1.本发明涉及生物领域，具体涉及一种重组质粒的制备方法和重组病毒。
背景技术：2.禽流行性感冒(avian influenza,ai)是由禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)引起的一种急性呼吸道传染病，简称为禽流感。禽流感病毒属于甲型流感病毒，通常以其表面蛋白、血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的组合为特征，导致许多不同的亚型，例如h1n1、h5n6或h9n2[1]。根据禽流感的致病性，可将其分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。其中，h9n2亚型aiv通过分子表征和病理分型均被归为低致病性禽流感。在中国，h9n2已取代h5n6和h7n9成为鸡和鸭的主要aiv亚型[2]。家禽感染h9n2亚型aiv后一般呈亚临床症状，如咳嗽、打喷嚏、罗音、喘鸣等轻度呼吸系统症状[3]，还可对被感染鸡免疫系统产生明显影响，导致其免疫抑制[4]和继发感染，在肉鸡和青年鸡中易与其它病原体合并感染，引起死淘率升高，其高感染率和高传染性威胁着全球家禽业经济发展。此外，h9n2亚型病毒还能通过抗原漂移或抗原转移为新型的流感病毒提供基因，产生能够感染人类及其他动物的新型人兽共患病病毒，严重威胁公共卫生安全[5,6]。aiv属于正粘病毒科a型，包含一个分段负义rna基因组，该基因组编码10个核心蛋白和多种辅助蛋白，其中ha蛋白是流感病毒粒子表面最主要成分，最重要功能是受体结合和膜融合，呈现禽流感病毒的中和抗体表位(neutralizing antibodies,nabs)[7]，还可能在病毒粒子出芽和形态发生过程中发挥作用，并且还是宿主获得性免疫系统识别的主要对象，是流感病毒疫苗研制的主要靶抗原[8]。ha蛋白作为一种典型的i型病毒包膜糖蛋白，在细胞内翻译为多肽前体ha0后，ha0三聚体中的每个单体均被细胞中的蛋白酶切割，形成两个二硫键连接的亚基ha1和ha2，分别构成受体结合区和膜融合结构域。在进入细胞表面时，ha1与质膜中的唾液酸部分通过相互作用附着在细胞表面。随后，病毒粒子被内吞并运输到晚期的内吞体内。内体的酸化会触发ha的构象变化，从而导致病毒和内体膜的融合，从而将病毒遗传物质释放到宿主细胞中[9]。在此过程中，ha蛋白会经历融合前、中间、融合后状态。研究表明，在大多数情况下，相关的nab表位显示最佳或仅当三聚体处于融合前构象时，而融合后或其他异常的蛋白构象主要诱导没有或有限保护能力的非中和抗体[10]。对于i型病毒包膜糖蛋白，为了使其抗原蛋白发挥最佳的免疫性能，可通过设计成提高其稳定性、提高在生产过程中的产量以及呈现其关键nab表位的方式来实现。其中，所用的稳定蛋白构象的方法是在特定位置引入结构引导的脯氨酸取代，以维持融合前三聚体形式[11]。
[0003]
新城疫(newcastle disease,nd)是由新城疫病毒(newcastle disease virus,ndv)引起的禽类高度接触性传染病，可导致呼吸系统、神经系统、消化道及内脏损伤，致死率可达100％。随着反向遗传技术的广泛应用，世界各地科学家己经证实了新城疫病毒作为控制人类和动物疾病的疫苗载体候选株的潜力。我们前期已研发一株能有效对抗基因vii型流行毒株的减毒株rdhn3-mf。
[0004]
本案所需要解决的问题是：如何提高病毒的表达效果。
[0005]
本案涉及的相关文献如下：
[0006]
[1].peacock,t.,et al.,a global perspective on h9n2 avian influenza virus.viruses,2019.11(7).
[0007]
[2].bi,y.,et al.,dominant subtype switch in avian influenza viruses during 2016-2019in china.nat commun,2020.11(1):p.5909.
[0008]
[3].kim,j.a.,et al.,h9n2 influenza viruses isolated from poultry in korean live bird markets continuously evolve and cause the severe clinical signs in layers.vet microbiol,2006.118(3-4):p.169-76.
[0009]
[4].bano,s.,k.naeem and s.a.malik,evaluation of pathogenic potential of avian influenza virus serotype h9n2 in chickens.avian dis,2003.47(3suppl):p.817-22.
[0010]
[5].lenny,b.j.,et al.,replication capacity of avian influenza a(h9n2)virus in pet birds and mammals,bangladesh.emerg infect dis,2015.21(12):p.2174-7.
