1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用腐霉利诱导筛选家蚕生长发育相关基因的方法。
背景技术：2.桑(拉丁名：morus alba l.)是桑科，桑属落叶乔木或灌木。桑树是重要的经济树种之一。传统的桑树品种是以采叶养蚕为目的培育而成的，不结桑果或结果较小。为了满足桑葚的食用需求，研究人员选育出了果形大，产果量高的系列果桑品种。果桑以结果为主，同时果叶还能够用于养蚕。现有技术中，为了保证果桑桑园最大化利用，逐步发展了果叶兼用桑园，春季进行桑果采摘和养蚕，秋季进行养蚕，实现蚕茧和桑果的双丰收，提高亩桑生茶效益。
3.果桑栽培过程中受多种病害影响，例如褐斑病、炭疽病、白粉病、菌核病等。其中，由核盘菌引起的果桑菌核病呈大幅度增加趋势，严重制约了果桑产业的发展。目前，果桑生产中最常用的防治菌核病的方法是化学防治方法，其中较常用的农药为腐霉利。但是腐霉利会抑制家蚕的生长发育。
4.但是腐霉利对家蚕的分子水平有何影响现有技术没有相关报道。
技术实现要素：5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用腐霉利诱导筛选家蚕生长发育相关基因的方法。
6.本发明提供了一种利用腐霉利诱导筛选家蚕生长发育相关基因的方法，包括以下步骤：
7.1)设置对照组和实验组，所述对照组采用水浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕，所述实验组采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕；
8.所述腐霉利水溶液中腐霉利的浓度为10mg/ml；
9.所述饲喂的时间至家蚕有上蔟的欲望时截止；
10.2)所述饲喂后，分别建立对照组和实验组中家蚕的cdna文库，分别得到对照组cdna文库和实验组cdna文库，分别对所述对照组cdna文库和实验组cdna文库进行测序，得到对照组和实验组测序结果，比较所述对照组和实验组测序结果，确定对照组和实验组中家蚕的候选差异基因，所述候选差异基因作为家蚕生长发育相关基因；所述候选差异基因的选择标准是差异倍数≥2且p《0.05。
11.优选的，所述浸泡的时间为30s～1min。
12.优选的，所述家蚕为5龄幼虫。
13.优选的，所述饲喂的次数为每天3次，相邻两次饲喂的间隔时间为6～8h。
14.优选的，所述饲喂的时间为每天6:00、14:00和22:00。
15.优选的，所述饲喂的桑叶量为150～180g/d。
16.优选的，所述饲喂的第1～2d，饲喂的桑叶量为150g/d；所述饲喂的第3～5d，饲喂的桑叶量为180g/d；所述饲喂的第6d及之后，饲喂的桑叶量为150g/d。
17.优选的，所述采用水浸泡过的新鲜桑叶与采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶在浸泡后还包括晾干。
18.优选的，所述水包括超纯水。
19.本发明提供了一种利用腐霉利诱导筛选家蚕生长发育相关基因的方法。本发明通过比较采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶饲喂的家蚕和采用水浸泡过的新鲜桑叶饲喂的家蚕的cdna文库测序结果，确定候选差异基因，候选差异基因即为家蚕生长发育相关基因。经试验，采用本发明的方法共得到10个家蚕生长发育相关基因，分别为：kwmtbomo13018、kwmtbomo13015、kwmtbomo13014、kwmtbomo13011、kwmtbomo09327、kwmtbomo09883、kwmtbomo13828、kwmtbomo13149、kwmtbomo13140和kwmtbomo13158。
附图说明
20.图1表示腐霉利对茧层率的影响。
具体实施方式
21.本发明提供了一种利用腐霉利诱导筛选家蚕生长发育相关基因的方法，包括以下步骤：
22.1)设置对照组和实验组，所述对照组采用水浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕，所述实验组采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕；
23.所述腐霉利水溶液中腐霉利的浓度为10mg/ml；
24.所述饲喂的时间至家蚕有上蔟的欲望时截止；
25.2)所述饲喂后，分别建立对照组和实验组中家蚕的cdna文库，分别得到对照组cdna文库和实验组cdna文库，分别对所述对照组cdna文库和实验组cdna文库进行测序，得到对照组和实验组测序结果，比较所述对照组和实验组测序结果，确定对照组和实验组中家蚕的候选差异基因，所述候选差异基因作为家蚕生长发育相关基因；所述候选差异基因的选择标准是差异倍数≥2且p《0.05。
