三废、城市交通过程中的尾气排放及轮胎磨损是铅污染的主要来源。尤其铅锌冶炼厂排放的废水中含有大量的铅元素，对周边的土壤污染严重，大气中的铅离子也随着降雨、沉降等过程，落入到土壤和水体中。土壤中的重金属铅元素通过降附、径流等途径最终流入地下水和湖泊中，因此水体成为重金属铅污染的最终介质，因此对含铅废水污染的治理和控制受到人们的不断关注。人类长期生活在铅污染环境下，可能会导致智力低下、精神病、肾脏损伤等甚至可能死亡。
5.2010年10月1日起正式实施的新国家标准《铜、镍、钴工业污染物排放标准》(gb25467—2010)规定水体中镍的最高排放浓度为0.5mg/l，铅的最高排放浓度为0.2mg/l。重金属治理，主要有物理、化学和生物修复。而生物修复中常用的微生物修复法由于经济、生态效益等优点，在重金属污染治理中占有重要地位。
6.微生物修复法是利用细菌、真菌等微生物对水体中的重金属进行吸附的过程，主要原理是利用水体中的微生物或者经驯化的高效微生物，在适当的条件下，通过微生物的还原反应将重金属离子还原或吸附成团沉淀，降低水体种的重金属含量。
技术实现要素：7.本技术提供了一种重金属抗性菌，所述重金属抗性菌为蜡样芽孢杆菌，所述重金属抗性菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no：61982，分类命名为：bacillus cereus。
8.在一些实施例中，重金属包括铜、锌、镍、锰、铅、钴。
9.在一些实施例中，本技术还提供了重金属抗性菌在重金属污染水体或土壤治理中的应用。
10.本技术利用土壤环境中的微生物对重金属污染物进行钝化吸附来降低水体和土
壤中的毒性，具有成本低、效率高和不会产生二次污染等优点。
附图说明
11.图1示出了本技术的重金属抗性菌在mha培养基上的形态的图片。
12.图2和图3分别示出了本技术的重金属抗性菌在铅的浓度分别为 2500mg/l和3000mg/l时的生长状态。
13.图4和图5分别示出了本技术的重金属抗性菌在显微镜下观察的图片。
14.图6示出了本技术的重金属抗性菌的系统进化树。
15.图7示出了不同ph值的mhb溶液对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的柱状图。
16.图8示出了铜离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
17.图9示出了锌离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
18.图10示出了镍离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
19.图11示出了铅离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
20.图12示出了锰离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
21.图13示出了钴离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
22.图14示出了本技术的重金属抗性菌对铅离子的去除率的柱状图。
23.图15示出了本技术的重金属抗性菌对镍离子的去除率的柱状图。
24.图16示出了本技术的重金属抗性菌对铅离子的去除率的柱状图。
25.图17示出了本技术的重金属抗性菌对镍离子的去除率的柱状图。
26.图18示出了本技术的重金属抗性菌对铜离子的去除率的柱状图。
27.本技术的重金属抗性菌，菌株属于蜡样芽孢杆菌，于2021年10月27 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no：61982，分类命名为：bacillus cereus，将该保藏材料命名为：bacillus cereusmpeb0011207，保藏地址为：广州市先烈中路100大院59号楼5楼。
具体实施方式
28.下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
29.本技术提供一种重金属抗性菌，菌株属于蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)，于2021年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no：61982。该菌株表现出比较强的重金属耐受性能，对铅和镍有较强的去除作用，可利用该菌株用于重金属污染的水体和土壤的生物修复。