[0011]
[6].quan,c.,et al.,new threats from h7n9 influenza virus:spread and evolution of high-and low-pathogenicity variants with high genomic diversity in wave five.j virol,2018.92(11).
[0012]
[7].murin,c.d.,i.a.wilson and a.b.ward,antibody responses to viral infections:a structural perspective across three different enveloped viruses.nat microbiol,2019.4(5):p.734-747.
[0013]
[8].skehel,j.j.and d.c.wiley,receptor binding and membrane fusion in virus entry:the influenza hemagglutinin.annu rev biochem,2000.69:p.531-69.
[0014]
[9].das,d.k.,et al.,direct visualization of the conformational dynamics of single influenza hemagglutinin trimers.cell,2018.174(4):p.926-937.e12.
[0015]
[10].sanders,r.w.and j.p.moore,virus vaccines:proteins prefer prolines.cell host microbe,2021.29(3):p.327-333.
[0016]
[11].graham,b.s.,m.gilman and j.s.mclellan,structure-based vaccine antigen design.annu rev med,2019.70:p.91-104.
[0017]
[12].中国专利申请cn202011642554-重组质粒、重组基因vii型新城疫病毒及其培养方法；
[0018]
[13].中国专利申请cn202010730869-一株表达传染性法氏囊强毒株vp2蛋白的基因ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗。
技术实现要素：[0019]
本发明的目的是提供一种重组质粒的制备方法和病毒，通过将h9n2亚型禽流感的血凝素蛋白ha茎端c环上第403位异亮氨酸、第411位缬氨酸均突变为脯氨酸，并分别将突变前后的ha基因插在rdhn3-mf病毒基因组的p基因和m基因之间的非编码区，获得了两株能稳定表达h9n2 aiv的ha蛋白的新城疫基因vii型减毒株重组病毒rdhn3mf-ha-2p，经wb验证表
明双脯氨酸突变后的ha基因与原ha基因相比，其表达效率更高。该重组病毒有望进一步开发成抗新城疫和h9n2亚型禽流感病毒的二联疫苗。
[0020]
本发明的具体方案如下：1.一种重组质粒的制备方法，将f1片段、f2片段、ha片段或ha-2p片段、f4片段同源重组得到重组质粒；
[0021]
f1片段、f2片段、ha片段、ha-2p片段、f4片段分别如序列表seq id no：1～5所示。
[0022]
在上述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法中，采用重组试剂盒按照以下组分在37℃反应30分钟即可，加入：
[0023]
f1片段30ng；
[0024]
f2片段97ng；
[0025]
ha片段或ha-2p片段30ng；
[0026]
f4片段200ng；
[0027]
5xce multis buffer 4μl；
[0028]
exnase multis 2μl；
[0029]
加入ddh2o至20μl。
[0030]
在上述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法中，f1片段的制备方法为：
[0031]
以pbr322-fdhn3载体为模板用分别用引物fdhn3-f1、fdhn3-smai-r1扩增得到f1片段；
[0032]
引物fdhn3-f1、fdhn3-smai-r1分别如序列表seq id no：6～7所示。
[0033]
在上述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法中，所述f2片段的制备方法为：
[0034]
以pbr322-fdhn3载体为模板用分别用引物fdhn3-smai-f2、fdhn3-r2扩增得到f2片段；
[0035]
引物fdhn3-smai-f2、fdhn3-r2分别如序列表seq id no：8～9所示。
[0036]
在上述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法中，所述ha片段的制备方法为：
[0037]
以pxj40flag-ha载体为模板用引物ha-f、ha-r扩增得到的ha片段；
[0038]
所述ha-2p片段的制备方法为：
