一种具有宽pH适用范围抗菌材料及其制备方法与应用

一种具有宽ph适用范围抗菌材料及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及抗菌功能性材料技术领域，具体涉及一种具有宽ph适用范围抗菌材料及其制备方法与应用。
2.

背景技术：

3.随着社会的发展和人们生活水平的提高，人们对自己的生活质量和卫生条件越来越关注，细菌是常见的病原微生物，影响人类尤其是伤病患者的健康。受伤患者的伤口感染是导致创面久治不愈的一大重要病理因素，近年来，基于经济安全、耐用、高效抗菌的功能材料的开发和应用受到人们越来越多的关注。主要抗菌原理是破坏细菌的细胞膜结构，导致细胞膜内物质的流失、损伤或变性，影响细胞活性，最终使得微生物死亡。传统抗菌材料多是引入金属或金属氧化物纳米粒子或对应的盐来达到抗菌特性，但细菌生长繁殖环境是复杂化的，会因细菌种类不同而发生酸碱性变化。部分抗菌材料存在对细菌繁殖的ph作用范围窄这一问题，即只能在一小段ph范围内具有高效抗菌性，超出这一范围，抗菌效果会明显减弱甚至是消失，另外还存在对耐药性菌株的选择性、具有一定环境毒性、工艺复杂等问题，影响了其进一步的应用与发展，因此，制备具有生物相容性良好、广谱抗菌性、宽ph适用范围的抗菌材料具有重要意义。
4.

技术实现要素：

5.解决的技术问题：针对现有技术中存在的问题，本发明提出一种具有宽ph适用范围抗菌材料及其制备方法与应用，具有制备工艺简便，绿色无毒等优点，更重要的是解决了以往抗菌材料ph作用局限性，在宽ph适用范围的抗菌材料上有了新的突破。
6.技术方案：一种具有宽ph适用范围抗菌材料的制备方法，步骤如下：步骤一.将双丙酮丙烯酰胺(daam)溶于去离子水，配制质量分数为10-15%的双丙酮丙烯酰胺溶液，充分搅拌20min；步骤二.将海藻酸钠(sa)溶于去离子水，配制质量分数为2-6%的海藻酸钠溶液，超声消泡2-6 h；步骤三.将海藻酸钠进行改性，将步骤一与步骤二制得的溶液混合并置于油浴锅中加热搅拌，以过硫酸钾（k2s2o8）作为引发剂，加入过硫酸钾，温度为80-100℃，搅拌2-4 h，然后冷却至室温后取出，制得改性海藻酸钠(dsa)；步骤四.将聚赖氨酸(pl)溶于去离子水，配制质量分数为4-8%的聚赖氨酸溶液；步骤五.将步骤三与步骤四制得的改性海藻酸钠和聚赖氨酸溶液依次滴加在24孔板内，液面分层明显，静置反应8-12 h，将液面交界处生成的薄膜取出并多次清洗，冷冻干燥得到改性海藻酸钠/聚赖氨酸(dsa/pl)复合薄膜；步骤六.将漆酶溶于ph为3-5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴搅拌30 min配制浓度
为5-15 mg/ml的漆酶溶液；步骤七.将单宁酸溶于ph=5.8的磷酸盐缓冲液中，配制质量分数5-10%的单宁酸溶液，将步骤六制得的漆酶溶液混合到单宁酸溶液中进行催化氧化，催化条件为：在30℃恒温条件下，摇床速率为100-200 rpm，时间为4-6 h，取出容器手动摇匀得到单宁酸低聚体溶液（为了更好地摇匀，可以定期取出容器，1h/次），调节溶液ph=8.5；步骤八.将步骤五制得的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于步骤七制得的单宁酸低聚体溶液中浸泡4-6 h，在温度为30-40℃条件下摇床振荡，速率为100-150 rpm，取出洗净得到单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸(ta-dsa/pl)复合材料；步骤九.将步骤八制得的单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料放置于1-5 wt%的百里酚溶液中浸泡4-6 h（可适当添加甘油来促溶），在温度为30-40℃条件下摇床震荡，速率为100-150 rpm，取出洗净，在恒温恒湿箱中干燥得到具有宽ph范围抗菌特性的百里酚-单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸(thymol-ta-dsa/pl)复合材料。
7.作为优选，所述步骤三中双丙酮丙烯酰胺溶液、海藻酸钠溶液和过硫酸钾的比值为20ml：20~60ml：5~15mg。
8.作为优选，所述步骤五中改性海藻酸钠和聚赖氨酸溶液的体积比为1：1。
