一种提高大豆种子含油量的方法
(一)技术领域
1.本发明涉及作物育种和基因工程领域，特别涉及一种通过对大豆酯酶基因 gmho4的基因编辑使其不表达＝进而提高大豆种子含油量的方法。
(二)
背景技术：2.市面上常见的转基因作物有转基因大豆、转基因玉米、转基因番茄等，这些都是 通过安全验证的转基因农产品。
3.而基因编辑技术虽然也是一种基因工程技术，但是不会引入外源基因片段或者大 片段序列，相对来说安全风险极低。
4.基因编辑植物是否是转基因植物，这是基因编辑作物是否能顺利进入田间种植的 关键所在。相关的植物科学家指出随着基因编辑工具的出现，需要重新考虑转基因生 物的当前定义和相应的调控框架，因为通过基因编辑方法实现的基因组修饰与转基因 技术的基因组修饰非常不同。并且大多数crispr诱导的基因突变是小插入缺失而不 是大片段插入或重排。而这种小的插入缺失变异通常也存在自然条件下生长的植物 中，或使用辐射或化学诱变剂大规模诱导的植物中。其次，传统转基因植物中转基因 是稳定遗传，而使用crispr和其他基因编辑工具构建的性状改良植物可以是无转基 因的。因此，有科学家认为无转基因编辑的植物应该采用与传统化学或辐射诱变培育 的植物相同的方式进行处理，不应受到特殊的管理政策的约束。基因编辑植物或许是 我国转基因农作物获得商业化种植的突破口。
5.进一步规范农业基因编辑植物的安全评价管理，对于我国生物育种技术研发与产 业推动具有里程碑意义。
6.在此前的研究中，往往是通过基因工程的手段改变影响脂肪酸合成的基因来开发 高油大豆，但研究表明，通过基因工程的手段增加种子油含量往往伴随着种子变小、 产量降低。
7.大豆是世界四大油料作物之一，目前我国需要的大豆对外依存度高达八成之多， 国内大豆的问题是产业供给不足。基因gmho4编码一个酯酶，其主要作用在于降解 脂肪酸。
(三)
技术实现要素：8.本发明目的是提供一种提高大豆种子含油量的方法，选取了一个在大豆荚和种子 中高表达的酯酶基因gmho4进行基因编辑，通过降低大豆种子发育到成熟过程中脂 肪酸的分解来增加大豆种子中脂肪酸的积累量，从而获得高油含量的大豆材料，能够 一定程度上缓解我国大豆油产业的压力。
9.本发明采用的技术方案是：
10.本发明提供一种提高大豆种子含油量的方法，所述方法是在大豆酯酶基因 gmho4的起始密码子后135bp-154bp处的靶位点进行移码突变(插入或缺失)基因 编辑使其不表达，从而实现大豆种子含油量的提高；所述靶位点pam序列为： ggagactctttcacagacac。
11.进一步，所述大豆酯酶基因gmho4分为gmho4a和gmho4b，对应的核苷酸 序列分别为seq id no.1和seq id no.2。
12.进一步，所述靶位点的基因编辑采用crispr/cas9基因编辑技术进行，具体方法 为：(1)人工合成大豆酯酶基因gmho4的靶位点基因片段，将所述靶位点基因片段 连接至载体cas9 mdc123上，构建含靶位点基因片段的重组载体(cas9 mdc123-靶 位点基因片段)，转化农杆菌，获得含重组载体的农杆菌；(2)用步骤(1)含重组载 体的农杆菌菌液侵染大豆外植体，筛选不含cas9蛋白且gmho4基因已经成功被编 辑且纯合(纯合是指gmho4基因中的gmho4a和gmho4b均被编辑)的株系，获 得所述大豆种子含油量提高的株系；所述gmho4基因已经成功被编辑是指gmho4 基因的靶位点处出现碱基缺失或插入的情况，从而发生移码，使蛋白表达提前终止。
13.本发明实验发现，gmho4主要在种子发育时期的荚和种子中高表达，在根、茎、 叶等其他的组织中表达量极低甚至不表达，故基因编辑gmho4后的大豆植株的生长 发育没有受到不良影响，仅在种子油脂积累过程中影响油脂的积累。
14.本发明方法可扩展到通过其他手段，如辐射、化学诱变等阻止gmho4基因表达， 获得gmho4的突变体来提高大豆种子含油量；同时，在大豆遗传资源中筛选gmho4 基因不表达或低表达的单倍型，也可实现大豆种子油分含量的提高，因此也是本发明 涵盖的内容。
15.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