[0039]
以pxj40flag-ha-2p载体为模板用引物ha-f、ha-r扩增得到的ha-2p片段；
[0040]
所述pxj40flag-ha-2p载体的制备方法为：
[0041]
以pxj40flag-ha质粒为载体，根据试剂盒mut express ii fast mutagenesis kit v2说明书，用引物mutate-f、mutate-r反向扩增pcr片段；
[0042]
经dpn i酶切消化后，将消化产物进行体外环化；
[0043]
将环化质粒进行转化，挑取单克隆菌对ha片段进行测序；
[0044]
选取测序正确的菌落进行扩繁，抽提质粒得到pxj40flag-ha-2p载体；
[0045]
所述ha-f、ha-r分别如序列表seq id no：10～11所示；
[0046]
所述引物mutate-f、mutate-r分别如序列表seq id no：12～13所示。
[0047]
此外，本发明公开了一种重组病毒，按照如上任一所述方法制备得到的质粒转染bhk-21细胞，得到病毒rdhn3mf-ha或病毒rdhn3mf-ha-2p。
[0048]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0049]
本发明将h9n2亚型禽流感ha基因在ha茎端c环上第403位异亮氨酸、411位缬氨酸均突变为脯氨酸，再分别将突变前后的ha基因通过dna重组的方法插进新城疫基因vii型
dhn3mf弱毒株的m和p基因之间，分别构建了感染性cdna克隆pbr322-dhn3mf-ha与pbr322-dhn3mf-ha-2p质粒。将二质粒分别与pxj40-np，pxj40-p，pxj40-l和pxj40-de3质粒混合，共转染bhk-21细胞，成功获得两株稳定的能有效表达h9n2亚型禽流感ha基因和ndv抗原蛋白的重组病毒rdhnmf-ha与rdhnmf-ha-2p。根据wb结果显示，ha基因经双脯氨酸突变后的表达效率比未突变前的ha基因表达效率更高。该重组病毒有望进一步开发成抗禽流感病毒和抗新城疫病毒的二联疫苗，为控制禽流感病毒和新城疫病毒感染提供新的防御手段。
附图说明
[0050]
图1为禽流感h9n2亚型ha基因经双脯氨酸突变后的测序结果。
[0051]
图2为f1基因片段凝胶电泳图；其中m：dna marker；1-4：f1pcr片段(1471bp)。
[0052]
图3为f2基因片段凝胶电泳图；其中m：dna marker；1-4：f2pcr片段(4815bp)；
[0053]
图4为f3-ha基因片段凝胶电泳图；其中m：dna marker；1-4：f3-ha pcr片段(1731bp)。
[0054]
图5为f3-ha-2p基因片段凝胶电泳图；其中m：dna marker；1-4：f3-ha-2p pcr片段(1731bp)；
[0055]
图6为f4基因片段凝胶电泳图；其中m：dna marker；1-2：pbr322-fdhn3 smai酶切后dna片段；
[0056]
图7为重组质粒rdhn3-mf-ha单菌落的pcr检测鉴定图，其中m：dna marke；1-9：rdhn3-mf-ha单菌落(阳性菌落：2306bp)；
[0057]
图8为重组质粒rdhn3-mf-ha-2p单菌落的pcr检测鉴定图，其中m：dna marke；1-9：rdhn3-mf-ha-2p单菌落(阳性菌落：2306bp)；
[0058]
图9为重组质粒的酶切鉴定图，其中m：dna marker；1-3：重组质粒rdhn3-mf-ha；4-6：重组质粒rdhn3-mf-ha-2p；
[0059]
图10为pbr322-fdhn3-ha质粒示意图；
[0060]
图11为pbr322-fdhn3-ha-2p质粒示意图；
[0061]
图12为重组病毒尿囊液感染bhk-21细胞放大图，其中a：rdhn3mf-ha重组病毒尿囊液；b：rdhn3mf-ha-2p重组病毒尿囊液；c：spf鸡胚尿囊液；
[0062]
图13为重组病毒ha、f基因的pcr检测鉴定图，其中，m:dna marker；左a：重组病毒rdhn3mf-ha用引物对f-f/r的扩增条带大小为815bp；左b：重组病毒rdhn3mf-ha-2p用引物对f-f/r的扩增条带大小为815bp；右a：重组病毒rdhn3mf-ha用引物对ha-f/ha-r的扩增条带大小为1731bp；右b：重组病毒rdhn3mf-ha-2p用引物对ha-f/ha-r的扩增条带大小为1731bp；
[0063]
图14为重组病毒rdhn3mf-ha鸡胚连续传代ha基因检测电泳图，其中1-3分别为第5代、第10代、第15代重组病毒ha基因(1731bp)；
[0064]
图15为重组病毒rdhn3mf-ha-2p鸡胚连续传代ha基因检测电泳图，其中1-3分别为第5代、第10代、第15代重组病毒ha-2p基因(1731bp)；
[0065]
图16为重组病毒的ndv蛋白检测结果，其中，m：蛋白分子量；1：阴性对照；2：转染pxj40flag-ha质粒的细胞蛋白样品；3：感染rdhn3mf鸡胚尿囊液细胞蛋白样品；4：感染rdhn3mf-ha尿囊液细胞蛋白样品；5：感染rdhn3mf-ha-2p尿囊液细胞蛋白样品；
[0066]
