1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产褐灰色链霉菌及其应用。
背景技术：2.化学农药防治病害仍是当前一种有效措施，但随着化学农药的大量使用，已 造成环境污染、农药残留、病菌抗药性增强、农业成本增加等系列问题，影响农 业可持续、健康发展。随着人民对生活水平的日益提高，以活体微生物及所产生 的代谢产物为主的绿色防控技术日益受到各国家、科研工作者的重视，已成为无 公害食品、绿色食品生产领域研究的热点。
3.链霉菌属于放线菌中一种重要的微生物资源，被称为药物合成的天然细胞厂， 能产生丰富的、具有生物活性的天然次级代谢产物。目前应用的抗生素约三分之 二由该属产生。天然代谢产物除应用于抗生素外，还包括抗肿瘤剂、杀虫剂、酶 抑制剂、色素及酶类等，在农业、医疗、食品、化工、环保等领域具有重要意义。 国内外已报道的有链霉菌所产生的次级代谢产物及其功能的有：一株浑圆链霉菌 能产生一种具有广谱杀菌活性的水溶性化合物，对耐加氧西林金黄色葡萄球菌有 抑制作用；链霉菌vitstk7通过乙酸乙酯萃取得到的次级代谢产物，能抑制烟 曲霉菌，可作为抗真菌药物的良好选择；arasu等从链霉菌ap-123次级代谢产 物中得到一种对棉铃虫、斜纹夜盗虫幼虫具有杀灭和抑制作用的聚酮类化合物； qin等从麻风树中分离到具有产生铁载体、吲哚乙酸、溶磷等能力的内生放线菌， 能提供幼苗的株高、根长和鲜重；陈倩倩等从烟草根际土壤中发现一株对烟草疫 霉、瓜果腐霉和尖孢镰刀菌具有较强抑制作用的金黄垂直链霉菌。
4.目尚未发现产褐灰色链霉菌(streptomyces phaeogriseichromatogenes)对病原 真菌、细菌以及对作物促生作用的报道，也未见该菌株产次级代谢产物潜力的功 能预测和分析。本发明从草莓炭疽病菌分离中获得对草莓炭疽病菌具强烈抑制作 用的链霉菌jktj-3，继而发现该菌株对多种病原真菌、细菌具有抑菌作用，具 有产生吲哚乙酸、嗜铁素、溶磷、降解木质素等促生功能，有效防治莴苣菌核病、 西瓜猝倒病；并进一步预测该菌株产次生代谢产物的潜力，发现5种新的次生代 谢产物合成基因簇，可成为研制微生物农药、微生物肥料的良好菌源，指导抗生 素的制备。
技术实现要素：5.为了克服现有技术的不足，本发明提供了一株产褐灰色链霉菌(streptomycesphaeogriseichromatogenes)及其在抑制多种病害真菌、细菌以及促进植物生长中 的应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.申请人开展生防菌筛选中获得一株对草莓炭疽病菌具有很强抑菌能力的放 线菌，抑菌谱广，通过形态学特点及16s rrna基因测序分析，该菌株鉴定为产 褐灰色链霉菌(streptomyces phaeogriseichromatogenes)，命名为产褐灰色链霉菌 jktj-3，已于2021
年10月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北武汉 市武昌区珞珈山武汉大学)，保藏号为cctcc no：m 20211271。
8.产褐灰色链霉菌jktj-3在抑制病原真菌和细菌中的应用：所述的病原真菌 包括炭疽菌、黑胫茎点霉、灰葡萄孢、瓜类球腔菌、腐霉菌、轮枝菌、核盘菌、 天门冬茎点霉菌、拟茎点霉、丝核菌、镰刀菌；所述的病原细菌为甘蓝黑腐黄单 孢杆菌。
9.产褐灰色链霉菌jktj-3或其发酵液在防治植物病害中的应用，所述的植物 病害包括莴苣菌核病、西瓜猝倒病。
10.产褐灰色链霉菌jktj-3具有溶解有机磷和无机磷、产嗜铁素、降解木质素、 产吲哚乙酸的能力，还对植物(草莓、甘蓝、西瓜、黄瓜、玉米)具有促生作用， 具体表现为有助于植株幼苗根系/根坨形成，提高株高、茎粗、生物量、叶面积、 根系活力以及叶绿素等。