9.作为优选，所述步骤七中漆酶溶液与单宁酸溶液的体积比为1:(3~5)。
10.作为优选，所述步骤九中恒温恒湿箱设置温度范围为20~37℃，湿度为30-50% rh。
11.上述方法制备的具有宽ph适用范围抗菌材料。
12.上述具有宽ph适用范围抗菌材料在制备创面抗菌材料中的应用。
13.有益效果：（1）本发明以生物相容性良好的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜为基材，预先对海藻酸钠进行疏水改性制得双亲性海藻酸钠，使其达到在溶液环境中尺寸稳定的目的，提高抗菌剂的负载率与固定量；（2）本发明采用多酚氧化酶漆酶催化单宁酸，使得单宁酸自聚形成单宁酸低聚物，提高了单宁酸抗菌效果。单宁酸低聚体通过席夫碱作用或迈克尔加成反应固定于改性海藻酸钠/聚赖氨酸薄膜上，负载牢固。
14.（3）本发明选用的抗菌剂为在不同ph环境下抗菌效果良好的单宁酸与百里酚两种天然抗菌剂，具有广谱抗菌性、高效持久性、良好的生物相容性、来源广泛等优点，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在ph=3-8的范围内抗菌率》98%，最高可达99.99%的杀伤效果，具有优异的抗菌效果。
15.（4）本发明的制备工艺简单，操作方便，绿色环保。
16.附图说明
17.图1为本发明的抗菌材料基材的表面微观结构图与截面图；图2为本发明的抗菌材料在不同溶液环境下的溶胀增重率曲线图；图3为本发明的抗菌材料的抗菌效果图；图4为本发明的细胞毒性示意图。
18.具体实施方式
19.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
20.实施例1本实施例中一种具有宽ph适用范围抗菌特性的抗菌材料，其包括改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜基材，所述的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜经过处理后得到负载单宁酸与百里酚的抗菌材料，且具有宽ph适用范围。
21.所述的具有宽ph范围抗菌特性的抗菌材料的制备方法，包括海藻酸钠的改性、薄膜基材的制备以及抗菌剂的负载，具体包括以下步骤：s1.将双丙酮丙烯酰胺溶于去离子水，配制质量分数为10%的双丙酮丙烯酰胺溶液，充分搅拌20 min；s2.将海藻酸钠溶于去离子水，配制质量分数为6%的海藻酸钠溶液，超声消泡6 h；s3.将s1与s2制得的溶液按照体积比1:1混合并置于油浴锅中加热搅拌（本实施例中取双丙酮丙烯酰胺溶液20 ml），加入5mg的过硫酸钾，温度为90℃，搅拌3 h，然后冷却至室温后取出，制得改性海藻酸钠dsa；s4.将聚赖氨酸溶于去离子水，配制质量分数为8%的聚赖氨酸溶液；s5.将s3与s4制得的溶液按照体积比1:1依次滴加在24孔板内，液面分层明显，静置反应10 h，将液面交界处生成的薄膜取出并多次清洗，冷冻干燥得到dsa/pl复合薄膜；s6.将漆酶溶于ph=3的醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴搅拌30 min配制浓度为5mg/ml的漆酶溶液；s7.将单宁酸溶于ph=5.8的磷酸盐缓冲液中，配制质量分数10%的单宁酸溶液，将s6制得的漆酶溶液加入到单宁酸溶液中进行催化氧化（v漆酶溶液:v单宁酸溶液=1:3），催化条件为：在30℃恒温条件下，摇床速率为200 rpm，时间为6 h，并定期（1 h/次）取出容器手动摇匀得到单宁酸低聚体溶液，调节溶液ph=8.5；s8.将s5制得的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于s7制得的单宁酸低聚体溶液中浸泡6 h，在温度为30℃条件下摇床振荡，速率为100 rpm，取出洗净得到ta-dsa/pl复合材料；s9.将s8制得的单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料放置于1 wt%的百里酚溶液中浸泡6 h（可适当添加甘油来促溶），在温度为30℃条件下摇床震荡，速率为100 rpm，取出洗净，在恒温恒湿箱中(37℃，50%rh)干燥得到具有宽ph范围抗菌特性的thymol-ta-dsa/pl。
