一种基于加尾引物设计的sanger测序方法
技术领域
1.本发明涉及基因测序的技术领域，特别是一种基于加尾引物设计的sanger测序方法。
背景技术：2.sanger测序法，又称双脱氧链终止反应，与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代dna测序技术，为人类基因组计划所使用的主要测序方法。其原理是测序反应的核心就是利用ddntp(由于缺少3'-oh基团，不具有与另一个dntp连接形成磷酸二酯键的能力)，这些ddntp可用来中止dna链的延伸。此外，这些ddntp上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
3.sanger测序优势是(1)使用的测序技术准确度高于二三代测序。基因突变可分为碱基置换、颠换、缺失和插入4种，sanger测序法对于任何一种突变都可以准确检测；(2)每个反应可以得到700-1000bp的长序列，序列长度高于二代测序。因此，sanger测序作为基因检测的金标准，广泛应用于的靶基因测序，二代测序和荧光pcr等检测方法的验证。而sanger测序的主要劣势是一个反应只能得到一条序列，测序通量低。工作流程从样本制备到最终数据分析，包括pcr扩增、pcr产物纯化、循环测序反应、测序反应纯化、毛细管电泳和数据分析。其中循环测序反应需要根据不同pcr扩增产物添加低浓度的单向扩增引物，不仅增加了sanger测序的工作量，也增加了引物加错的可能性。
技术实现要素：4.为此，需要提供一种基于加尾引物设计的sanger测序方法，解决现有sanger测序的工作量大，引物可能加错的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种基于加尾引物设计的sanger测序方法，包括如下步骤：
6.(1)根据样本dna选择特异性引物序列，之后在特异性引物序列的5’端加上通用引物序列得到加尾引物序列，最后根据加尾引物序列合成加尾引物；
7.(2)使用加尾引物配制pcr扩增反应液，之后加入样本dna得到pcr扩增反应体系，之后执行pcr扩增程序，得到pcr扩增产物；
8.(3)使用虾碱酶与外切酶配置成消化液，pcr扩增产物离心后，将消化液加入pcr反应液中进行，反应得到纯化的pcr扩增产物；
9.(4)选择正向或反向通用引物作为测序引物,对纯化的pcr扩增产物进行循环测序反应；
10.(5)循环测序反应产物经过纯化、变性、上机测序得到样本dna的序列。
11.上述技术方案具有以下有益效果：
12.(1)通过在pcr扩增特异性引物的5’端添加通用序列，经pcr扩增之后，使用通用序列的引物进行循环测序反应，实现不同pcr扩增产物使用相同的引物进行循环测序反应。不
仅可以节省sanger测序的工作量，也降低引物加错的可能性，适用于同时对多个pcr扩增产物进行sanger测序。对于外送一代测序服务的，也无需另外准备测序引物(2)使用通用序列的引物进行循环测序反应，可以减少稀释低浓度的测序引物工作量，不仅避免引物稀释的误差，影响测序的稳定性，同时节省了引物的用量，降低成本；(3)sanger测序由于残存的染料单体干扰和毛细管电泳开始阶段电压不稳定，导致测序开始的25-50bp的碱基识别不准确。本发明中所用测序引物是特异性引物的上游测序通用序列，测序先识别序列已知的特异性引物序列，再识别扩增的目的序列，可以在有限的引物设计范围内，获取更长的序列信息。
附图说明
13.图1为本发明pcr扩增和循环测试过程的原理流程，其中，gsp-f为特异性正向引物，up-f为正向通用序列，gsp-r为特异性反向引物，up-r为反向通用序列，
14.图2为实施例2所述mlh1基因启动子甲基化阴性和阳性的sanger测序检测结果。
15.图3为实施例2所述通用引物和特异性引物作为测序引物的sanger测序结果的比较。
具体实施方式
16.为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
17.一种基于加尾引物设计的sanger测序方法，包括如下步骤：
18.(1)根据样本dna选择特异性引物序列，之后在特异性引物序列的5’端加上通用引物序列得到加尾引物序列，最后根据加尾引物序列合成加尾引物；
19.(2)使用加尾引物配制pcr扩增反应液，之后加入样本dna得到pcr扩增反应体系，之后执行pcr扩增程序，得到pcr扩增产物；
20.(3)使用虾碱酶与外切酶配置成消化液，pcr扩增产物离心后，将消化液加入pcr反应液中进行，反应得到纯化的pcr扩增产物；
21.(4)选择正向或反向通用引物作为测序引物,对纯化的pcr扩增产物进行循环测序反应；
22.(5)循环测序反应产物经过纯化、变性、上机测序得到样本dna的序列。
23.pcr扩增和循环测试过程的原理流程如图1所示。