16.本发明通过crispr/cas9基因编辑技术对大豆酯酶基因gmho4进行基因编辑使 其不表达，通过降低脂肪酸的降解率来增加大豆种子中脂肪酸的积累量。本发明通过 对种子结构发育以及产量等性状进行评估后发现，对gmho4进行基因编辑并未使种 子的发育产生缺陷或产生不利影响；其对大豆种子油含量的提升并未以降低产量为代 价。此外，本发明基因编辑虽本质上仍是一种转基因技术，但是又不同于传统的转基 因技术，我们在t0代苗引入的cas9蛋白以及表达载体上的其他外源片段均可以在后 代通过性状分离的方式进行筛选，选取不存在任何外源片段插入仅在gmho4的靶位 点发生突变的株系。本发明获得的突变位点纯合且无外源片段插入的株系的大豆不仅 具有较高的含油量，并且对大豆的生长发育未产生不良影响。因其未引入外源片段， 安全风险极低，为后续我国将具有优良性状的转基因大豆投入商业化种植提供了更多 的可行性。
(四)附图说明
17.图1、gmho4a/b的靶位点及突变信息；(a)靶位点的位置及序列；(b)gmho4a/b 中gmho4a的两种突变方式；(c)gmho4a/b中gmho4b的两种突变方式；(d) gmho4a/b中cas9蛋白的鉴定图，ck+代表以cas9 mdc123质粒为模版的阳性pcr 结果，wt为以野生型叶片基因组为模版的阴性pcr结果，black代表以水为模版的 阴性pcr结果，gmho4a/b#1代表基因编辑大豆纯化双突变植株，gmho4a/b#2代表基 因编辑大豆纯化双突变植株。
18.图2、野生型大豆威廉姆斯82(wt)中gmho4的表达模式；(a)gmho4a和 (b)gmho4b在大豆各组织中的表达情况；(c)gmho4a和(d)gmho4b在大豆 种子各结构中的表达情况。
19.图3、大田收获gmho4a/b种子的含油量与野生型种子含量对比图。
20.图4、gmho4a/b种子中各脂肪酸的含量和百分比的变化；(a)gmho4a/b种子中各 脂肪酸的含量；(b)gmho4a/b种子中各脂肪酸所占的百分比。
21.图5、gmho4a/b生长性状统计图；(a)温室播种后30天wt与gmho4a/b的生长 性状对比图；(b)温室播种后30天及37天的株高统计图，bar＝5cm。
22.图6、gmho4a/b农艺性状统计图；(a)田间收获wt与gmho4a/b种子大小对比 图，bar＝1cm；(b)单粒重统计图；(c)田间收获wt与gmho4a/b植株对比图， bar＝10cm；(d)田间收获后wt与gmho4a/b的株高统计图。
23.图7、野生型大豆威廉姆斯82(wt)与gmho4a/b种子不同时期结构发育图， bar＝250μm。
(五)具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
25.本发明实施例所用培养基的配方如下：
26.lb液体培养基组成：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，调整 ph值至7.0，溶剂为去离子水。
27.lb固体培养基：在lb液体培养基中添加12g/l琼脂粉。
28.yep液体培养基组成：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨，5g/l氯化钠，调整 ph值至7.0，溶剂为去离子水。
29.yep固体培养基：在yep液体培养基中添加12g/l琼脂粉。
30.b5大量元素：kno
3 2500mg/l、mgso4·
7h2o 50mg/l、cacl2·
2h2o150 mg/l、 (nh4)2so
4 134mg/l、nah2po4·
h2o 150mg/l，溶剂为水。
31.b5微量元素：ki 0.75mg/l、h3bo
3 3.0mg/l、mnso4·
4h2o 10mg/l、znso4·
7h2o2.0mg/l、na2moo4·
2h2o 0.25mg/l、cocl2·
6h2o 0.025mg/l、cuso4·
5h2o 0.025mg/l， 溶剂为水。
32.ms大量元素：nh4no
3 1650mg/l、kno
3 1900mg/l、mgso4·
7h2o 370mg/l、 cacl2·
2h2o440mg/l、kh2po4·
h2o 170mg/l，溶剂为水。
33.ms微量元素：ki 0.83mg/l、h3bo
3 6.2mg/l、mnso4·
4h2o 22.3mg/l、znso4·
7h2o8.6mg/l、na2moo4·
2h2o 0.25mg/l、cocl2·
6h2o 0.025mg/l、cuso4·
5h2o 0.025mg/l， 溶剂为水。
34.b5维生素混合液：肌醇100mg/l、烟酸1.0mg/l、盐酸吡哆醇1.0mg/l、盐酸 硫胺10mg/l，溶剂为水。
35.b5铁盐：na-乙二胺四乙酸二钠(na
2-edta)37.3mg/l、feso4·
7h2o 27.8mg/l， 溶剂为水。