22.实施例2本实施例中一种具有宽ph适用范围抗菌特性的抗菌材料，其包括改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜基材，所述的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜经过处理后得到负载单宁酸与百里酚的抗菌材料，且具有宽ph适用范围。
23.所述的具有宽ph范围抗菌特性的抗菌材料的制备方法，包括海藻酸钠的改性、薄膜基材的制备以及抗菌剂的负载，具体包括以下步骤：s1.将双丙酮丙烯酰胺溶于去离子水，配制质量分数为15%的双丙酮丙烯酰胺溶
液，充分搅拌20 min；s2.将海藻酸钠溶于去离子水，配制质量分数为2%的海藻酸钠溶液，超声消泡2 h；s3.将s1与s2制得的溶液按照体积比1:3混合并置于油浴锅中加热搅拌（本实施例中取双丙酮丙烯酰胺溶液20 ml），加入15 mg的过硫酸钾，温度为80℃，搅拌2 h，然后冷却至室温后取出，制得改性海藻酸钠dsa；s4.将聚赖氨酸溶于去离子水，配制质量分数为4%的聚赖氨酸溶液；s5.将s3与s4制得的溶液按照体积比1:1依次滴加在24孔板内，液面分层明显，静置反应8 h，将液面交界处生成的薄膜取出并多次清洗，冷冻干燥得到dsa/pl复合薄膜；s6.将漆酶溶于ph=5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴搅拌30 min配制浓度为15 mg/ml的漆酶溶液；s7.将单宁酸溶于ph=5.8的磷酸盐缓冲液中，配制质量分数5%的单宁酸溶液，将s6制得的漆酶溶液加入到单宁酸溶液中进行催化氧化（v漆酶溶液:v单宁酸溶液=1:5），催化条件为：在30℃恒温条件下，摇床速率为150 rpm，时间为4 h，并定期（1 h/次）取出容器手动摇匀得到单宁酸低聚体溶液，调节溶液ph=8.5；s8.将s5制得的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于s7制得的单宁酸低聚体溶液中浸泡4 h，在温度为40℃条件下摇床振荡，速率为150 rpm，取出洗净得到ta-dsa/pl复合材料；s9.将s8制得的单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料放置于2.5 wt%的百里酚溶液中浸泡4 h（可适当添加甘油来促溶），在温度为40℃条件下摇床震荡，速率为150 rpm，取出洗净，在恒温恒湿箱中干燥得到具有宽ph范围抗菌特性的thymol-ta-dsa/pl。
24.实施例3本实施例中一种具有宽ph适用范围抗菌特性的抗菌材料，其包括改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜基材，所述的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜经过处理后得到负载单宁酸与百里酚的抗菌材料，且具有宽ph适用范围。
25.所述的具有宽ph范围抗菌特性的抗菌材料的制备方法，包括海藻酸钠的改性、薄膜基材的制备以及抗菌剂的负载，具体包括以下步骤：s1.将双丙酮丙烯酰胺溶于去离子水，配制质量分数为12.5%的双丙酮丙烯酰胺溶液，充分搅拌20 min；s2.将海藻酸钠溶于去离子水，配制质量分数为4%的海藻酸钠溶液，超声消泡4 h；s3.将s1与s2制得的溶液按照体积比1:2混合并置于油浴锅中加热搅拌（本实施例中取双丙酮丙烯酰胺溶液20 ml），加入10 mg的过硫酸钾，温度为100℃，搅拌4 h，然后冷却至室温后取出，制得改性海藻酸钠dsa；s4.将聚赖氨酸溶于去离子水，配制质量分数为6%的聚赖氨酸溶液；s5.将s3与s4制得的溶液按照体积比1:1依次滴加在24孔板内，液面分层明显，静置反应12 h，将液面交界处生成的薄膜取出并多次清洗，冷冻干燥得到dsa/pl复合薄膜；s6.将漆酶溶于ph=4的醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴搅拌30 min配制浓度为5 mg/ml的漆酶溶液；s7.将单宁酸溶于ph=5.8的磷酸盐缓冲液中，配制质量分数7.5%的单宁酸溶液，将s6制得的漆酶溶液加入到单宁酸溶液中进行催化氧化（v漆酶溶液:v单宁酸溶液=1:4），催