11.与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
12.1、与常规的化学农药相比，本发明可以减少或替代化学农药防治植物病害， 对人畜安全、高效环保的特点。
13.2、与现有的肥料相比，本发明提供的产褐灰色链霉菌(streptomycesphaeogriseichromatogenes)jktj-3具有溶磷、降解木质素、产吲哚乙酸等功能， 提高作物对养分的吸收，促进作物生长，实现减肥效果。
14.3、首次报道了产褐灰色链霉菌(streptomyces phaeogriseichromatogenes) jktj-3在防病促生中的应用潜力，为微生物药物、微生物菌肥的研制提供了新菌 源。
15.4、首次预测了产褐灰色链霉菌(streptomyces phaeogriseichromatogenes) jktj-3产新的次级代谢产物能力，对新天然产物的发现具有指导作用。
附图说明
16.图1为产褐灰色链霉菌jktj-3的菌落形态。
17.图2为产褐灰色链霉菌jktj-3显微形态。左图为jktj-3气生菌丝及孢子链形 态，右图为孢子形态。
18.图3为产褐灰色链霉菌jktj-3培养物及发酵产物对草莓炭疽病菌菌丝的抑制 作用。
19.图4为产褐灰色链霉菌jktj-3对病原真菌的抑制作用。
20.图5为产褐灰色链霉菌jktj-3对甘蓝黑腐黄单孢菌的抑制作用。
21.图6为产褐灰色链霉菌jktj-3具有解磷、降解木质素、产嗜铁素特性。a为 蒙金娜有机磷培养基，b为蒙金娜无机磷培养基，c为cas培养基，d为苯胺蓝
ꢀ‑
pda培养基。
22.图7为产褐灰色链霉菌jktj-3产吲哚乙酸的特性。
23.图8为产褐灰色链霉菌jktj-3麦粒培养物产挥发性气体对草莓组培苗的促生 作用。
24.图9为产褐灰色链霉菌jktj-3麦粒培养物对甘蓝幼苗的促生作用。
25.图10为产褐灰色链霉菌jktj-3发酵液对玉米幼苗的促生作用。
26.图11为产褐灰色链霉菌jktj-3发酵物对莴苣菌核病菌离体叶片防治效果。
27.图12为产褐灰色链霉菌jktj-3发酵物对西瓜腐霉型猝倒病的防治效果。
28.图13为产褐灰色链霉菌jktj-3的新萜类合成酶类型合成基因簇预测。
29.图14为产褐灰色链霉菌jktj-3的新ripp-like合成酶类型合成基因簇预测。
30.图15为产褐灰色链霉菌jktj-3的新lanthipeptide的合成基因簇预测。
31.图16为产褐灰色链霉菌jktj-3的新lanthipeptide-class-iii的合成基因簇预测。
具体实施方式
32.实施例1：产褐灰色链霉菌jktj-3的分离和鉴定
33.1、2021年1月在开展草莓炭疽病菌分离及其生防菌筛选中，发现一株被污 染的、对草莓炭疽病菌具强抑制作用的链霉菌。挑取孢子加入到无菌水中，进行10倍稀释后涂平板，最终获得纯培养物，编号为jktj-3。如图1所示，在isp-2 平板上获得纯化的产黄色水溶性色素的链霉菌，气生孢子块颜色从灰白色到灰褐 色，基质菌丝为黄色到黄褐色。在高氏一号培养上产黄色水溶性色素，气生孢子 块少或无，基质菌丝黄色。生长温度范围为12℃-45℃，适宜温度为24℃-40℃， 适宜ph是4.5-7。通过扫描电镜显微观察，jktj-3的气生菌丝、孢子链及孢子 如图2所示。
34.2、测定菌株jktj-3的生理生化指标，结果如表1所述。
35.表1菌株jkyj-3生理生化特性
[0036][0037]
+：阳性反应；-：阴性反应；w:弱阳性反应
[0038]