36.共培养液：1/10b5大量元素，1/10b5微量元素，1/10b5维生素混合液，30g/l 蔗糖，3.9g/l 2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph 5.4，溶剂为去离子水。高压灭菌冷却 后加入过滤灭菌的赤霉素(ga3)0.25mg/l，乙酰丁香酮40mg/l。
37.芽诱导培养基：1
×
b5大量元素，1
×
b5微量元素，1
×
b5维生素混合液，1
×
b5铁 盐，30g/l蔗糖，0.59g/l mes，7g/l琼脂，ph 5.7。以上成分高压灭菌冷却后加入 抽滤灭菌的bap(2,2-双(4-羟基-3-氨基苯基)丙烷)1.11mg/l，头孢噻肟100mg/l， 草丁膦5mg/l。
38.茎伸长培养基：1
×
ms大量元素，1
×
ms微量元素，1
×
b5维生素混合液，30g/l 蔗
糖，0.59g/l mes，7g/l琼脂，ph 5.7。高压灭菌冷却后加入抽滤灭菌的天冬酰胺 50mg/l，谷氨酰胺50mg/l，生长素(iaa)100μg/l，赤霉素(ga3)500μg/l，玉米素1 mg/l，头孢噻肟100mg/l，草丁膦5mg/l。
39.生根培养基：1
×
ms大量元素，1
×
ms微量元素，1
×
b5维生素混合液，1
×
b5铁 盐，30g/l蔗糖，0.59g/l mes，7g/l琼脂，ph 5.4。高压灭菌冷却后加入天冬酰胺 50mg/l，谷氨酰胺50mg/l。
40.所述室温为25-30℃，所述depc水是指用depc(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸 二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)，无色液体。
41.实施例1、构建cas9 mdc123-gmho4表达载体
42.1、靶位点的选择
43.由于大豆是古四倍体，其基因组中存在2个同源的大豆酯酶基因gmho4(在 ncbi中的分类号为:3847)，分别命名为基因gmho4a(核苷酸序列如seq id no.1 所示)、基因gmho4b(核苷酸序列如seq id no.2所示)。设计基因编辑靶位点时， 选取能够同时靶向gmho4a和gmho4b的位点。
44.根据质粒cas9 mdc123(爱荷华州立大学王侃教授惠赠)的产品说明书，在 gmho4上选取gn19ngg作为基因编辑的靶位点，并且参考刘耀光实验室开发的基 因编辑靶位点设计工具(https://www.genome.arizona.edu/crispr/more.html)。设计靶位 点时为了创制双突变体材料，我们选取能够同时靶向gmho4a和gmho4b的位点。 我们设计的gmho4的靶位点pam序列为：ggagactctttcacagacactgg(核 苷酸序列如seq id no.3所示)，其均位于gmho4a和gmho4b起始密码子下游 138bp处，见图1中a所示。
45.gmho4a核苷酸序列：
46.atggcttcttctgtgtcatccatggtttctaccaccctcctcctaattaccatctgcacactgtcctcacttctgtcagttgcatctg cagcaacagaggagggacgaacaaggccattcaaaagggtctatgcctttggagactctttcacagacactggcaacacccaaaa tgcagaaggtccaagtggctttggccatgtttcaaactctccctatggaaccactttctttaaccactccaccaataggtactcagatg gtaggcttgtgattgattttgtggctgaagcactttcactgccttacttgcccccctaccgtcatagcaaaggcaatgacacttttggtgt taactttgctgttgctggttccacagccataaaccatttgttctttgtcaagcacaacctctcccttgacatcactcctcagtccatccaaa cccagatgatatggttcaacaggtacctggagagccaggactgccaagagtcaaagtgcaatgattttgatgacactctattttggttt ggggagattggagtcaatgactatgcctacactcttggatctaccgtctcagatgaaaccataaggaagcttgcaatcagcagtgtct caggagctttacaggtatgatttaggacaaaatttacaaataattctttaggtgagttaggttcttattgtgttgttctcccatcaaaattgg