化条件为：在30℃恒温条件下，摇床速率为100 rpm，时间为5 h，并定期（1 h/次）取出容器手动摇匀得到单宁酸低聚体溶液，调节溶液ph=8.5；s8.将s5制得的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于s7制得的单宁酸低聚体溶液中浸泡5 h，在温度为35℃条件下摇床振荡，速率为125 rpm，取出洗净得到ta-dsa/pl复合材料；s9.将s8制得的单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料放置于5 wt%的百里酚溶液中浸泡5 h（可适当添加甘油来促溶），在温度为35℃条件下摇床震荡，速率为125 rpm，取出洗净，在恒温恒湿箱中干燥得到具有宽ph范围抗菌特性的thymol-ta-dsa/pl。
26.对比例1本对比例具体包括以下步骤：s1.将双丙酮丙烯酰胺溶于去离子水，配制质量分数为10%的双丙酮丙烯酰胺溶液20 ml，充分搅拌20 min；s2.将海藻酸钠溶于去离子水，配制质量分数为6%的海藻酸钠溶液，超声消泡6 h；s3.将s1与s2制得的溶液按照体积比1:1混合并置于油浴锅中加热搅拌，加入5mg的过硫酸钾，温度为90℃，搅拌3 h，然后冷却至室温后取出，制得改性海藻酸钠dsa；s4.将聚赖氨酸溶于去离子水，配制质量分数为8%的聚赖氨酸溶液；s5.将s3与s4制得的溶液按照体积比1:1依次滴加在24孔板内，液面分层明显，静置反应10 h，将液面交界处生成的薄膜取出并多次清洗，冷冻干燥得到dsa/pl复合薄膜；s6.将漆酶溶于ph=3的醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴搅拌30 min配制浓度为5mg/ml的漆酶溶液；s7.将单宁酸溶于ph=5.8的磷酸盐缓冲液中，配制质量分数10%的单宁酸溶液，将s6制得的漆酶溶液加入到单宁酸溶液中进行催化氧化（v漆酶溶液:v单宁酸溶液=1:3），催化条件为：在30℃恒温条件下，摇床速率为200 rpm，时间为6 h，并定期（1 h/次）取出容器手动摇匀得到单宁酸低聚体溶液，调节溶液ph=8.5；将百里酚溶液溶于去离子水中, 配制质量分数1%的百里酚溶液；s8.将s5制得的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于s7制得的单宁酸低聚体溶液中浸泡6 h，在温度为30℃条件下摇床振荡，速率为100 rpm，取出洗净得到ta-dsa/pl复合材料；另外，将等量s5制得的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于s7制得的百里酚溶液中浸泡6 h，在温度为30℃条件下摇床振荡，速率为100 rpm，取出洗净得到thymol-dsa/pl复合材料；s9.将s8制得的单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸（ta-dsa/pl）复合材料放置于s7制得的百里酚溶液中浸泡6 h，在温度为30℃条件下摇床震荡，速率为100 rpm，取出洗净，在恒温恒湿箱中(37℃，50%rh)干燥得到具有宽ph范围抗菌特性的thymol-ta-dsa/pl。
27.对比例2本对比例采用未改性的海藻酸钠与聚赖氨酸制备复合薄膜基材，所述的海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜经过与实施例同样处理后得到负载单宁酸与百里酚的抗菌材料。具体包括以下步骤：
s1.将海藻酸钠溶于去离子水，配制质量分数为6%的海藻酸钠溶液，超声消泡6 h；s2.将聚赖氨酸溶于去离子水，配制质量分数为8%的聚赖氨酸溶液；s3.将s1与s2制得的溶液按照体积比1:1依次滴加在24孔板内，液面分层明显，静置反应10 h，将液面交界处生成的薄膜取出并多次清洗，冷冻干燥得到sa/pl复合薄膜；s4.将漆酶溶于ph=3的醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴搅拌30 min配制浓度为5mg/ml的漆酶溶液；s5.将单宁酸溶于ph=5.8的磷酸盐缓冲液中，配制质量分数10%的单宁酸溶液，将s6制得的漆酶溶液加入到单宁酸溶液中进行催化氧化（v漆酶溶液:v单宁酸溶液=1:3），催化条件为：在30℃恒温条件下，摇床速率为200 rpm，时间为6 h，每小时取出容器手动摇匀得到单宁酸低聚体溶液，调节溶液ph=8.5；将百里酚溶液溶于去离子水中, 配制质量分数1%的百里酚溶液；s6.