24.进一步，通用引物为是任意常见的通用引物或tm值50-65℃的序列。
25.进一步，通用引物的选择中，以序列m13f：gtaaaacgacggccagt为正向通用引物，序列t7：taatacgactcactataggg为反向通用引物。
26.进一步，特异性引物为pdgfrae12-f2、pdgfrae12-r1、pdgfrae18-f1、pdgfrae18-r1、kite9-f1、kite9-r1、kite11-f2、kite11-r2、kite13-f1、kite13-r1、kite17-f1、kite17-r2、up-f-m13f、up-r-t7、mhl1-bsp1-f2或mhl1-bsp1-r3。
27.上述物特异性引物加入加上通用序列之后的加尾引物序列如下表1。
28.表1加尾引物序列。
[0029][0030][0031]
进一步，每20μl的pcr扩增反应液包括：10.4μl纯化水，5μl、ph7.5的5x pcr缓冲液、4μl、25mm的mgcl2、0.2μl、25mm的dntp、0.1μl、10μm的上游加尾引物、0.1μl、10μm的下游
加尾引物和0.2μl taq酶；
[0032]
每25μl的pcr扩增反应体系包括20μl的pcr扩增反应液和5μl的样本dna。
[0033]
进一步，步骤(2)中加入样本dna的浓度为5ng/μl。
[0034]
进一步，所述pcr扩增程序如下：95℃预变性2min；循环：95℃保持10s，60℃保持30s，72℃保持30s，反应40个循环；4℃保存。
[0035]
进一步，循环测序反应体系，以10μl计包括：2μl bigdye reaction mix，1μl bigdye sequencing buffer，3.2μm、0.5μl测序引物，4.5μl无核酸酶水，2μl纯化pcr扩增产物。
[0036]
进一步，循环测序反应过程如下：95℃预变性2min；循环：95℃保持10s，50℃保持5s，72℃保持90s，反应25个循环；4℃保存。
[0037]
进一步，所述样本dna为但不限于石蜡包埋dna、新鲜组织dna或重亚硫酸盐转化dna样本。
[0038]
为了更进一步了解本发明的发明内容和优势，下面将结合两个具体实施例详细阐述本发明的应用。
[0039]
实施例1
[0040]
本例将本发明的方法应用于胃肠间质瘤的c-kit和pdgfra基因测序，根据《胃肠间质瘤全程化管理中国专家共识(2020版)》推荐对所有完整切除的胃肠间质瘤标本常规进行基因检测，基因检测位点至少应包括c-kit基因第9、11、13和17号外显子以及pdgfra基因第12、18号外显子。c-kit和pdgfra基因突变与分子靶向治疗疗效相关。明确基因突变具体类型对评估肿瘤生物学行为、制定整体治疗策略具有参考价值
[0041]
收集经病理诊断为胃肠间质瘤的临床样本24例，样本经过石蜡包埋后切取5片5～8μm切片作为检测样本。按照本发明方法进行pdgfra和c-kit基因的6个外显子sanger测序。
[0042]
具体步骤如下：
[0043]
一、样品处理和模板提取质控：
[0044]
蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用美基公司石蜡包埋dna提取试剂盒提取基因组dna，具体步骤按试剂盒操作说明。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l,ph 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度。
[0045]
二、pcr扩增反应：
[0046]
pcr扩增反应引物是上述表1中的pdgfra和ckit引物序列，合成后稀释至50μm，并按照下表2，配置pdgfra和c-kit基因的6个外显子测序对应的6管pcr扩增反应体系。其中c-kit基因第9、11、13和17号外显子以及pdgfra基因第12、18号外显子对应的引物组合依次为kite9-f/kite9-r1、kite11-f2/kite11-r2、kite13-f1/kite13-r1、kite17-f1/kite17-r2、pdgfrae12-f2/pdgfrae12-r1和pdgfrae18-f1/pdgfrae18-r1。
[0047]
表2.pcr扩增反应体系。
[0048]
反应液组分(20μl)1人份用量(μl)纯化水10.45x pcrbuffer(ph7.5)5mgcl2(25mm)4dntp(25mm)0.2
上游引物(10μm)0.1下游引物(10μm)0.1taq0.2
[0049]
往6管pcr扩增反应体系中分别加入5μl浓度为5ng/μl的样本dna，离心，按照下表3设置扩增程序，执行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0050]