agtctcacttttttagttgttttttgtattattcacctcgataatttgtgttggcctttaattcaaacttttattaagtgaattgtcgaggtagaac tctaatttcaattgaaaaacaacactaaaaacatctatagatcttcatctaatttttgtggtttggtttactgtcctaattggtcttttataccaa gtagttaaaactcaaaaacttgaaattttgtgcacagatcatcttatcccaattttataattttcattcctttgttttgcagacattgcttgaga agggtgccaagtacctagtagtgcagggtttgcctctaactgggtgcttgacattgtccatgtacctggctccaccagatgataggga tgacattggatgtgtgaaaagtgtcaacaaccaaagctactaccacaaccttgtgctgcaagacaaattacaagaattcaggaaaca gtaccctcaagctgtcatactttatgctgattactatgatgcctaccgcactgtcatgaagaatccaagcaaattcggattcaaagaga ccttcaacgtttgctgtggatcgggagaaccaccttacaacttcactgtgtttgccacatgtggcacacctaatgccactg
tgtgctca agcccttctcagtacatcaattgggatggtgttcacctcactgaggccatgtataaagttatttctagtatgtttttgcaaggaaatttcac ccaacctccgtttaattttttgttgggaaaaaaggagagggtggggtgaatggttcacccaagaataatactaatatttgggatttgctt gtccttatgactttaatgcatctgctaatgtaactataagtgagggaatcaggttttacctgttttgctagaacttgtgtcctctgcacatca tgtatgatgagttcaaaggaatatgttgtatttgtatttgtattagtatctgccaaggctgtcttaaactcggtatcagttagtgcttatctag attagttgattttgggttaataaagtggttttctatttata。
47.gmho4b核苷酸序列：
48.atggcttcttgtgtgtcatccatgtcttctaccatcctcatcctaattgccatctgcacactgtcctcacttctgtcagctgcatctg cagcaacagaggagggacgaacaaggcccttcaaaagggtctatgcctttggagactctttcacagacactggcaacaccaaaaa tgccgaaggtccaagtggctttggtcatgtttcaaactctccctacggcaccactttcttcaaccactccacaaacaggtactcagatg gtaggcttgtgattgattttgtagctgaagcactttcactgccttacttgcccccctaccgtcacagcaaaggcaatgacacttttggtgt taactttgctgttgctggctccacagccataaaccatttgttctttgtgaagcacaacctctcccttgatatcactgctcagtccatccaa acccagatgatatggttcaacaggtacctagagagccaggaatgtcaagaatcaaagtgtaatgattttgatgacactctgttttggttt ggggagattggagtcaatgactatgcctacactcttggatctactgtctcagatgagaccataaggaagcttgcaatcagcagtgtct caggagctttacaggtatgatttaggacaaaatttacaaataattttttaggtgcttattgtgttgctctcccatcaaaattgaagtctcact tctttagttgtatttggtgttattctcttatcagaattgctgtttcacctcgataatttgtgttgacctttaattcaaacttttattaactgagttat cgaggtagaaactctaatttcaattgaaaaacaacactaaaagcatctatagatcttcatctaagttttgtggtatcgtttattgtcctaatt