将s5制得的海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于s7制得的单宁酸低聚体溶液中浸泡6 h，在温度为30℃条件下摇床振荡，速率为100 rpm，取出洗净得到ta-sa/pl复合材料；s7.将s3制得的海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料放置于s5制得的百里酚溶液中浸泡6 h，在温度为30℃条件下摇床震荡，速率为100 rpm，取出洗净得到thymol-sa/pl复合材料；将s6制得的单宁酸-海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料放置于s5制得的百里酚溶液中浸泡6 h，在温度为30℃条件下摇床震荡，速率为100 rpm，取出洗净得到thymol-ta-sa/pl复合材料，在恒温恒湿箱中(37℃，50%rh)干燥得到具有宽ph范围抗菌特性的thymol-ta-sa/pl。
28.对上述实施例1制备的dsa/pl复合薄膜、实施例1制备的ta-dsa/pl复合材料、实施例1制备的thymol-ta-dsa/pl以及对比例1制备的thymol-dsa/pl复合材料、对比例2制备的sa/pl复合薄膜、对比例2制备的thymol-sa/pl复合材料、对比例2制备的ta-sa/pl、对比例2制备的thymol-ta-sa/pl进行试验，具体试验过程如下：微观形貌：使用 hitachi su1510 在5.0 kv下通过扫描电子显微镜 (sem) 拍摄复合薄膜的表面形貌图像。
29.图1为本发明实施例1制备的dsa/pl薄膜基材的表面微观结构图与截面图，其中（a）为dsa/pl表面形貌，（b）为（a）图表面放大图，（c）为dsa/pl截面图，从图中可以看出daam疏水改性sa后制备的dsa/pl膜表面疏松多孔，表面呈现出一定的网状结构，这是因为改性后的dsa粘度降低，与pl溶液的接触更加充分。从截面上可以观察到薄膜呈现出多层不规则堆叠结构，厚度约为210
ꢀ±ꢀ
4μm。
30.溶胀性能测试：该测试在室温下，分别在去离子水、磷酸盐缓冲液（pbs， ph=7.4
±
0.2） 和 hcl (ph=1.5) 介质中进行，以研究复合膜吸收水分和随时间膨胀的程度。在测试之前，将样品切成相同尺寸并在 10% rh 恒温恒湿箱中放置24小时，然后立即称重(m0)，然后浸入去离子水中。在不同的时间间隔（t）记录样品的重量，即0.5、1、2、3、4、5、6、7小时，首先用软纸吸干薄膜表面以去除多余的水分，然后立即称重。 pbs、hcl溶液测试步骤相同。根据以下公式（1）计算溶胀率（增重率），其中m
t =浸泡时间t时的样品重量，m
0 =初始重量。
31.溶胀率%=(m
t-m0)/m0×
100
ꢀꢀ
（1）图2为本发明抗菌材料的溶胀增重率曲线图，本发明的抗菌材料在经过双丙酮丙烯酰胺疏水改性之后，在pbs缓冲液、水、ph=1.5的hcl溶液中的溶胀增重率都明显减小，可
知其尺寸稳定性大幅提高。
32.抗菌效果测试：参考aatcc100-2012《抗菌纺织品的评价方法》对材料进行抗菌性能评价，选用革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌中的大肠杆菌作为测试菌种。将材料裁成若干个大小厚度一致的圆形试样放入24孔板中。取 0.1 ml浓度为10
8 ‑ꢀ
10
9 cfu/ml的菌液滴在24孔板中的样品上，分别与样品接触40 min后，分别加入对应ph的磷酸缓冲盐溶液（pbs）0.9 ml。摇晃均匀后，分别取0.1 ml原菌液以及与样品接触后的菌液在离心管中等梯度稀释10
６
倍(每个样品做3组平行实验)。取10 μl各稀释梯度的溶液滴在培养基平板上，并放置于37℃恒温培养箱中培养24h后记录平板各列的菌落数，根据公式（2）计算出细菌存活率（n , %）对复合膜的抗菌效果进行评价。
33.n%＝ni/n0×
100
ꢀꢀ
（2）式中，n0为原菌液可计数列的菌落最大值；ni为试样抗菌后与原菌液对应梯度下的菌落值。
