1.本发明涉及一种离心式水凝胶液滴的制备方法，属于生物医学工程、合成生物学与微流控技术交叉领域。
背景技术：2.传统静态细胞培养往往在二维培养皿中进行，并接触玻璃或塑料的培养皿表面。这样的方式会影响细胞中基因的表达且无法持续生长及分化。相较之，三维细胞培养往往能够保持细胞的分化特性，在组织芯片、类器官模型、肿瘤研究及药物研发等方面有着广阔的应用前景。采用水凝胶液滴负载细胞是三维细胞培养的一种重要技术手段。负载细胞的水凝胶液滴的生产成本、便捷性、可重复性等直接关系到使用该技术的成本与效率。
3.目前，业界普遍使用微流控技术制备负载细胞的水凝胶液滴，该法需使用价格高昂的微流控仪器以及复杂的芯片制备工艺，且具有易堵塞、管道灭菌困难（无法一次性使用）和通量低等缺点。目前已有中国专利文献cn110302726a公开了一种基于微流控的负载细胞水凝胶微珠制备装置及方法，该申请结合了微流控技术制备水凝胶微珠；cn 112409553a 公开了一种微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法；cn 109851711a公开了一种应用于单细胞检测中的可溶性水凝胶微球及其制备方法，该法采用液滴微反应器制备微球。上述专利文献均需使用微流控技术，除非对液滴的数量要求较低，难于满足作为类组织的生物材料应用于药物筛选和3d打印等领域中。
4.综上，目前常用的制备工艺与微流控相关，在通量、成本、简便性等方面均略有欠缺。另外，两相混合法制备的水凝胶会使用具有毒副作用的乳化剂、交联剂等，制备的水凝胶液滴均一性和安全性没有充分保证。
技术实现要素：5.为了克服现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种离心式水凝胶液滴的制备方法。
6.一种离心式水凝胶液滴的制备方法，步骤如下：1）配制水凝胶选取一种或多种生物大分子物质配制成具有粘度的水凝胶；2）制备水凝胶液滴在由含1~20% （v/v）em 180的棕榈酸异丙酯组成的油相系统中，将步骤2）制备的水凝胶经离心剪切生成水凝胶液滴。
7.另一种实施方式，在步骤2）水凝胶中混合消化游离的细胞，经离心剪切生成负载细胞的水凝胶液滴。
8.步骤1）中，所述的生物大分子物质具有对环境响应的凝胶性能，包括gelma、海藻酸钠、琼脂糖。
9.步骤2）中，所述的细胞来自：采用2d方式培养备选细胞，经离心收集细胞并酶解得
单分散的细胞。
10.步骤3）中，所述的油相系统采用em180/棕榈酸异丙酯，两者按体积比1~20：99~80混合组成油相。
11.所述的制备方法，结合生物胶浓度，通过调节离心力，改变生物胶通过毛细管时的速度，使得所述水凝胶液滴尺寸可调。
12.本发明的有益效果：本发明提供一种基于离心的水凝胶液滴的方法并证明其可用于细胞3d培养。与传统技术相比，具有成本低、工艺简便、高通量和高重复性等优点，为组织工程、细胞3d打印、肿瘤研究及药物开发等提供新制备方法。负载细胞的液滴本身可作为生物墨水3d打印形成类组织器官，同时体积较小，大大降低了样品与试剂的消耗，可作为理想的药物筛选模型。
13.该方法能在不使用昂贵仪器设备的情况下，只使用常见的离心机即可实现水凝胶液滴的量产（每次生成近万个，且产量可调），同时使用一次性耗材可满足无菌要求。目前所使用的耗材均为离心管、枪头、毛细管等常规耗材，易于工业量产定制，成本低。
附图说明
14.图1是水凝胶液滴发生装置的结构示意图；图中，水凝胶1、卡扣2、pmds3、枪头4、毛细管5、油相6。
15.图2是水凝胶液滴的光学显微图（100倍，四个不同视野）。
16.图3.1是带绿色荧光蛋白（gfp）前列腺癌细胞pc3的光学显微成像（100倍）。
17.图3.2是带绿色荧光蛋白（gfp）前列腺癌细胞pc3的光学显微成像（400倍）。
18.图3.3是带绿色荧光蛋白（gfp）前列腺癌细胞pc3的一种荧光显微成像（40倍）。
19.图3.4是带绿色荧光蛋白（gfp）前列腺癌细胞pc3在水凝胶液滴中的荧光显微成像（40倍）。
20.图4.1是带绿色荧光蛋白（gfp）人肾上皮细胞293t的光学显微成像（100倍）。
21.图4.2是带绿色荧光蛋白（gfp）人肾上皮细胞293t的光学显微成像（400倍）。
22.图4.3是带绿色荧光蛋白（gfp）人肾上皮细胞293t的一种荧光显微成像（40倍）。
23.图4.4是带绿色荧光蛋白（gfp）人肾上皮细胞293t在水凝胶液滴中的荧光显微成像（40倍）。