gttctttaatttattctaagtagttaaaactcaaaaacttgaaattttgtgcacagatcatctaatcctaattttataatattcattctttgcgttg cagacgttgcttgagaagggtgccaagtacctagttgtgcagggtatgcctctaactgggtgcttgacattgtccatgtacctggctc ctccagatgatagggatgacattagatgtgttaaaagtgttaacaaccaaagctactaccacaatcttgtgctacaagacaaattacaa gaattcaggaaacagtaccctcaagctgtcatactttatgctgattactatgatgcctaccgcactgtcatgaagaatccaagcaaata cggattcaaagagaccttcaacgtttgctgtggatcaggagaaccaccttataacttcactgtgtttgccacatgtggcacacctaatg ccactgtgtgttcaagcccttctcagtacatcaattgggatggtgttcatctcacggaggccatgtacaaagtaatttctagtatgtttttg caaggaaatttcacccaacctccgtttaattttttgttggaaaaaaaggagagggtggggtgaatggttagtatttgggatttgcttgtc cctatgactttaatgcatcagctaatgtaactataagtgagggaatcaggtcttacctgttttgctacaacttgtgtcctctgcacatcata tatgatgagaagttctaaggaatatgttgtatttgtattagtatctgccaaggctgtcttaaactcggtattagctagtgcttactttgtttag attagttgattttgggttaataaagtgttttttcttttctttttacaaataaatttaaagaaaatgtaattttataattttattcaataaaaaattatc aggatgaatttattaacttttac。
49.2、靶位点序列合成
50.根据步骤1选择的靶位点，设计引物cas9 mdc123-gmho4-f/r(人工合成)， 以基因gmho4a(核苷酸序列如seq id no.1所示)、基因gmho4b(核苷酸序列如 seq id no.2所示)为模板，在10x pcr缓冲液中50℃反应6h进行退火形成具有 bpi1酶切位点粘性末端的双链dna片段，记为pam片段。
51.cas9 mdc123-gmho4-f：5
’‑
gattggagactctttcacagacac-3’。
52.cas9 mdc123-gmho4-r：5
’‑
aaacgtgtctgtgaaagagtctcc-3’。
53.3、cas9 mdc123-pam表达载体
54.选用t4 dna ligase(takara)，将上述退火后形成的pam片段在t4连接酶的作 用下连接到用bpi1酶切后的cas9 mdc123骨架上，连接产物转入大肠杆菌感受态 dh5α(100μl，唯地生物)，冰上静置30min，42℃水浴45s，加入500μl lb液体培 养基，37℃ 200rpm 1h，吸取100μl菌液均匀涂在含有50mg/l壮观霉素的lb固体培 养基上，37℃黑暗培养12h；长出单克隆后挑取2～3个单克隆活化后在公司进行测序， 验证正确，获得cas9 mdc123-pam表达载体。
55.实施例2、cas9 mdc123-pam转化农杆菌
56.向装有农杆菌lba4404感受态细胞(100μl，维地生物)的离心管中加入500ng 实施例1构建的cas9 mdc123-pam载体质粒，置于冰上5分钟，液氮冷激10s，凝 结后置于37℃水浴锅，水浴5分钟，置于冰上2分钟，然后加入不加抗生素的0.5mlyep液体培养基，250rpm 28℃振荡培养3小时，再通过3500rpm 3min离心，将菌体 沉淀均匀涂在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素的yep固体培养基，28℃培养 2天，获得携带cas9 mdc123-pam表达载体的农杆菌。
57.实施例3、农杆菌介导cas9 mdc123-pam转化大豆子叶节
58.1、大豆外植体