34.抗菌效果实验如图3所示（其中，s.aureus—金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性菌；e.coli—大肠杆菌，革兰氏阴性菌； dsa/pl—改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜；ta-dsa/pl—单独负载单宁酸的复合薄膜；thymol-ta-dsa/pl—单独负载百里酚的复合薄膜；thymol-ta-dsa/pl—宽ph范围的抗菌材料），将四种样品一式三份放入24孔板，滴加菌液之后放置1小时，之后进行抗菌测试，其中（a）为测试设置两种ph环境（ph=4.5、ph=7.5）时，来检测抗菌材料酸碱环境下的抗菌有效性：测试结果显示dsa/pl在ph=4.5与ph=7.5的条件下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的杀菌效果，但不能应用于高效抗菌材料；单宁酸与dsa/pl可在碱性环境下发生席夫碱结合或迈克尔加成，因此在ph=7.5时抗菌效果更佳；百里酚与dsa/pl通过氢键结合，在酸性环境下抗菌效果更好；同时负载单宁酸与百里酚的dsa/pl对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有很好的杀灭效果，在ph=4.5时，杀菌率分别为99.28%和99.48%；在ph=7.5时，杀菌率分别为99.57%和99.98%。（b）为扩大ph范围探究thymol-ta-dsa/pl的宽ph范围下的抗菌效果，最高可达99.99%。
35.抗菌效果对比如下表所示，从表中可以看出，改性后的dsa/pl抗菌效果大幅提升，且疏水改性后加强了与百里酚的结合，因此百里酚的抗菌效果得以显现。
36.生物相容性测试：细胞培养选用l929小鼠皮肤成纤维细胞用于体内细胞毒性研究，细胞在马血清为 9:1 的比例配制的细胞完全培养基（mem）种培养。将细胞在 5% co
2 的湿润气氛下于 37℃ 孵育，每 1-2 天更换一次培养基。第三代的l929细胞用于所有实验。
37.细胞活力研究将 l929 细胞接种到 96 孔板中，然后孵育过夜。面积大约1.5 cm2的sa/pl、thymol-sa/pl、ta-sa/pl、thymol-ta-sa/pl、dsa/pl、thymol-dsa/pl、ta-dsa/pl、thymol-ta-dsa/pl，膜通过紫外线照射灭菌2小时。根据 iso 10993-5:1999 将mem 添加到灭菌后的样品中浸提 24 小时，然后将 100 μl 培养基提取物转移到每个孔中，进一步培养细胞 24 小时，并用 mtt 法测定它们的活力：取对数生长期的 l929 细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照 8
×
10
3 /孔接种到 96 孔板中，5%co2，37℃恒温培养箱中过夜培养至细胞贴壁。将上述8种样品分组处理，培养 24 h。移除含样品的培养基。用 pbs 清洗各孔三次，每孔加入 100 μl 含 0.5 mg/ml mtt 的培养基， 5%co2，37℃恒温培养箱中培养4 小时。弃上清液，每孔加入100 μl dmso。轻摇 10 min 后检测 570 nm 处吸光度。根据公式（3）计算细胞活力：细胞活力%=a
membrane
⁄acontrol
×
100
ꢀꢀ
（3）此外，为了直观地观察样品上贴壁细胞的活力，使用了 live/dead 染色剂。孵育24 h 后，将样品上的细胞用pbs洗涤3次。然后将 100 μl染色溶液滴入样品上，在37 ℃避光孵育1 h之后，采用clsm 对绿色活细胞和红色死细胞进行研究。
38.图4为抗菌材料的细胞毒性示意图，图中（a)为 mtt 法进行的l929细胞活力测定，图（b）为l929细胞的荧光成像（live/dead 染色）。thymol-ta-sa/pl 和 thymol-ta-dsa/pl 膜显示正常的细胞增殖（对 l929 细胞没有毒性）、sa/pl、thymol-sa/pl、dsa/pl 和 thymol-dsa/pl促进细胞增殖，而 ta-sa/pl 和 ta-dsa/pl 具有轻微的细胞毒性。此外，在
提取物上培养 24 小时的 l929 细胞的荧光成像（live/dead 染色）如图（b）所示，与 mtt 细胞活力测定一致除了ta-dsa/pl 之外的所有样品都可以支持细胞生长而没有明显的细胞毒性。这些结果表明，thymol-ta-dsa/pl 膜具有出色的生物相容性。

技术特征：