30.本发明提供的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)分离自广西锰矿周边土壤中分离纯化，是具有耐重金属微生物特征的细菌菌株。该菌的筛选步骤如下：土壤来自广西锰矿附近，这里的土壤含锰在60-188g/kg，含钴是 100-200mg/kg。将1mg土壤样品加入到装有50ml mh肉汤培养基(mhb，牛肉粉2g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l，ph 7.4)的250ml 锥形瓶中，将锥形瓶放置在35℃，150rpm摇床中培养24h后，取其中1ml 加入pb
2+
浓度为350mg/l的溶液中培养48h，再转入pb
2+
浓度为450mg/l 的培养基中继续培养48h。取最后溶液中的20ul培养液在含pb
2+
2000mg/l 的固体培养基上划线培养。挑选不同形态的单克隆
分别接种到未加任何金属离子的mh琼脂(mha，牛肉粉6g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l，琼脂17g/l，ph 7.3)中培养24h。直到培养出菌落特征一致的纯菌种。将分离得到的菌株进行多种重金属最小抑菌浓度(mic)测定。测定方法采用96孔板筛选。即用含锰、镍、铜、锌、钴等重金属浓度为100-3500mg/l的培养基在96孔板中对菌株进行重金属mic检测，于35℃培养基中培养48h，重复3次。选择其中对这些重金属耐受性最高的菌株为目标菌株，并进行菌株鉴定。
31.蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)的特征描述如下：
32.形态：该菌株在mha平板上，35℃，培养24h，其菌落形态呈现不规则形状，扁平生长，无色素，不透明，表面光滑，有光泽，无粘稠度，培养基颜色无变化(图1)；在含铅离子的培养基中该菌落为棕褐色，边缘突起有皱褶。通过显微镜观察，菌体为长杆状，有芽孢(图2和图3)。对该菌株进行革兰氏染色，显示为革兰氏阳性菌(图4和图5)。
33.金属耐受性：将复壮16h的以4％的比例加入含镍(硝酸镍)0、100、 400、500、6000mg/l的mhb培养液中，结果显示，ni
2+
的最大耐受大于 600mg/l。此外，该菌株对zn
2+
(硫酸锌)的最高耐受浓度为1200mg/l，对铜(硫酸铜)最大耐受大于400mg/l。对铅(硝酸铅)的最大耐受为3000mg/l；对锰(氯化锰)的最大耐受大于6000mg/l。对钴(硫酸钴) 的最大耐受大于300mg/l。
34.先进性：该菌株对几类重金属的耐受显著高于已有报告(ni
2+
：350 mg/l；cu
2+
：300mg/l；zn
2+
：800mg/l；pb
2+
：2000mg/l)。
35.16s分析：从菌株纯培养物中提取基因组dna，利用通用软件27f和 1492r进行扩增和测序，进一步通过mega软件构建系统进化树(图6)。结果显示该菌为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)。
36.生理生化反应特征：该菌的ph生长适宜范围为的ph5-10，本菌株能耐受碱性环境(图7)。
37.cu
2+
溶液浓度的影响：将cu
2+
的浓度设为3个，单位为mg/l。0为不加任何金属离子的mhb(对照)，从图8可以看出该菌对铜的最大耐受是400-800mg/l之间的值。600mg/l的时候，菌株生长出现滞后，重金属对细菌生长有抑制作用。在800mg/l的时候，菌株不生长。判断其最大浓度在400mg/l和600mg/l之间。
38.zn
2+
溶液浓度的影响：将zn
2+
的浓度设为3个，对照为不加金属的 mhb，从图9可以看出该菌对锌的最大耐受超过1200mg/l。
39.ni
2+
溶液浓度的影响：将ni
2+
的浓度设为3个，0为不加金属的mhb，从图10可以看出该菌对ni
2+
的最大耐受在800mg/l左右，ni
2+
浓度为 1000mg/l时，菌无生长。
40.pb
2+
溶液浓度的影响：将pb
2+
的浓度设为2个，单位为mg/l。0为不加任何金属离子的mhb，从图11可以看出该菌对铅的最大耐受是2500mg/l-3500mg/l间的值。2500mg/l的时候，菌株生长出现滞后，8h 后开始生长。重金属对细菌生长有抑制作用。在3500mg/l的时候，菌株生长缓慢。
41.mn
2+
溶液浓度的影响：将mn
2+