59.将野生型大豆威廉姆斯82(williams82)的种子用氯气消毒，将大豆放在培养皿 中(60～80粒/皿)，将培养皿放在干燥锅中；向干燥锅底部加入100ml漂白水(立白)， 再加入5ml的12m浓盐酸，培养皿在干燥锅中密闭灭菌过夜；将灭菌后的大豆种子 在萌发培养基上，24℃培养14～16小时，使其充分吸水。吸胀的大豆去除种皮，在子 叶节处制造伤口，作为大豆外植体。
60.2、农杆菌侵染液
61.将实施例2携带cas9 mdc123-pam表达载体的农杆菌接种在5ml yep液体培 养基中进行活化，28℃培养至饱和，获得活化农杆菌菌液；将活化农杆菌菌液以体积 浓度0.5％接种量接种至250ml的yep液体培养基中，28℃培养至农杆菌的对数生长 期(od600＝0.8)，获得农杆菌菌液，此时农杆菌的侵染活力最佳，浓度适宜。将农 杆菌菌液离心富集(4000rpm 10min)，去上清，沉淀用等体积共培养液重悬，获得农 杆菌侵染液。
62.3、农杆菌侵染
63.用步骤2制备的农杆菌侵染液浸没步骤1制备的大豆外植体，室温侵染(30min)。 在培养皿中放入无菌滤纸，用共培养液浸湿。将侵染完成后的大豆外植体放在滤纸上 (子叶节处朝上)，24℃黑暗培养3天后，将过长的胚轴修剪至适宜的长度(0.5cm)， 转移至芽诱导培养基上，培养2周；去除非丛生芽，在芽诱导培养基中继代一次。将 形成丛生芽的外植体，切除子叶以及被筛选而枯死的芽，移到茎伸长培养基，每两周 继代一次，直到茎长度达到5厘米时，将幼苗从茎的基部切下转移到生根培养基中， 培养1～2周，直到根长为3～5cm后，移栽至营养土中。整个组织培养过程均在24℃ 16小时光照/8小时条件下进行。移栽后的苗先在培养箱(28℃16小时光照/8小时湿 度40％)中进行练苗；当幼苗在培养箱中第3片三出复叶长出后，移栽至温室或者适 宜的自然环境中进行培育，即为转基因大豆t0代幼苗。
64.实施例4、筛选阳性苗并进行性状分离获取不含cas9蛋白的突变株系gmho4a/b
65.1、pcr鉴定实施例3获得的t0代幼苗是否为含cas9蛋白的阳性苗：
66.取50mg实施例3获得的t0代幼苗的叶片，加入200μl的tps溶液，研磨机磨 碎，并65℃水浴20分钟进行细胞裂解；12000rpm离心10min，吸取上清液并加入等 体积异丙醇进行dna沉降；再加入500μl 75％酒精洗去蛋白质等杂质，12000rpm离 心10min，去上清液，最后加30μl水溶解，获得t0代幼苗的基因组。
67.取1μl通过上述方法获得的基因组为模板，引物为cas9-id-f/r，以实施例1构 建的质粒cas9 mdc123-pam为阳性对照，野生型的大豆williams82基因组dna做 为阴性对照，水为空白对照。若pcr产物大小为750bp，则获得目标条带的对应的 t0代转基因幼苗则为阳性苗。
68.2、t0代阳性苗的基因测序验证
69.以步骤1筛选的t0代阳性苗的基因组为模板，引物：gmho4a-id-f/r， gmho4b-id-f/r，进行pcr反应，将pcr反应产物进行测序，与野生型gmho4a、 gmho4b进行比对，结果发现，t0代阳性苗的gmho4a、gmho4b基因均发生了改 变，t0代幼苗获得的基因编辑植株为gmho4a/b
+/-且携带cas9蛋白。
70.3、t1代苗的基因检测
71.将步骤1筛选的基因编辑大豆t0代阳性苗的种子种植获得基因编辑大豆t1代 苗，选取两个株系，分别为记为#1和#2，按实施例4方法获得t1代苗两个株系的基 因组，测序，结果见图1中b、c所示，其中b为#1和#2中gmho4a的突变，c为#1 和#2中gmho4b的突变。
72.以t1代苗的基因组为模板，引物：gmho4a-id-f/r，gmho4b-id-f/r，按照步 骤2方法进行pcr反应，pcr产物进行凝胶电泳检测，以实施例1构建的质粒cas9 mdc123-pam为阳性对照，野生型的大豆williams82基因组dna做为阴性对照，水 为空白对照，结果见图1中d所示。
73.通过以上方法我们获得了不含cas9蛋白且gmho4a和gmho4b同时突变的两 个纯合双突变体株系gmho4a/b#1、gmho4a/b#2，记为基因编辑大豆gmho4a/b#1、基 因编辑大豆gmho4a/b#2以用于后续实验。
74.以上pcr反应体系退火温度均为56℃，程序为94℃ 5min；95℃ 30s，52℃ 30s， 72℃ 30s，34个循环；72℃ 5min。
75.tps溶液：100mm tris-hcl，10mm edta，1m kcl，溶剂为水，ph＝8.0。
76.cas9-id-f：5
’‑
accacgctcacgatgcttac-3’77.cas9-id-r：5