表3.pcr扩增程序
[0051][0052]
三、pcr产物的纯化：
[0053]
配置消化液,分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。pcr产物离心后，每个孔中加入1μl以上消化液到pcr反应液中。放置于pcr仪进行以下程序反应。反应过程如下表4。
[0054]
表4.纯化反应条件
[0055]
温度时间37℃60min80℃15min4℃forever
[0056]
四、循环测序反应：所用试剂盒为abi terminator v3.1 cycle sequencing kit，根据pcr反应的数量按照下表5和表6配制正向和反向循环测序反应mix。
[0057]
表5.正向循环测序反应液组分
[0058]
反应液组分1人份用量(μl)bigdye reaction mix2bigdye sequencing buffer1up-f-m13f(3.2μm)0.5无核酸酶水4.5
[0059]
表6.反向循环测序反应液组分
[0060][0061][0062]
同一样本的6种不同pcr扩增产物使用同一正向/反向循环测序反应mix。
[0063]
在96孔板中分装8μl以上mix，2μl对应pcr产物(注意封膜后要求压膜),离心。放置于pcr仪进行以下程序反应。
[0064]
表7.循环测序反应
[0065][0066]
五、循环测序反应产物经过纯化，变性和abi 3500xl上机测序。对测序结果进行分析获得该24个样本检测结果，并统计正反向测序结果的一致性，结构如下表8。
[0067]
表8. 24例样本sanger测序c-kit和pdgfra基因检测结果
[0068]
[0069][0070]
从上述结果，可以看出本发明，虽然每例样本需要6个pcr扩增反应，原本要完成这6个外显子的正反向测序，需要使用12条引物，配制12种循环测序反应mix。但是使用通用引物进行正反测序反应仅需2个循环测序反应mix。不仅极大地简化了对多种pcr扩增产物sanger测序操作流程，还避免了pcr产物模板加错的可能性。
[0071]
实施例2
[0072]
本例将本发明的引物设计方案结合sanger测序应用于mlh1基因启动子甲基化检测。mlh1基因编码的蛋白参与dna错配修复，mlh1启动子甲基化常见于结肠直肠癌和子宫内膜癌在内的散发性微卫星不稳定肿瘤，与mlh1蛋白表达的丢失有关。它在lynch综合征(遗传性非息肉性结直肠癌，hnpcc)中很少发现。因此，mlh1启动子甲基化分析可用于区分微卫星高度不稳定性(msi-h)肿瘤中散发性与遗传性的结直肠癌和子宫内膜癌。在子宫内膜癌中，mlh1启动子甲基化表现较高侵袭性，与预后不良相关。
[0073]
本实施例收集经病理诊断为子宫内膜癌且免疫组化检测mlh1蛋白丢失的临床样
本30例，样本经过石蜡包埋后切取5片5～8μm切片作为检测样本。利用上述方法包括以下步骤：
[0074]
一、样品dna提取和：
[0075]
蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用美基公司石蜡包埋dna提取试剂盒提取基因组dna，具体步骤按试剂盒操作说明。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l,ph 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度。再使用epitect fast dna bisulfite kit(qiagen)进行重亚硫酸盐修饰转化，转化后dna根据使用微量分光光度计测定的浓度(ssdna)，用无dnase及rnase的纯化水稀释至5ng/μl，即为待测dna；
[0076]
二、pcr扩增反应：
[0077]
pcr扩增反应引物是上述表1中的mhl1-bsp1-f2和mhl1-bsp1-r3引物，合成后稀释至50μm，并按照下表9配置pcr扩增反应体系。
[0078]
表9.pcr扩增反应体系。
[0079][0080][0081]
往pcr扩增反应体系中加入5μl浓度为5ng/μl转化后dna的样本dna，离心，按照下表10设置扩增程序，执行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0082]
表10.pcr扩增程序
[0083][0084]
三、pcr产物的纯化：配置消化液,分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。pcr产物离心后，每个孔中加入1μl以上消化液到pcr反应液中。放置于pcr仪进行以下程序反应。反应过程如下表11.