26.本发明首先设置对照组和实验组，所述对照组采用水浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕，所述实验组采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕；所述腐霉利水溶液中腐霉利的浓度为8～10mg/ml；所述饲喂的时间至家蚕有上蔟的欲望时截止。
27.在本发明中，所述对照组和实验组除浸泡新鲜桑叶的试剂不同外，其余处理相同。
28.在本发明中，所述浸泡的时间优选为30s～1min，更优选为45s。
29.在本发明中，所述家蚕优选为5龄幼虫，更优选为5龄眠起第1d的幼虫。在本发明中，所述家蚕优选的来自于湖北省农业科学院经济作物研究所。
30.在本发明中，所述饲喂的次数优选为每天3次，相邻两次饲喂的间隔时间优选为6～8h。在本发明中，所述饲喂的时间优选为每天6:00、14:00和22:00。在本发明中，每天6:00饲喂之前清理一次多余的桑叶和死亡的幼虫，以防止疾病的发生。
31.在本发明中，所述饲喂的桑叶量优选为150～180g/d。在本发明中，所述饲喂的第1～2d，饲喂的桑叶量优选为150g/d；所述饲喂的第3～5d，饲喂的桑叶量优选为180g/d；所述
饲喂的第6d及之后，饲喂的桑叶量优选为150g/d。本发明的饲喂的桑叶量能够保证家蚕有足够的桑叶。
32.在本发明中，所述家蚕饲喂的温度优选为25～28℃；所述家蚕饲喂的光照条件优选为：光照12h、黑暗12h；所述家蚕饲喂的湿度优选为70％～75％。
33.在本发明中，所述饲喂的时间优选为3～5d，更优选为4d。
34.在本发明中，所述采用水浸泡过的新鲜桑叶与采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶在浸泡后优选的还包括晾干；本发明对晾干的温度没有特殊限制，自然晾干即可；所述晾干的时间优选为1～2h。
35.在本发明中，所述水优选的包括超纯水。
36.在所述饲喂后，本发明分别建立对照组和实验组中家蚕的cdna文库，分别得到对照组cdna文库和实验组cdna文库，分别对所述对照组cdna文库和实验组cdna文库进行测序，得到对照组和实验组测序结果，比较所述对照组和实验组测序结果，确定对照组和实验组中家蚕的候选差异基因，所述候选差异基因作为家蚕生长发育相关基因；所述候选差异基因的选择标准是差异倍数≥2且p《0.05。
37.在本发明中，建立对照组和实验组中家蚕的cdna文库优选的采用以下方法进行；
38.分别提取对照组和实验组中家蚕的总rna，得到对照组的总rna和实验组的总rna；基于所述对照组的总rna和实验组的总rna分别构建对照组和实验组中家蚕的cdna文库。
39.本发明对提取所述总rna的方法没有特殊限制，采用本领域的常规提取方法或者常规试剂盒即可。
40.在本发明中，所述家蚕的cdna文库优选的由ultra
tm rna libraryprep试剂盒构建。
41.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
42.实施例1
43.1、家蚕品种和饲养
44.家蚕来自于湖北省农业科学院经济作物研究所。5龄幼虫饲养在饲养盒子(40.5
×
19.5
×
9.5cm)中。每日在温度为25～28℃、光照为12：12(l：d)小时、湿度为70％～75％环境下饲喂新鲜的桑叶。
45.2、添食腐霉利
46.腐霉利用水稀释至不同的浓度(2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)。每种浓度的腐霉利用玻璃容器盛10l。将新鲜的桑叶完全浸没于腐霉利中30s～1min，然后取出自然晾干1～2h。对照组用已报道的方法(jiang,l.,l.l.peng,y.y.cao,k.thakur,f.hu,s.m.tang,and z.j.wei.2020.transcriptome analysis reveals gene expression changes of the fatbody of silkworm(bombyx mori l.)in response to selenium treatment.chemosphere.245:125660.)用超纯水处理。
47.5龄眠起第1d用于本发明的实验。将大小和龄期差不多的5龄幼虫随机分成4个组(每组180头幼虫，共3个生物学重复)。幼虫每天6:00、14:00和22:00饲喂3次桑叶(实验组和对照组)直到它们有上蔟的欲望。幼虫每日饲喂的桑叶量大约第1天和第2天150g，第3至第5天180g，第6天150g。饲养盒在每日早晨饲喂之前清理一次多余的桑叶和死亡的幼虫。每日早晨饲喂桑叶之前记录幼虫的体重和幼虫的死亡数目。结果参见表1。
48.表1腐霉利对家蚕五龄幼虫的生长发育的影响
[0049][0050]
3、家蚕5龄幼虫体重
[0051]
每个重复每天称取40头个体的体重直到》50％的幼虫都成熟准备结茧。最后，记录每日增加的体重以及6d中每天的总体重。