的浓度设为3个，单位为mg/l。对照为不加任何金属离子的mhb，从图12可以看出该菌对mn
2+
的最大耐受大于6000mg/l。
42.co
2+
溶液浓度的影响：将co
2+
的浓度设为2个，单位为mg/l。0为不加任何金属离子的mhb，从图13可以看出该菌对co
2+
的最大耐受在 300mg/l和400mg/l之间。
43.重金属去除特性：将本发明提供的蜡样芽孢杆菌接种到10mg/l的镍水溶液中，3h对镍的去除率可达90％以上。其余重金属的吸附效果见表1，表1示出了菌株对不同重金属污染水体21h的去除率。
44.表1
[0045][0046]
吸附实验过程：
[0047]
活化菌体制备：在mhb培养基中按2％的接种量接入菌株的种子液， 35℃，150rpm恒温摇床培养18h。将该液体作为活化菌体备用。湿菌体的制备：在mhb培养基中按2％的接种量接入菌株的种子液，35℃，150rpm 恒温摇床培养18h。8000r/min离心10min收集菌体，用超纯水洗涤菌体3 次，将湿菌体作为生物吸附剂。在一定的ph(例如，7.2)和温度(25℃) 下，将活化菌体按4％体积的量投加到已知浓度重金属的mhb溶液中， 150rpm恒温振荡一定时间后，取样，8000r/min离心10min，用spectraa220 型原子吸收分光光度计测定上清中剩余重金属的浓度，计算去除率。另外，也可以采用下述步骤计算去除率：在一定的ph和温度下，将一定量的湿菌体投加到已知浓度的重金属溶液中，150rpm恒温振荡一定时间后，取样，8000r/min离心10min，用spectraa220型原子吸收分光光度计测定上清中剩余重金属的浓度，计算去除率。
[0048]
菌株对重金属的去除率r的计算方法
[0049][0050]
其中，r为重金属的去除率，c0为重金属的初始浓度(mg/l)，ce 为平衡时溶液中重金属的浓度(mg/l)。
[0051]
下面描述菌株对各金属浓液的去除率：
[0052]
将活化的细菌以4％的比列接种到含有金属离子的mhb溶液中，分3 个时间段，每个时间段3个重复，测定离心后溶液中的金属离子浓度。去除率的计算方法如上所述。得到的对pb和ni的去除率的结果如图14和图15所示。
[0053]
另外，将体积比为4％的湿菌体投加到已知浓度的重金属溶液中， 150rpm恒温振荡10min后，取样，8000r/min离心10min，用spectraa220 型原子吸收分光光度计测定上清中剩余重金属的浓度，计算去除率。得到的对pb、ni和cu的去除率的结果如图16、图17和图18所示。
[0054]
由上可知，针对不同浓度的重金属溶液，菌株对该重金属的去除率会有所不同。另外，由于活化菌体与湿菌体的菌含量的不同，使得针对同样浓度的重金属，去除率也会有所不同。
[0055]
bacillus cereus mpeb0011207菌对mn
2+
、ni
2+
、cu
2+
、pb
2+
、zn
2+
、 co
2+
都表现较强的耐受能力。在ph 5-10的溶液中能较好的生存。对ni
2+
、 cu
2+
、pb
2+
有良好的去除作用。因此，
该菌可用于重金属污染水体或土壤环境的修复。
[0056]
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本技术的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
技术特征：1.一种重金属抗性菌，其特征在于，所述重金属抗性菌为蜡样芽孢杆菌，所述重金属抗性菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no：61982，分类命名为：bacillus cereus。2.根据权利要求1所述的重金属抗性菌，其特征在于，重金属包括铜、锌、镍、锰、铅、钴。3.根据权利要求1所述的重金属抗性菌在重金属污染水体或土壤治理中的应用。
技术总结本申请公开了一种重金属抗性菌，该重金属抗性菌为蜡样芽孢杆菌，重金属抗性菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：61982。重金属包括铜、锌、镍、锰、铅、钴。本申请还提供了重金属抗性菌在重金属污染水体或土壤治理中的应用。本申请的重金属抗性菌对Mn
技术研发人员：王承民 季芳 赵佳男 王雪 魏磊 王猛 张秀娟 李林妙 贾仲昕
受保护的技术使用者：广东省科学院动物研究所
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2022/7/5