[0085]
表11.纯化反应条件
[0086]
温度时间37℃60min80℃15min4℃forever
[0087]
四、循环测序反应：所用试剂盒为abi terminator v3.1 cycle sequencing kit，根据pcr反应的数量按照下表12和13配制通用引物正向循环测序反应mix。
[0088]
表12.正向循环测序反应液组分
[0089]
反应液组分1人份用量(μl)bigdye reaction mix2bigdye sequencing buffer1up-f-m13f(3.2μm)0.5无核酸酶水4.5
[0090]
表13.反向循环测序反应液组分
[0091]
反应液组分1人份用量(μl)bigdye reaction mix2bigdye sequencing buffer1mhl1-bsp1-f2(3.2um)0.5无核酸酶水4.5
[0092]
同一样本的pcr扩增产物分别使用通用引物正向循环测序反应mix和特异性引物正向循环测序反应mix。
[0093]
在96孔板中分装8μl以上mix，2μl对应pcr产物(注意封膜后要求压膜),离心。放置于pcr仪进行以下程序反应。
[0094]
表14.循环测序反应
[0095][0096]
五、循环测序反应产物经过纯化，变性和abi 3500xl上机测序。对测序结果进行分析获得该30例样本检测结果。
[0097]
根据sanger测序结果分析30例样本mlh1基因启动子甲基化情况，如图2所示，如果启动子cpg位点发生甲基化sanger测序结果显示的是c和t的套峰(图2b)，即此样本未被甲基化修饰的部分c已经转化成t，而甲基化阴性的位点基本全部c都被转化成为t(图2a)。在这30例mlh1蛋白丢失的子宫内膜癌临床样本中，检测到21例的mlh1启动子甲基化阳性。说明本反应的引物设计可适用于基于sanger测序的甲基化多位点检测。
[0098]
此外，通过比较本发明中通用引物和特异性引物作为测序引物的sanger测序结
果，如图3所示。测序结果已去除起始阶段碱基判读不准确的序列(约30bp)，图3a为使用特异性引物作为测序引物的结果，图3b为使用通用引物作为测序引物的结果，图中可以看出本发明的引物设计方案可以比特异性引物作为测序引物的常规sanger测序多获取引物扩增范围内30多bp的序列，多覆盖2个甲基化位点。说明本发明的引物设计可以在有限的引物设计范围内，获取更长的序列信息。
[0099]
本发明提供设计一种特异性引物的5’端加上通用引物的加尾引物用于sanger测序，具有以下有益效果：(1)通过在pcr扩增引物的5’端添加通用序列，经pcr扩增之后，使用通用序列的引物进行循环测序反应，实现不同pcr扩增产物使用相同的引物进行循环测序反应。不仅可以节省sanger测序的工作量，也降低引物加错的可能性，适用于同时对多个pcr扩增产物进行sanger测序。对于外送一代测序服务的，也无需另外准备测序引物；(2)使用通用序列的引物进行循环测序反应，可以减少稀释低浓度的测序引物工作量，不仅避免引物稀释的误差，影响测序的稳定性，同时节省了引物的用量，降低成本；(3)sanger测序由于残存的染料单体干扰和毛细管电泳开始阶段电压不稳定，导致测序开始的25-50bp的碱基识别不准确。本发明中所用测序引物是特异性引物的上游测序通用序列，测序先识别序列已知的特异性引物序列，再识别扩增的目的序列。可以在有限的引物设计范围内，获取更长的序列信息。
[0100]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括
……”
或“包含
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
[0101]
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