图17为重组病毒的ha蛋白检测结果，其中，m：蛋白分子量；1：阴性对照；2：转染pxj40flag-ha质粒的细胞蛋白样品；3：感染rdhn3mf鸡胚尿囊液细胞蛋白样品；4：感染rdhn3mf-ha尿囊液细胞蛋白样品；5：感染rdhn3mf-ha-2p尿囊液细胞蛋白样品；
[0067]
图18为重组病毒的β-actin蛋白检测结果，其中，m：蛋白分子量；1：阴性对照；2：转染pxj40flag-ha质粒的细胞蛋白样品；3：感染rdhn3mf鸡胚尿囊液细胞蛋白样品；4：感染rdhn3mf-ha尿囊液细胞蛋白样品；5：感染rdhn3mf-ha-2p尿囊液细胞蛋白样品；
[0068]
图19为等比例放大图17、图18的wb条带图；
[0069]
图20为pmd19t-aiv-ha质粒图谱。
[0070]
图21为以pmd19t-aiv-ha质粒为模板，用引物aiv-ha-f/r扩增的1698bp片段的凝胶电泳图。
具体实施方式
[0071]
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围内。
[0072]
实施例1
[0073]
主要仪器设备
[0074]
电热恒温培养箱hz-100(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；三孔电热恒温水槽dk-8d(一恒科学仪器有限公司,中国上海；海尔bcd-579we冰箱(海尔，中国上海)；co2恒温培养箱forma 371(thermo公司，美国)；超净工作台sw-cj-2fd(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；生物安全柜1300series a2(thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(nikon公司，日本)；高速离心机centrifuge 5804r(eppendorf公司，德国)；移液器research plus(eppendorf公司，德国)；pcr仪c1000 touch(bio-rad公司，美国)；电泳仪powerpac basic(bio-rad公司，美国)；垂直电泳槽miniprotean tetra(bio-rad公司，美国)；凝胶成像系统2500(r)(tanon公司，中国上海)；超纯水仪milli-q(millipore公司，美国)；超低温冰箱forma 994(thermo公司，美国)；核酸蛋白分析仪nano drop 2000(thermo公司，美国)；生化培养箱lrh-250(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；分析天平bsa224s(sartorius公司，德国)；涡旋振荡器(thermo公司，美国)；azure biosystems c600多功能分子成像系统(azure biosystems公司，美国)。
[0075]
主要试剂和材料
[0076]
tian prep mini plasmid kit(dp103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；gel extraction kit(d2500-02)购自omega；hiscriptiii 1st strand cdna sythesis kit(+gdna wiper)(r312)购自南京诺维赞生物制品有限公司；agarose(e0301)购自tsingk；0.25％trypsin-edta(25200-056)，dmem basic(c11995500bt)购自gibco；lipofectamine ltx and plus reagent(15338-100)购自invitrogen；fbs(10099-141c)购自gibco；premix-taq(rr902a)购自takara；pen strep penicillin streptomycin(15140-122)购自gibco；2
×
phanta flash master mix(dye plus)(p520)购自南京诺维赞生物制品有限公司；常用限制性内切酶购自takara；clonexpress multis one step cloning kit(c113)购自南京诺维赞生物制品有限公司；trizol 15596-026购自invitrogen；氯仿，异丙醇，无水乙醇等生化试剂购自宁波萃英化学技术有限公司；10xsds-page电泳液购自碧云
天；sds-page凝胶配制试剂盒、beyoecl plus(超敏ecl化学发光试剂盒)购自碧云天；0.22μm nc膜(3米/卷)购自pall公司；goat anti-rabbit igg h&lpreadsorbed(ab6940)购自cst；兔抗鸡igg-hrp(se235)购自solarbio；tbs缓冲液购自博士德生物公司；aiv-ha多抗与ndv高免血清(本实验室自制)；anti-β-actin mouse monoclonal antibody(hc201-01)购自全式金公司。pxj40flag-ha由本实验室构建；pbr322-dhn3mf，pxj40-np，pxj40-p，px j40-l，pxj40-de3均为华农(肇庆)生物技术研究院提供；pmd19t-vector-宝生物工程(大连)有限公司pmd 19-t vector cloning kit-takara biotechnology(dalian)co.ltd。