3、对菌株jktj-3的16s rrna基因进行了pcr扩增并测序，使用t载 体试剂盒将得到的dna片段与t载相连，筛选阳性克隆子，送生工生物公 司进行序列测序，序列如seq id no:1所示。根据引物截选出目的片段，在 ezbiocloud中进行序列相似性比对得到结果，菌株jktj-3与产褐灰色链霉菌 (streptomyces phaeogriseichromatogenes)有99.4％的相似性。根据形态观测、 生理生化测定结果并结合16s rrna基因测序和序列比对分析结果，将菌株 jktj-3鉴定为产褐灰色链霉菌(streptomyces phaeogriseichromatogenes)。申请 人已于2021年10月14日交由中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名 为产褐灰色链霉菌(streptomyces phaeogriseichromatogenes)，保藏编号为 cctcc no:m 20211271。
[0039]
实施例2：产褐灰色链霉菌jktj-3培养物及发酵产物的制备
[0040]
(1)平板菌种：pda培养基(新鲜去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉 13g，自来水1000ml)。在pda平板划线培养产褐灰色链霉菌jktj-3，28℃下 培养7d产孢，制成一级种子。
每个皿用10ml无菌水刮洗孢子，用无菌水配置 108cfu/ml的孢子液。
[0041]
(2)麦粒培养物：将麦粒用清水浸泡过夜，弃去浸泡液后加自来水将麦粒 煮炸，过滤微晾后装入三角瓶，121℃下灭菌60min。取1ml 108cfu/ml的孢 子液接至麦粒培养基，28℃下培养10-15d，即得jktj-3麦粒培养物。
[0042]
(3)液体发酵产物：pdb液体培养基(新鲜去皮土豆200g，葡萄糖20g， 自来水1000ml)。每100ml液体培养基接种1ml 108cfu/ml的孢子液，28℃下 以220rpm摇培4d，制备成含菌发酵液。将带菌发酵液用滤纸过滤，再用细菌 过滤器(直径＝45μm)过滤制备成无菌发酵液。即得两种液体发酵产物。
[0043]
(4)发酵产物粗提物：将无菌发酵液与乙酸乙酯等体积混合萃取，静置直 至水相与有机相完全分层后过滤，保留有机相，旋转蒸发(50℃)至干燥，干物 质用少量甲醇溶出。即得发酵物粗提物。
[0044]
实施例3：产褐灰色链霉菌jktj-3培养物及发酵产物对草莓炭疽病菌的抑菌效 果
[0045]
用直径为8mm的打孔器取草莓炭疽病菌菌丝块，将其放置于pda平板中心， 同时在距菌丝块3cm处划线培养产褐灰色链霉菌jktj-3，重复5次。28℃培养，6d后测量抑菌大小。
[0046]
距pda平板中心2.5cm处等距离打孔3个，每个孔内分别加入100μl的无 菌发酵产物和发酵产物粗提物，平板中心接直径为8mm的草莓炭疽病菌菌丝块， 28℃培养，6d后测量抑菌大小。
[0047]
结果见图3，产褐灰色链霉菌jktj-3的培养物及发酵产物对草莓炭疽病菌 具有非常强的抑制效果。
[0048]
实施例4：产褐灰色链霉菌jktj-3培养物对多种病原真菌的抑菌效果
[0049]
用直径为8mm的打孔器取黑胫茎点霉、灰葡萄孢、瓜类球腔菌(甜瓜)、腐 霉菌、轮枝菌、核盘菌(辣椒)、炭疽菌(辣椒)、天门冬茎点霉菌、拟茎点霉、 丝核菌、瓜类球腔菌(西瓜)、镰刀菌菌落边缘菌丝块，将其置放于pda平板 圆心，在平板上距菌丝块3cm处划线培养产褐灰色链霉菌jktj-3。28℃培养， 6d后测量抑菌宽度，结果见表2、图4。由表2和图4可知，产褐灰色链霉菌jktj-3 抑菌谱广，抑菌效果强。
[0050]
表2产褐灰色链霉菌jktj-3对植物病原真菌的抑菌宽度
[0051]
病原菌抑菌宽度(mm)病原菌抑菌宽度(mm)黑胫茎点霉21.5炭疽菌(辣椒)18.5灰葡萄孢11天门冬茎点霉菌16.5瓜类球腔菌(甜瓜)18拟茎点霉15.2腐霉菌23.2丝核菌21轮枝菌19瓜类球腔菌(西瓜)15核盘菌(辣椒)17.8镰刀菌12.1