具体实施方式
24.以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
25.实施例1制备水凝胶液滴一种离心式水凝胶液滴的制备方法，进行如下步骤：1）配制水凝胶及油相从gelma、海藻酸钠、琼脂糖选取一种或两种以上的生物大分子化合物复合配制成相应质量分数（或粘度）的水凝胶；将em180乳化剂与棕榈酸异丙酯按体积分别取1~20份：99~80份进行混合，获得具有一定表面张力与粘度的油相。
26.2）制备水凝胶液滴
图1所示，采用pdms3将毛细管5（直径大于30微米）置于200μl枪头4中，并通过卡扣2将带毛细管的枪头固定在15ml离心管的中心位置。离心管内装有5~10ml步骤1）配制油相6，并作为收集水凝胶液滴的容器，避免液滴被甩到离心管壁，同时实现对液滴的缓冲。取步骤1）配制的50~100500μl水凝胶1溶液于枪头中，100~3000rcf离心1~5min即得水凝胶液滴，将收集的水凝胶液滴转移至光学显微镜下观察，可见大小约300μm的水凝胶液滴（图2）。结合不同的生物胶浓度与离心力，使得水凝胶液滴尺寸可调。
27.实施例2制备载细胞的水凝胶液滴将2d方式培养的备选细胞，经离心收集细胞并酶解得单分散的细胞（图3.1-3.3，图4.1-4.3），配制不同数目的细胞溶液。取实施例1中步骤1）配制的水凝胶，按每1.0ml水凝胶中含有10~1000个细胞数添加其中，混匀后取50~500μl样品添加于离心装置的枪头中，37℃保温1~5min，100~3000rcf离心1~5min产生负载细胞的水凝胶液，其中含有细胞的水凝胶液滴可在荧光光学显微镜下鉴定出来（图3.4和图4.4）。使用带gfp的细胞可以更好地说明细胞被包在水凝胶液滴中。
28.上述离心式制备负载活细胞水凝胶液滴的方法简便易行，对操作人员的要求不高，可在一般实验室实现。
29.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于此，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
技术特征：1.一种离心式水凝胶液滴的制备方法，其特征是，步骤如下：1）配制水凝胶选取一种或多种生物大分子物质配制成具有粘度的水凝胶；2）制备水凝胶液滴在由含1~20% （v/v）em 180的棕榈酸异丙酯组成的油相系统中，将步骤2）制备的水凝胶经离心剪切生成水凝胶液滴。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，在步骤2）水凝胶中混合消化游离的细胞，经离心剪切生成负载细胞的水凝胶液滴。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤1）中，所述的生物大分子物质具有对环境响应的凝胶性能，包括gelma、海藻酸钠、琼脂糖。4.根据权利要求２所述的制备方法，其特征是，步骤2）中，所述的细胞来自：采用2d方式培养备选细胞，经离心收集细胞并酶解得单分散的细胞。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤3）中，所述的油相系统采用em 180/棕榈酸异丙酯，两者按体积比1~20：99~80混合组成油相。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，结合生物胶浓度，通过调节离心力，改变生物胶通过毛细管时的速度，使得所述水凝胶液滴尺寸可调。
技术总结本发明公开了一种离心式水凝胶液滴的制备方法，步骤如下：1）配制水凝胶，选取一种或多种生物大分子物质配制成具有粘度的水凝胶；2）制备水凝胶液滴，在由含1~20%（v/v）EM 180的棕榈酸异丙酯组成的油相系统中，将步骤2）制备的水凝胶经离心剪切生成水凝胶液滴。另一种实施方式，在步骤2）水凝胶中混合消化游离的细胞，经离心剪切生成负载细胞的水凝胶液滴。本发明证明其可用于细胞3D培养，与传统技术相比，具有成本低、工艺简便、高通量和高重复性等优点，为组织工程、细胞3D打印、肿瘤研究及药物开发等提供新制备方法。等提供新制备方法。等提供新制备方法。
技术研发人员：唐伟敏 何赛灵 程潇羽 吴咏芳
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2022/7/5