[0077]
pxj40flag-ha质粒的构建参考如下方法：
[0078]
(一)h9n2亚型禽流感的ha基因片段的扩增
[0079]
本实验以2015年在华南地区某鸡场分离到的一株h9n2亚型aiv毒株，取感染鸡胚的尿囊液，用trizol法提取aiv病毒基因组rna再将反转录获得基因组的cdna。使用表中的aiv-ha-f/r引物通过2
×
phanta flash master mix(dye plus)酶作pcr扩增1698bp的目的片段，扩增的pcr产物用0.8％的琼脂糖凝胶鉴定，胶回收目的片段测其浓度再通过t4连接酶连接到pmd19t-vector中，命名为pmd19t-aiv-ha，测序送生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0080]
pcr反应液的配制：
[0081][0082]
pcr反应条件：
[0083][0084][0085]
pmd19t-aiv-ha质粒图谱可见图20。
[0086]
(二)构建pxj40flag-ha质粒
[0087]
1.以pmd19t-aiv-ha质粒为模板，用引物aiv-ha-f/r扩增1698bp片段，胶回收片段并测定浓度；
[0088]
2.用kpni酶与bamhi酶对pxj40-flag质粒和用引物aiv-ha-f/r扩增出的1698bp片段(序列表seq id no：16)进行双酶切；
[0089]
3.用t4连接酶将1698bp片段连接至线性pxj40-flag质粒中，构建pxj40flag-ha质粒。
[0090]
图21为以pmd19t-aiv-ha质粒为模板，用引物aiv-ha-f/r扩增的1698bp片段的凝胶电泳图
[0091]
pxj40-flag质粒可见zl201910894754.9主题为一种针对ii类vii型流行ndv株dhn3的感染性重组克隆方法的说明书的146-153段关于pxj40-flag的来源渠道的记载。
[0092][0093]
本案所涉及的相关引物或其他片段序列如下表1：
[0094]
表1序列表
[0095]
[0096][0097]
实验过程
[0098]
1.pxj40flag-ha-2p质粒的构建
[0099]
(1)以pxj40flag-ha(如序列表seq id no：13)所示质粒为载体，根据试剂盒mut express ii fast mutagenesis kit v2说明书，用引物mutate-f/mutate-r(引物序列详见附表1)反向扩增pcr片段；
[0100]
(2)经dpn i酶切消化后，将消化产物进行体外环化；
[0101]
(3)将环化质粒进行转化，挑取单克隆菌对ha片段进行测序；
[0102]
(4)选取测序正确的菌落进行扩繁，抽提质粒。
[0103]
2.构建表达h9n2亚型aiv-ha基因的新城疫病毒重组质粒pbr322-dhn3mf-aiv-ha与-pbr322-dhn3mf-aiv-ha-2p
[0104]
(1)以pbr322-fdhn3载体为模板用分别用引物，fdhn3-f1/fdhn3-smai-r1；fdhn3-smai-f2/fdhn3-r2扩增长度为1471bp的f1，长度为4815bp的f2 pcr片段。
[0105]
pbr322-fdhn3参考cn202011642554-重组质粒、重组基因vii型新城疫病毒及其培养方法所记载的序列表seq id no：3所示；
[0106]
分别以pxj40flag-ha或pxj40flag-ha-2p载体为模板用引物ha-f/ha-r扩增长度为1731bp的ha片段和同长度的ha-2p的rcr片段。(引物序列详见附表1)
[0107]
pcr反应液的配制参考下表2：
[0108]
表2
[0109][0110]
pcr反应条件：
[0111][0112]
用smai酶切pbr322-dhn3mf载体(本实验室提供)，通过胶回收纯化13399bp dna片段f4。
[0113]
pbr322-dhn3mf载体可参考cn202010730869-一株表达传染性法氏囊强毒株vp2蛋白的基因ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗，所记载的pbr322-mfdhn3；pbr322-mfdhn3和pbr322-dhn3mf相同。
[0114]
制备方法可参考cn202010730869-一株表达传染性法氏囊强毒株vp2蛋白的基因ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗说明书第97-103段。
[0115]
(2)将上述4个片段共同进行如下同源重组(重组试剂盒购自南京诺维赞(clonexpressmultis one step cloning kit，c113)，配方如下表3：
[0116]
表3
[0117]
试剂用量f1片段30ngf2片段97ngha/ha-2p片段30ngf4片段200ng5xce multis buffer4μlexnase multis2μlddh2oup to 20μl