技术特征：1.一种基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据样本dna选择特异性引物序列，之后在特异性引物序列的5’端加上通用引物序列得到加尾引物序列，最后根据加尾引物序列合成加尾引物；(2)使用加尾引物配制pcr扩增反应液，之后加入样本dna得到pcr扩增反应体系，之后执行pcr扩增程序，得到pcr扩增产物；(3)使用虾碱酶与外切酶配置成消化液，pcr扩增产物离心后，将消化液加入pcr反应液中进行，反应得到纯化的pcr扩增产物；(4)选择正向或反向通用引物作为测序引物,对纯化的pcr扩增产物进行循环测序反应；(5)循环测序反应产物经过纯化、变性、上机测序得到样本dna的序列。2.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，通用引物为是任意常见的通用引物或tm值50-65℃的序列。3.如权利要求2所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，通用引物的选择中，以序列m13f：gtaaaacgacggccagt为正向通用引物，序列t7：taatacgactcactataggg为反向通用引物。4.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，特异性引物为pdgfrae12-f2、pdgfrae12-r1、pdgfrae18-f1、pdgfrae18-r1、kite9-f1、kite9-r1、kite11-f2、kite11-r2、kite13-f1、kite13-r1、kite17-f1、kite17-r2、up-f-m13f、up-r-t7、mhl1-bsp1-f2或mhl1-bsp1-r3。5.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，每20μl的pcr扩增反应液包括：10.4μl纯化水，5μl、ph7.5的5x pcr缓冲液、4μl、25mm的mgcl2、0.2μl、25mm的dntp、0.1μl、10μm的上游加尾引物、0.1μl、10μm的下游加尾引物和0.2μl taq酶；每25μl的pcr扩增反应体系包括20μl的pcr扩增反应液和5μl的样本dna。6.如权利要求5所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，步骤(2)中加入样本dna的浓度为5ng/μl。7.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，所述pcr扩增程序如下：95℃预变性2min；循环：95℃保持10s，60℃保持30s，72℃保持30s，反应40个循环；4℃保存。8.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，循环测序反应体系，以10μl计包括：2μl bigdye reaction mix，1μl bigdye sequencing buffer，3.2μm、0.5μl测序引物，4.5μl无核酸酶水，2μl纯化pcr扩增产物。9.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，循环测序反应过程如下：95℃预变性2min；循环：95℃保持10s，50℃保持5s，72℃保持90s，反应25个循环；4℃保存。10.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的sanger测序方法，其特征在于，所述样本dna为但不限于石蜡包埋dna、新鲜组织dna或重亚硫酸盐转化dna样本。
技术总结本发明涉及基因测序的技术领域，特别是一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法，包括如下步骤：(1)根据样本DNA选择特异性引物序列，之后在特异性引物序列的5’端加上通用引物序列得到加尾引物序列，根据加尾引物序列合成加尾引物；(2)使用加尾引物配制PCR扩增反应液，加入样本DNA，执行PCR扩增程序，得到PCR扩增产物；(3)PCR扩增产物进行纯化；(4)选择通用引物作为测序引物,对纯化的PCR扩增产物进行循环测序反应；(5)循环测序反应产物经过纯化、变性、上机测序得到样本DNA的序列，本发明通过通用序列和特异性序列引物的结合不仅可以节省Sanger测序的工作量，也可以降低引物加错的可能性。能性。能性。
技术研发人员：陈志宏 吴水英 陈琰
受保护的技术使用者：厦门飞朔生物技术有限公司
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/5