[0052]
实施例5：产褐灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液对甘蓝黑腐黄单孢杆菌的抑菌效 果
[0053]
在pda平板上用无菌三角刮铲均匀涂布200μl浓度为108cfu/ml的甘蓝黑 腐黄单孢杆菌液，然后距pda平板中心2.5cm处等距离打孔3个，每个孔内加 入100μl的无菌发酵液，28℃培养，3d后测量抑菌大小。结果如图5，可见产褐 灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液对甘蓝黑腐黄单孢杆菌的具有强烈的抑菌效果。
[0054]
实施例6：产褐灰色链霉菌jktj-3具有解磷、降解木质素、产嗜铁素及吲哚乙 酸的
特性
[0055]
将产褐灰色链霉菌jktj-3分别点接至蒙金娜有机磷、无机磷培养基上，置 于28℃培养7d，观察菌落边缘是否有无透明圈判断是否具有解磷的能力。点接 种于通用cas检测平板上，28℃暗培养2-7d，根据菌株是否在平板上产生明 显的橙黄色的铁载体螯合圈，判断菌株是否具有产铁载体的能力。点接种于通用 苯胺蓝-pda平板上，28℃暗培养2-7d，根据菌落边缘蓝色是否褪去，判断菌 株是否具分解木质素的能力。如图6所示，产褐灰色链霉菌jktj-3具有解磷功 能(图6-a、b)、产生嗜铁素(图6-c)和降解木质素(图6-d)的能力。
[0056]
取1ml浓度为108cfu/ml的产褐灰色链霉菌jktj-3孢子液接种于pdb液 体培养基，28℃下220rpm摇床培养24h后，将发酵液在4000rpm离心10min 后取100μl上清，加入等体积的salkowski比色剂，迅速暗置30min后，观察 是否具有显色反应，如果显示红色则初步判断具有产吲哚乙酸(iaa)能力。在 pdb培养基(加入200mg/l的l-色氨酸)中进行220rpm 28℃震荡培养4d。取 1ml的jktj-3发酵液在4000rpm离心10min后取上清，加入等体积的salkowski 比色剂，迅速暗置30min后在od530处测得样品的吸光度。根据标准曲线，确 定该菌株iaa产量。如图7、表3所示，产褐灰色链霉菌jktj-3能产生吲哚乙 酸。
[0057]
表3 jktj-3发酵液中iaa含量
[0058]
处理iaa含量jktj-3(无色氨酸)12.66mg/ljktj-3(含200mg/l色氨酸)317.45mg/l
[0059]
实施例7：产褐灰色链霉菌jktj-3培养物产挥发性气体对草莓组培苗的促生作 用
[0060]
将灭菌的麦粒放入无菌的去盖1.5ml离心管中，接种50μl的浓度为10
8 cfu/ml的产褐灰色链霉菌jktj-3孢子液，放入草莓组培瓶中，用封口膜严密封 闭组培瓶盖子，防止瓶内气体挥发出来。培养30d后测量草莓组培苗鲜重、根 数和根系活力。结果见表4和图8，jktj-3麦粒培养物产挥发性气体对草莓组培 苗具有促生作用。
[0061]
表4 jktj-3培养物产挥发性气体对草莓组培苗的促生作用
[0062]
处理鲜重/g根数/个根系活力/ug/(g
·
h)jktj-32.12
±
0.1117.0
±
2.245.09
±
1.21ck1.45
±
0.2112.2
±
1.920.00
±
0.97
[0063]
实施例8：产褐灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液对黄瓜穴盘幼苗的促生作用
[0064]
将产褐灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液分别用无菌水稀释30倍，按体积比1:20 与育苗基质混合备用。黄瓜种子用1％甲醛消毒后，播种于50孔穴盘。每个处理 重复5次，每个重复为一个穴盘。一个月后每重复随机选取7株，测定株高、茎 粗、鲜重及干重，同时分别采用ttc法、分光光度计法测定根系活力和叶绿素 含量。