’‑
acttggatggcagagccagc-3’78.gmho4a-id-f：5
’‑
cgagaagtaatttttttaaaat-3’79.gmho4a-id-r：5
’‑
agaacctaactcacctaaag-3’80.gmho4b-id-f：5
’‑
cgttatagttaatgacttaatg-3’81.gmho4b-id-r：5
’‑
aacagcaattctgataagag-3’。
82.实施例5、对基因编辑大豆纯合双突变株系gmho4a/b进行表型分析
83.1、野生型威廉姆斯82大豆gmho4的表达模式分析
84.rna提取：取样品用液氮冷冻，研磨后加入1ml trizol(购自invitrogen公司) 迅速混匀，室温放置15min，每2～3分钟颠倒混匀一次，然后12,000rpm离心5min， 弃去沉淀；吸取上清液转入新离心管，加入和上清液等体积的异丙醇，12000rpm离 心10min；再用75％
乙醇/0.1％depc水洗去杂质，最后用30μl的0.1％depc水溶 解，最终获得样品的总rna。再用反转录试剂盒(takara)进行反转录获得样品的 cdna，具体实验方法参照试剂盒说明书。
85.大豆组织中gmho4的相对表达量：选取野生型威廉姆斯82大豆的不同组织： 根、茎、叶、花、根瘤、荚及种子，每个样品各3个重复，每个样品50mg，进行总 rna的提取，反转录cdna；以cdna为模板，分别用gmho4的特异性引物 ho4a-qpcr-f/r和ho4b-qpcr-f/r进行荧光定量pcr。以大豆的内参基因actin 为对照。最后通过计算获得各样品中gmho4的相对表达量，结果见图2中a和b所 示。
86.种子组织中gmho4的相对表达量：为了评估对gmho4进行基因编辑后是否会 影响种子的发育，故进一步探索了gmho4在不同种子结构中的表达：选取野生型威 廉姆斯82大豆的胚、胚乳、子叶。每个样品各3个重复，每个样品50mg，进行总 rna的提取，反转录cdna；以cdna为模板，gmho4的特异性引物ho4a-qpcr-f/r 和ho4b-qpcr-f/r进行荧光定量pcr。以大豆的内参基因actin为对照。最后通过 计算获得各样品中gmho4的相对表达量，结果见图2中c和d所示。
87.图2表明，gmho4在种子和荚中高表达，在花中有少量表达，在根、茎、叶、 根瘤等组织中表达量极低；在种子的胚乳中不表达，主要集中在胚和子叶中表达。
88.ho4a-qpcr-f：5
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gatcgggagaaccaccttac-3’89.ho4a-qpcr-r：5
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atacatggcctcagtgagg-3’90.ho4b-qpcr-f：5
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gatcaggagaaccaccttat-3’91.ho4b-qpcr-r：5
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gtacatggcctccgtgaga-3’92.2、基因编辑大豆gmho4a/b#1、gmho4a/b#2生长性状的统计及种子结构的观察
93.将野生型大豆品种威廉姆斯82作为对照材料，与实施例4筛选的基因编辑大豆 gmho4a/b#1、基因编辑大豆gmho4a/b#2，分别在温室(16小时/光照，8小时/黑暗， 28℃)及海宁试验田中(2021年5月-2021年8月)进行种植。
94.通过观察发现，gmho4a/b#1、gmho4a/b#2在早期幼苗时期的生长与野生型相比略 为迟缓，但在营养生长后期已无明显差异(图5)。
95.通过对田间收获的种子的大小、单粒重、产量和株高进行统计后发现， gmho4a/b#1、gmho4a/b#2的种子大小与野生型无显著差异(图6中a和b)；并且 gmho4a/b#1、gmho4a/b#2的单株产量也并未降低(图6中c和d)。
96.3、基因编辑大豆gmho4a/b#1、gmho4a/b#2种子结构的观察
97.大豆种子发育时期可以分为球形期、心形期、子叶期。gmho4在种子的胚和子 叶中有高表达，在胚乳中不表达(图2)。为了探究基因编辑gmho4是否对种子结构 有影响，选取野生型大豆品种威廉姆斯82和随机选择的步骤2田间种植的基因编辑 大豆gmho4a/b在3个不同时期的种子进行解剖，并在体视镜下进行观察。通过观察 发现，gmho4a/b的种子各结构与野生型一致，胚发育正常(图7)。