[0118]
在冰上制备好上述体系后在37℃反应30分钟。
[0119]
(3)将重组产物转化进trans2-blue感受态细菌。
[0120]
(a)在冰上解冻trans2-blue感受态细胞，取10μl重组物加入到50μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。
[0121]
(b)42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。
[0122]
(c)加入1ml soc培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。
[0123]
(d)将amp+的lb平板固体培养基在37℃培养箱中预热。
[0124]
(e)取100μl的细菌液用无菌涂板棒轻轻涂在含有amp+抗性的平板上。
[0125]
(f)37℃培养箱中倒置培养12-16h。
[0126]
(4)用引物m-f2/p-r2进行菌落pcr鉴定，总共筛选8个菌落，有8个呈阳性，正确产物为2300bp。
[0127]
(5)hindiii酶切进行质粒鉴定。
[0128]
分别取上述3个阳性菌落进行扩增培养，提取质粒dna。
[0129]
分别用hindiii(购自takara)酶切，反应如下表4：
[0130]
表4
[0131][0132][0133]
正确的质粒用hindiii酶切后应分别产生1个12382bp，5654bp，3294bp的dna片段。
[0134]
酶切结果如下图9-11，1-6号质粒产生了正确的3个片段。将1号质粒与4号质粒进行测序验证，结果证明该质粒含正确的插入序列，分别命名为pbr322-dhn3mf-ha与pbr322-dhn3mf-ha-2p。
[0135]
2.转染bhk细胞,拯救病毒
[0136]
(1)将bhk-21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用lipofectamine ltx dna transfection reagents转染试剂盒，并严格按试剂盒指导方法进行转染。
[0137]
(2)转染试剂配制如下：
[0138]
a液：opti-mem medium 150μl,lipofectamine ltx reagent 15μl,静置5min；
[0139]
b液：opti-mem dna 175μl，pbr322-dhn3mf-ha(pbr322-dhn3mf-ha-2p)4μg，pxj40-np 2.5μg，pxj40-p 1.25μg，pxj40-l 1.25μg，pxj40-de3 3μg，plus reagent3.5μl，吹打混匀，静置5min。
[0140]
取a液b液各150μl混合均匀，静置20min。取250μl混合液用于转染细胞。
[0141]
(3)4天后将上述转染细胞(包括培养液)置-80度冻存。
[0142]
(4)将该冻存细胞反复冻融3次，4度10000/rpm离心5分钟。取200μl上清液感染df-1细胞。24h后可见大量细胞死亡。如下图所示：a为rdhn3mf-ha感染细胞；b为rdhn3mf-ha-2p感染细胞；c为未加病毒液的阴性对照细胞。分别从a,b,c细胞提取总rna用于下述病毒鉴定试验。
[0143]
3.鉴定重组病毒
[0144]
(1)rt-pcr
[0145]
用上述a、b和c细胞总rna进行rt-pcr。
[0146]
rt:使用hiscriptiii 1st strand cdna sythesis kit(+gdna wiper)，严格按照说明书进行。
[0147]
a.microtube管中配制下列去基因组dna混合液，总量8μl，参考表5。
[0148]
表5
[0149]
试剂名称使用量模板rna8μl5
×
gdna wiper mix2μl
[0150]
用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。
[0151]
b.在上述microtube管中配制下列反转录反应液，参考表6。
[0152]
表6
[0153]
试剂名称使用量上述混合溶液10μl10
×
rt mix2μlhiscript iii enzyme mix2μloligo(dt)
20
vn1μlrnase-free ddh2o5μl
[0154]
置37℃，反应45min，85℃，反应5s。
[0155]
pcr：分别用引物f-f/f-r和引物ha-f/ha-r进行鉴定。
[0156]
pcr体系的组成参考表7：
[0157]
表7
[0158]
primer110pmolprimer210pmolcdna模板2μlpremix taq10μlddh2oup to 20μl
[0159]
pcr反应条件：
[0160][0161][0162]
分别取10μl pcr产物跑胶，结果如下图13所示：左图为f-f/f-r引物，正确产物应为815bp；右图为ha-f/ha-r引物，正确产物应为1731bp。
[0163]
(2)扩增病毒
[0164]
用上述rdhn3mf-ha与rdhn3mf-ha-2p的p0代病毒200μl接种spf鸡胚并连续传代10次，收获各代鸡胚尿囊液于-80℃保存。