[0065]
由表5、表6可知，jktj-3发酵液处理基质后进行黄瓜育苗，黄瓜幼苗的茎 粗、鲜重、干重、根冠比、壮苗指数、叶面积、根长、根体积、叶绿素和根系活 力均高于对照，可见产褐灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液对黄瓜穴盘幼苗具有良 好的促生作用。
[0066]
表5 jktj-3无菌发酵液处理基质对黄瓜苗形态学指标的影响
[0067][0068]
表6 jktj-3无菌发酵液处理基质对黄瓜苗叶面积、根系及生理指标的影响
[0069][0070]
实施例9：产褐灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液对西瓜穴盘幼苗的促生作用
[0071]
实施例9具体操作同实施例8。由表7可得，jktj-3无菌发酵液处理基质后 进行西瓜育苗，西瓜幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重、根冠比、壮苗指数均高于 对照，可见产褐灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液对西瓜穴盘幼苗具有良好的促生 作用。
[0072]
表7 jktj-3无菌发酵液处理基质对西瓜苗形态学指标的作用
[0073][0074]
实施例10：产褐灰色链霉菌jktj-3麦粒培养物对甘蓝育苗的促生作用
[0075]
按每立方基质加入50kg jktj-3麦粒培养物，混匀后装入90型花盆内进行 甘蓝育苗。30d后测定指标类同实施例8。由表8和图9可知，甘蓝幼苗的株高、 茎粗、鲜重、干重、壮苗指数均高于对照，可见产褐灰色链霉菌jktj-3麦粒培 养物对甘蓝幼苗具有良好的促生作用。
[0076]
表8 jktj-3麦粒培养物处理基质对甘蓝育苗的促生作用
[0077]
处理株高/cm茎粗/mm地上鲜重/g地下鲜重/g地上干重/g地下干重/g总干重/g壮苗指数jktj-34.199.0417.492.662.090.272.360.39ck3.038.3011.902.081.450.181.630.32
[0078]
实施例11：产褐灰色链霉菌jktj-3含菌发酵液处理基质对玉米育苗的促生作用
[0079]
实施例11具体操作同实施例8。由表9、图10可得，jktj-3含菌发酵液处 理基质后进行玉米育苗，玉米幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重、根冠比、壮苗指 数、叶绿素和根系活力均高于对照，可见产褐灰色链霉菌jktj-3含菌发酵液玉 米穴盘幼苗具有良好的促生作用。
[0080]
表9 jktj-3发酵液处理基质对玉米育苗的促生作用
[0081][0082]
实施例12：产褐灰色链霉菌jktj-3无菌发酵液处对莴苣菌核病菌的防治效果
[0083]
将无菌卫生纸铺于托盘中，并用无菌水打湿。然后取5-6片期的莴苣苗叶片， 清洗吸干后，喷施jktj-3无菌发酵液，置于托盘中。用直径5mm打孔器沿着菌 丝边缘打孔菌核菌菌丝块，挑取菌丝块接种于莴苣叶片中部并偏离主叶脉位置， 含菌丝面紧贴叶片，接种后用无菌卫生纸覆盖叶面底部，用保鲜膜覆盖保湿，放 置于22℃、相对湿度95％的人工气候箱中进行暗培养，3d后测量病斑大小，按 下列公式计算相对防治效果。结果见表10和图11，jktj-3发酵物处对莴苣菌核 病菌离体叶片的相对防效达到83.9％。
[0084][0085]
表10 jktj-3发酵物对莴苣菌核病菌离体叶片的相对防效
[0086][0087][0088]