[0052]
4、茧层率＝(茧壳重量/蚕茧重量)
×
100％，结果参见图1。
[0053]
5、腐霉利添食后家蚕的转录组测序筛选免疫基因
[0054]
选取腐霉利添食后4天的对照组和10mg/ml组(实验组)的五龄幼虫，提取rna，建库。序列文库由ultra
tm rnalibraryprep试剂盒制备。通过oligo-dt柱子将mrna从总rna中分离，然后用nebnext first strand synthesis reaction buffer(5
×
)进行片段化。第一链cdna由随机引物和m-mulv逆转录酶合成。第二链cdna由dna聚合酶i和rnaseh合成。双链rna片段用ampure xp system进行纯化并且将3’末端腺苷酸化。将具有发夹结构的nebnext接头与cdna连接起来，为杂交做准备。带有接头的cdna作为pcr的模板，然后利用phusion高保真酶和一般性pcr引物进行扩增。pcr产物用ampure xp system进行纯化，文库的质量由agilent bioanalyzer 2100system进行检测。最后，cdna文库通过illumina hiseq 4000platform进行测序后产生了150bp双片段末端。clean reads的获得需要去除带接头的reads，模糊的reads(polyn的比例大于10％，n表示无法确定信息的碱基)以及低质量的reads(质量值《＝20的碱基数占整个read长度的50％以上)。候选差异基因的选择标准是差异倍数≥2并且p《0.05，且与生长发育相关的基因。结果参见表2。
[0055]
表2转录组筛选的生长发育相关基因表达情况
[0056][0057]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
技术特征：1.一种利用腐霉利诱导筛选家蚕生长发育相关基因的方法，包括以下步骤：1)设置对照组和实验组，所述对照组采用水浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕，所述实验组采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶饲喂家蚕；所述腐霉利水溶液中腐霉利的浓度为10mg/ml；所述饲喂的时间至家蚕有上蔟的欲望时截止；2)所述饲喂后，分别建立对照组和实验组中家蚕的cdna文库，分别得到对照组cdna文库和实验组cdna文库，分别对所述对照组cdna文库和实验组cdna文库进行测序，得到对照组和实验组测序结果，比较所述对照组和实验组测序结果，确定对照组和实验组中家蚕的候选差异基因，所述候选差异基因作为家蚕生长发育相关基因；所述候选差异基因的选择标准是差异倍数≥2且p<0.05。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸泡的时间为30s～1min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述家蚕为5龄幼虫。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饲喂的次数为每天3次，相邻两次饲喂的间隔时间为6～8h。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述饲喂的时间为每天6:00、14:00和22:00。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饲喂的桑叶量为150～180g/d。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述饲喂的第1～2d，饲喂的桑叶量为150g/d；所述饲喂的第3～5d，饲喂的桑叶量为180g/d；所述饲喂的第6d及之后，饲喂的桑叶量为150g/d。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用水浸泡过的新鲜桑叶与采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶在浸泡后还包括晾干。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水包括超纯水。
技术总结本发明提供了一种利用腐霉利诱导筛选家蚕生长发育相关基因的方法，属于分子生物学技术领域。本发明通过比较采用腐霉利水溶液浸泡过的新鲜桑叶饲喂的家蚕和采用水浸泡过的新鲜桑叶饲喂的家蚕的cDNA文库测序结果，确定候选差异基因，候选差异基因即为家蚕生长发育相关基因。关基因。关基因。
技术研发人员：贺真 吴凡 李德臣
受保护的技术使用者：湖北省农业科学院经济作物研究所
技术研发日：2022.05.07
技术公布日：2022/7/5