[0165]
(3)rt-pcr和测序验证rdhn3mf-ha与rdhn3mf-ha-2p重组病毒的稳定性
[0166]
分别从重组毒rdhn3mf-ha与rdhn3mf-ha-2p的f1、f5、f10代鸡胚尿囊液中提取rna并用其进行rt-pcr。方法和前述一致。
[0167]
pcr：引物为ha-f/ha-r；正确产物应为1731bp。
[0168]
结果如下图14和15所示，各病毒的3个样本均产生了正确大小的pcr产物。将其分别送去测序，结果证实均为正确的dna序列，提示该重组病毒是相对稳定的。
[0169]
4.wb验证重组病毒ha蛋白的表达水平
[0170]
用正常spf鸡胚尿囊液接种细胞的蛋白样品(1)，转染pxj40flag-ha质粒的细胞蛋白样品(2)，感染rdhn3mf鸡胚尿囊液细胞蛋白样品(3)，感染rdhn3mf-ha尿囊液细胞蛋白样品(4)和感染rdhn3mf-ha-2p尿囊液细胞蛋白样品(5)跑10％蛋白胶并进行wb检测。结果显示如下：
[0171]
用ndv高免血清能检测到约55kd大小的蛋白，该蛋白在蛋白胶上显示与rdhn3-mf感染产物具相同的大小和形态。
[0172]
图16为用兔抗ha多克隆抗体能检测到约75kda大小的蛋白，该蛋白与ha蛋白的大小一致。
[0173]
图17为用鼠抗β-actin单克隆抗体能检测到约40kda大小的蛋白，该蛋白与actin蛋白的大小一致。
[0174]
详细方法如下：
[0175]
检测ndv蛋白：
[0176]
将bhk-21细胞置6孔板中培养至90％，用pbs洗两遍，分别加入2ml 0.1％trypsin-dmem孵育液，用2moi dhn3鸡胚尿囊液，或2moi rdhn3mf-ha或2moi rdhn3mf-ha-2p鸡胚尿囊液感染bhk-21细胞。阴性对照加200μl spf鸡胚尿囊液。24h后收集细胞，分别加入200μl的ripa强裂解液(含1mm pmsf)，95℃干浴裂解10min后，12 000
×
g离心10min，取上清20μl进行10％sds-page(bio-rad)。后将蛋白电转移到nc膜上。5％脱脂乳封闭2h，tbst(0.05％tween20)洗涤四次，每次5min。加入1：1000稀释的鸡ndv高免血清4℃孵育过夜。tbst洗涤四次，每次5min。分别加1﹕10000倍tbst稀释辣根过氧化物酶(hrp)标记兔抗鸡ig g(lic)室温孵育1h。tbst洗涤四次，每次5min。向加入超敏ecl化学发光显色液。用azure biosystems c600多功能分子成像系统成像。
[0177]
检测ha蛋白与β-actin蛋白：
[0178]
将bhk-21细胞置直径3.5cm培养皿培养至60％，用pbs洗两遍后，用lipofectamine ltx dna transfection reagents转染试剂盒将pxj40flag-ha质粒转染入bhk-21细胞中。将bhk-21细胞置6孔板中培养至90％，用pbs洗两遍，分别加入2ml 0.1％trypsin-dmem孵育液，用2moi dhn3鸡胚尿囊液，或2moi rdhn3mf-ha或2moi rdhn3mf-ha-2p鸡胚尿囊液感染bhk-21细胞。阴性对照加200μl spf鸡胚尿囊液。24h后收集细胞，分别加入200μl的ripa强裂解液(含1mm pmsf)，95℃干浴裂解10min后，12 000
×
g离心10min，取上清20μl进行10％sds-page(bio-rad)。后将蛋白电转移到nc膜上。5％脱脂乳封闭2h，tbst(0.05％tween20)洗涤四次，每次5min。分别加入1：2000稀释的兔ha多克隆抗体、鼠β-actin单克隆抗体，4℃孵育过夜。tbst洗涤四次，每次5min。分别加1﹕10000倍tbst稀释、山羊抗兔荧光二抗、山羊抗鼠荧光二抗室温孵育1h。tbst洗涤四次，每次5min。用azure biosystems c600多功能分子成像系统成像。
[0179]
5.重组病毒的生物学特性分析
[0180]
(1)重组病毒的ha测定
[0181]
在96孔微量反应孔中加入0.025ml/孔的生理盐水，再向每排的第一孔中加入待检
病毒0.025ml/孔，并按顺序做倍比稀释，稀释至第11孔弃掉0.025ml，将第12孔做为阴性对照，最后向每孔加入0.025ml的1％鸡红细胞悬浮液，用微量振荡器混合均匀，室温静置20min～25min，判定血凝效价(ha)，为减少实验误差，每个样品重复测三次。
[0182]
(2)重组病毒的tcid50测定
[0183]
将bhk-21细胞提前一天铺于96孔板中，将细胞培养至90％后开始下一步实验，弃去96孔中的旧培养基，用pbs将细胞清洗2次。用0.1％trypsin-dmem孵育液将重组病毒rdhn3mf-ha或rdhn3mf-ha-2p按顺序做倍比稀释，稀释梯度为10-1～10-10。将不同稀释度的病毒液分别以100μl感染细胞，做好标记，每个稀释度做三个平行。5d～7d后在倒置显微镜下观察病变，为减少误差，病毒样品重复测三次。使用reed-muench法计算tcid50。
[0184]
(3)重组病毒的eid50测定
[0185]