1.一种具有宽ph适用范围抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤如下：步骤一.将双丙酮丙烯酰胺溶于去离子水，配制质量分数为10-15%的双丙酮丙烯酰胺溶液，充分搅拌20min；步骤二.将海藻酸钠溶于去离子水，配制质量分数为2-6%的海藻酸钠溶液，超声消泡2-6 h；步骤三.将海藻酸钠进行改性，将步骤一与步骤二制得的溶液混合并置于油浴锅中加热搅拌，以过硫酸钾作为引发剂，加入过硫酸钾，温度为80-100℃，搅拌2-4 h，然后冷却至室温后取出，制得改性海藻酸钠；步骤四.将聚赖氨酸溶于去离子水，配制质量分数为4-8%的聚赖氨酸溶液；步骤五.将步骤三与步骤四制得的改性海藻酸钠和聚赖氨酸溶液依次滴加在24孔板内，液面分层明显，静置反应8-12 h，将液面交界处生成的薄膜取出并多次清洗，冷冻干燥得到改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜；步骤六.将漆酶溶于ph为3-5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴搅拌30 min配制浓度为5-15 mg/ml的漆酶溶液；步骤七.将单宁酸溶于ph=5.8的磷酸盐缓冲液中，配制质量分数5-10%的单宁酸溶液，将步骤六制得的漆酶溶液混合到单宁酸溶液中进行催化氧化，催化条件为：在30℃恒温条件下，摇床速率为100-200 rpm，时间为4-6 h，取出容器手动摇匀得到单宁酸低聚体溶液，调节溶液ph=8.5；步骤八.将步骤五制得的改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜放置于步骤七制得的单宁酸低聚体溶液中浸泡4-6 h，在温度为30-40℃条件下摇床振荡，速率为100-150 rpm，取出洗净得到单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料；步骤九.将步骤八制得的单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料放置于1-5 wt%的百里酚溶液中浸泡4-6 h，在温度为30-40℃条件下摇床震荡，速率为100-150 rpm，取出洗净，在恒温恒湿箱中干燥得到具有宽ph范围抗菌特性的百里酚-单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料。2.根据权利要求1所述的一种具有宽ph适用范围抗菌材料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中双丙酮丙烯酰胺溶液、海藻酸钠溶液和过硫酸钾的比值为20ml：20~60ml：5~15mg。3.根据权利要求1所述的一种具有宽ph适用范围抗菌材料的制备方法，其特征在于，所述步骤五中改性海藻酸钠和聚赖氨酸溶液的体积比为1：1。4.根据权利要求1所述的一种具有宽ph适用范围抗菌材料的制备方法，其特征在于，所述步骤七中漆酶溶液与单宁酸溶液的体积比为1:(3~5)。5.根据权利要求1所述的一种具有宽ph适用范围抗菌材料的制备方法，其特征在于，所述步骤九中恒温恒湿箱设置温度范围为20~37℃，湿度为30-50% rh。6.权利要求1~5任一所述的方法制备的具有宽ph适用范围抗菌材料。7.权利要求6所述的具有宽ph适用范围抗菌材料在制备创面抗菌材料中的应用。

技术总结
一种具有宽pH适用范围抗菌材料及其制备方法与应用，步骤如下：利用双丙酮丙烯酰胺溶液对海藻酸钠进行改性，制备疏水改性海藻酸钠溶液；将聚赖氨酸溶液与改性海藻酸钠溶液分别加入到24孔板中，液面交界处充分反应形成膜状产物，清洗、冷冻干燥制得改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜；利用漆酶催化单宁酸溶液氧化自聚，得到单宁酸低聚体溶液，然后将改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合薄膜浸泡于单宁酸低聚体溶液中，洗净制得单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料；将单宁酸-改性海藻酸钠/聚赖氨酸复合材料浸泡于百里酚溶液中，在恒温恒湿箱内干燥。该材料在较宽的pH范围内都具有良好的抗菌效果，且原料多为绿色天然物质、生物相容性好，制作工艺简单。制作工艺简单。制作工艺简单。


技术研发人员：王清清 金芳羽 李蔚 李敏 魏取福
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/5