98.综上所述，基因编辑gmho4并未对大豆的生长发育并未造成不利影响。
99.4、基因编辑大豆gmho4a/b油含量分析
100.总含油量：随机选取步骤2田间收获的威廉姆斯82、基因编辑大豆gmho4a/b种 子，通过气相色谱法(agilent,ca,usa,db-23)检测总含油量，结果表明gmho4a/b 种子的总含油量与野生型相比显著上升(图3)。
101.脂肪酸：随机选取步骤2田间收获的威廉姆斯82、基因编辑大豆gmho4a/b种子 (20粒左右)，编号入袋，于70℃烘箱内烘干(48小时)，烘干后磨成粉末。精准称 量50mg于玻璃试管中，加2ml提取液(氯仿异：丙醇＝2:1，v/v)，常温避光提取 2小时，期间每半小时旋涡震荡一次；2500rpm离心5min；取500μl上清至一个新 试管中，加入2ml的体积浓度1％硫酸甲醇溶液(v/v)(100ml＝1ml浓硫酸+99ml 甲醇)，盖紧盖子，80℃水浴1小时；冷却至常温，加入2ml的质量浓度0.9％nacl 水溶液和1ml正己烷，剧烈旋涡震荡，2500rpm离心2min；吸取全部上清于新试管 中，加入2ml正己烷提取残液2次(每次1ml)，合并于上清液试管中，旋涡离心， 取700-1000μl上样进行气相色谱检测，结果见图4。
102.图4表明，gmho4a/b中各脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸) 的含量均显著增加；分析各脂肪酸组分的占比可发现，gmho4a/b的各脂肪酸含量与野 生型相比未发生改变。
103.由此可见，gmho4对油脂的分解没有特异性，故基因编辑gmho4后仅提高油 脂的积累量，不改变其组成结构(图4)。
104.气相色谱法检测程序：(1)120℃，5min；(2)升温至190℃，保护12min，升 温速率为4℃/min；(3)将温度提高到210℃并保持10分钟，升温速率为2.5℃/min， 载气为氮气。最后，使用280℃气相色谱-火焰离子化检测器(7890a,agilent,usa) 进行检测。
技术特征：1.一种提高大豆种子含油量的方法，其特征在于，所述方法是在大豆酯酶基因gmho4的起始密码子后135bp-154bp处的靶位点进行基因编辑使其不表达，从而实现大豆种子含油量的提高。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶位点pam序列为：ggagactctttcacagacac。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑包括插入或缺失。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大豆酯酶基因gmho4包括gmho4a和gmho4b，对应的核苷酸序列分别为seq id no.1和seq id no.2。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶位点的基因编辑方法为：(1)人工合成大豆酯酶基因gmho4的靶位点基因片段，将所述靶位点基因片段连接至载体cas9mdc123上，构建含靶位点基因片段的重组载体，转化农杆菌，获得含重组载体的农杆菌；(2)用步骤(1)含重组载体的农杆菌菌液侵染大豆外植体，筛选不含cas9蛋白且gmho4基因已经成功被编辑且纯合的株系，获得所述大豆种子含油量提高的株系。
技术总结本发明公开了一种提高大豆种子含油量的方法，所述方法是在大豆酯酶基因GmHO4的起始密码子后135bp-154bp处的靶位点进行移码突变基因编辑使其不表达，从而实现大豆种子含油量的提高；所述靶位点PAM序列为：GGAGACTCTTTCACAGACAC。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对大豆酯酶基因GmHO4进行基因编辑使其不表达，通过降低脂肪酸的降解率来增加大豆种子中脂肪酸的积累量。本发明获得的突变位点纯合且无外源片段插入的株系的大豆不仅具有较高的含油量，并且对大豆的生长发育未产生不良影响，安全风险极低，为后续我国将具有优良性状的转基因大豆投入商业化种植提供了更多的可行性。供了更多的可行性。
技术研发人员：寿惠霞 廖文英 郭润泽
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.03.28
技术公布日：2022/7/5