将重组毒株rdhn3mf-ha或rdhn3mf-ha-2p尿囊液用生理盐水按顺序作10倍倍比稀释，稀释梯度为10-1～10-10，将10-5～10-10五个稀释梯度分别接种5枚9日～11日龄的spf鸡胚，每枚接种100μl，置于37℃恒温培养箱。观察24h内的死胚并弃去；每日早中晚照胚三次，及时冻存死胚，连续观察7d。经过7d后未死的胚在4℃冰箱静置4h以上收取尿囊液测定ha，阳性为感染，使用reed-muench的方法计算鸡胚半数感染量eid50。
[0186][0187]
四.结论
[0188]
我们将h9n2亚型禽流感ha基因在ha茎端c环上第403位异亮氨酸、411位缬氨酸均突变为脯氨酸，再分别将突变前后的ha基因通过dna重组的方法插进新城疫基因vii型dhn3mf弱毒株的m和p基因之间，分别构建了感染性cdna克隆pbr322-dhn3mf-ha与pbr322-dhn3mf-ha-2p质粒。将二质粒分别与pxj40-np，pxj40-p，pxj40-l和pxj40-de3质粒混合，共转染bhk-21细胞，成功获得两株稳定的能有效表达h9n2亚型禽流感ha基因和ndv抗原蛋白的重组病毒rdhnmf-ha与rdhnmf-ha-2p。根据wb结果显示，ha基因经双脯氨酸突变后的表达效率比未突变前的ha基因表达效率更高。经测定，插入外源基因后的重组新城疫病毒的生物学特性与亲本毒差异性小。该重组病毒有望进一步开发成抗禽流感病毒和抗新城疫病毒的二联疫苗，为控制禽流感病毒和新城疫病毒感染提供新的防御手段。
技术特征：1.一种重组质粒的制备方法，其特征在于，将f1片段、f2片段、ha片段或ha-2p片段、f4片段同源重组得到重组质粒；f1片段、f2片段、ha片段、ha-2p片段、f4片段分别如序列表seq id no：1～5所示。2.根据权利要求1所述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法，其特征在于，采用重组试剂盒按照以下组分在37℃反应30分钟即可，加入：f1片段30ng；f2片段97ng；ha片段或ha-2p片段30ng；f4片段200ng；5xce multis buffer 4μl；exnase multis 2μl；加入ddh2o至20μl。3.根据权利要求1所述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法，其特征在于，f1片段的制备方法为：以pbr322-fdhn3载体为模板用分别用引物fdhn3-f1、fdhn3-smai-r1扩增得到f1片段；引物fdhn3-f1、fdhn3-smai-r1分别如序列表seq id no：6～7所示。4.根据权利要求1所述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法，其特征在于，所述f2片段的制备方法为：以pbr322-fdhn3载体为模板用分别用引物fdhn3-smai-f2、fdhn3-r2扩增得到f2片段；引物fdhn3-smai-f2、fdhn3-r2分别如序列表seq id no：8～9所示。5.根据权利要求1所述的重组质粒br322-dhn3mf-ha的制备方法，其特征在于，所述ha片段的制备方法为：以pxj40flag-ha载体为模板用引物ha-f、ha-r扩增得到的ha片段；所述ha-2p片段的制备方法为：以pxj40flag-ha-2p载体为模板用引物ha-f、ha-r扩增得到的ha-2p片段；所述pxj40flag-ha-2p载体的制备方法为：以pxj40flag-ha质粒为载体，根据试剂盒mut express ii fast mutagenesis kit v2说明书，用引物mutate-f、mutate-r反向扩增pcr片段；经dpn i酶切消化后，将消化产物进行体外环化；将环化质粒进行转化，挑取单克隆菌对ha片段进行测序；选取测序正确的菌落进行扩繁，抽提质粒得到pxj40flag-ha-2p载体；所述ha-f、ha-r分别如序列表seq id no：10～11所示；所述引物mutate-f、mutate-r分别如序列表seq id no：12～13所示。6.一种重组病毒，其特征在于，按照如权利要求1-5任一所述方法制备得到的质粒转染bhk-21细胞，得到病毒rdhn3mf-ha或病毒rdhn3mf-ha-2p。
技术总结本发明属于生物领域，公开了一种重组质粒的制备方法，将F1片段、F2片段、HA片段或HA-2P片段、F4片段同源重组得到重组质粒。通过将H9N2亚型禽流感的血凝素蛋白HA茎端C环上第403位异亮氨酸、第411位缬氨酸均突变为脯氨酸，并分别将突变前后的HA基因插在rDHN3-mF病毒基因组的P基因和M基因之间的非编码区，获得了两株能稳定表达H9N2AIV的HA蛋白的新城疫基因VII型减毒株重组病毒rDHN3mF-HA-2P，经WB验证表明双脯氨酸突变后的HA基因与原HA基因相比，其表达效率更高。该重组病毒有望进一步开发成抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗。苗。苗。
技术研发人员：陈瑞爱 谢文婷 徐婷
受保护的技术使用者：华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司
技术研发日：2022.04.07
技术公布日：2022/7/5