实施例13：产褐灰色链霉菌jktj-3含菌发酵液对西瓜腐霉型猝倒病的防治效果
[0089]
按每立方米基质添加1kg产褐灰色链霉菌jktj-3含菌发酵液，混匀后装入 90型花盆，再播种1％甲醛消毒的西瓜种子，30℃下覆膜保湿催芽。待种子拱土 后，花盆接种直径为6mm的腐霉菌菌丝块，28℃下继续覆膜保湿，相对湿度控 制95％以上。播种3d后统计出苗数，5-7d后统计病苗数并计算防治效果。由表 11和图12可知，jktj-3含菌发酵液提高了西瓜出苗率和成苗率，西瓜猝倒病防 效达94.7％。
[0090]
表11 jktj-3发酵物对西瓜腐霉型猝倒病的防效
[0091][0092]
实施案例14：产褐灰色链霉菌jktj-3产次级代谢产物分析
[0093]
使用pacbio平台和illumina pe150平台在天津诺禾信息科技有限公司对产 褐灰色链霉菌jktj-3的基因组进行测序，利用antismash数据库查询和预测该 菌株次生代谢物合成基因簇，结果发现了两个新的编码萜类合成酶类型的合成基 因簇，第一个萜类合成酶类型合成基因簇的核心区域大约为19.1kb，第二个约为 21.7kb，预测新萜类次级代谢产物可能在病原菌、害虫、杂草等方面发挥抑制作 用，如图13所示。一个新的类核糖体依赖的合成基因簇(ripp-like)，该ripp-like 合成酶类型合成基因簇的核心区域约为11.3kb，如图14所示；一个新的 lassopeptide类型的合成基因簇，该类型合成基因簇的核心区域大约为21.3kb， 如图15所示；一个新的lanthipeptide-class-iii的合成基因簇，其类型合成基因簇 的核心区域大约为22.7kb，如图16所示。预测后三者新的合成基因簇具受体拮 抗、酶抑制及抗菌活性等一系列系列生物活性。这五个合成基因簇在生物合成基 因簇数据库mibig和ncbi数据库中均未收录。因此该菌株具有用于制备生防 菌剂、植物促生菌的潜力，同时
也提示该菌株可以用来合成抗生素。
技术特征：1.产褐灰色链霉菌(streptomyces phaeogriseichromatogenes)jktj-3，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no﹕m 20211271。2.权利要求1所述的产褐灰色链霉菌jktj-3在抑制病原真菌中的应用，其特征在于，所述的病原真菌包括炭疽菌、黑胫茎点霉、灰葡萄孢、瓜类球腔菌、腐霉菌、轮枝菌、核盘菌、天门冬茎点霉菌、拟茎点霉、丝核菌、镰刀菌。3.权利要求1所述的产褐灰色链霉菌jktj-3在抑制病原细菌中的应用，其特征在于，所述的病原细菌为甘蓝黑腐黄单孢杆菌。4.权利要求1所述的产褐灰色链霉菌jktj-3或其发酵液在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述的植物病害包括莴苣菌核病、西瓜猝倒病。5.权利要求1所述的产褐灰色链霉菌jktj-3或其发酵液在促进植物生长中的应用。
技术总结本发明公开了一株产褐灰色链霉菌（Streptomyces phaeogriseichromatogenes）JKTJ-3及其在植物防病促生中的应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211271。经实验证实，产褐灰色链霉菌JKTJ-3对多种病原真菌具有抑菌能力，兼解磷、产嗜铁素、降解木质素及产吲哚乙酸的特性，具产丰富的次级代谢产物的能力，对多种作物育苗具有促生作用，是开发生物农药和微生物菌剂的优良菌株。的优良菌株。
技术研发人员：葛米红 施先锋 王德欢 祝菊红 梁欢 李爱成 周谟兵 宋奎林 宋晶
受保护的技术使用者：武汉市农业科学院
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/7/5
