一株短波单胞菌st3cs3及其应用
技术领域
1.本发明属于促生菌生物技术领域，具体涉及一株短波单胞菌及其促进植物生长中的应用。
背景技术：2.随着我国工业化和现代化的发展，耕地面积逐年锐减。自20世纪60年代以来，肥料的使用保障了国家粮食的安全，对我国农业的增产、增收起到了重要的作用。但是，化肥的过量使用不仅会影响农产品品质，还会给农村生态环境造成巨大的压力。近年来，传统常规化肥（如氮、磷、钾复合肥）一直存在着利用率偏低、滥用的问题，由于化肥中一般含有重金属，连年的化肥不合理施用会造成重金属在土壤中的积累，危害土壤结构和人类社会的可持续发展，而盲目减施常规化肥可能会造成减产等一系列负面效应，对常规化肥的合理施用甚至减施已迫在眉睫。
3.植物促生菌（plantgrowth-promoting rhizobacteria，pgpr）是指对作物有益的自生型细菌。促生菌直接促进作物生长的作用指的是某些植物促生菌可合成某些对作物生长发育有直接作用的物质（如生长素等）和（或）改变土壤中某些无效元素的形态，使之有效化进而利于作物吸收（如固氮、解磷等）。促生菌也可以间接作用于某些植物，抑制或减轻某些植物病害对作物生长发育和产量的不良影响。这促使全世界的科学工作者积极探索与开发以微生物为核心的微生物肥料来代替（或代替部分）化肥和农药的使用。
4.微生物肥料以植物促生菌为核心，是一种绿色、环保的新型肥料，具有长效、无毒、无污染、节约能源、成本低等特点，具有促进作物生长、提高作物产量和品质、降低作物产品中硝酸盐含量、提高作物抗病能力、增进土壤肥力、减少化肥使用量、净化环境维持生态平衡等作用。微生物肥料主要是依靠微生物生命活动产生酶和有益物质发挥作用，氮磷钾是植物生长所必须的元素，空气中的氮气、土壤中的无机磷和硅酸盐矿物形式的钾难以被植物直接吸收，微生物产生酶和有益物质可将不能利用的物质转化成可以直接利用的元素；吲哚乙酸（iaa）是一种植物内源生长素，参与植物细胞的生长等多种生理生化过程的调节与控制，微生物所产生的iaa对植物微生态环境有重要的作用。在我国面临能源危机、资源紧缺、环境污染的现状下，微生物肥料对于我国现代农业发展的重要性不言而喻，微生物肥料的发展可以说是我国粮食绿色安全和保障为数不多的耕地环境的重要基石，其是一种真正的无公害的新型肥料，符合我国的可持续发展观念，随着人们对绿色无公害农产品的认识和需求越来越高，微生物化肥必定拥有广阔的应用场景，并在我国的农业可持续发展中起到重要作用。
技术实现要素：5.本发明提供了一种植物内生细菌短波单胞菌st3cs3，分类命名为brevundimonas olei，其于2021年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24140，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研
究所。本发明另一目的是提供上述植物内生细菌短波单胞菌st3cs3的新用途，即将其应用在促进植物生长中，可以用于制备促进植物生长的生物菌剂或微生物肥料，本发明短波单胞菌st3cs3具有固氮和解钾能力，具有较高的解磷和产iaa能力；将该菌株定殖于植物体内，能明显促进植物生长，增加其叶绿素和氮含量，进而减少化肥的使用。
6.为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施：1、采集云南省香格里拉牧场入侵植物瑞香狼毒（stellera chamaejasme l.）的植物样品，于自来水下冲洗干净；2、将植物样品分为地上部分和地下部分分别进行表面消毒，首先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡3~5min，无菌水冲洗3~5次，再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡2~3min，无菌水冲洗3~5次，冲洗完后将其置于无菌滤纸上吸干水分；采用混合稀释平板法进行细菌分离，将表面灭菌的1g植物样品在无菌砂浆中磨成粉末，与9ml无菌水充分混合，混合物梯度稀释后转移到lb培养基上培养，37℃培养10天，隔天观察，见有菌落长出则挑取，分离纯化后获得多株内生细菌菌株，并将内生细菌菌株制成菌悬液；3、将分离得到的内生菌株接种到无机磷培养基上，以水解圈判定菌株的溶磷能力；4、选出溶磷能力较强的菌株保存于lb斜面上备用，并将该细菌菌株命名为st3cs3；5、菌株st3cs3的鉴定st3cs3形态学特征：菌落直径2-3mm，菌落颜色为中间黄边缘白色，不透明，表面湿润、微凸起，边缘整齐；革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，无芽孢；分子鉴定：采用mobio powersoil
® dna试剂盒提取该菌株总dna，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与ncbi上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为短波单胞菌（brevundimonas olei）；该菌株保存和活化所用培养基均为lb培养基。
7.本发明将从瑞香狼毒中分离得到的短波单胞菌st3cs3进行盆栽实验，探讨其对烟草幼苗生长的影响，即进行了短波单胞菌st3cs3接种对盆栽烟草生长的影响研究，为微生物肥料提供细菌菌种和理论研究依据。
8.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的短波单胞菌st3cs3来源于瑞香狼毒，具有固氮、溶磷、解钾和产iaa能力，且能够在植物体中有效定殖，有效溶解植物根际土壤中的难溶钾，提高植物中氮的含量，进而促进植物的生长，减少化肥使用，且培养操作简单，成本低，对环境安全，适用于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
9.图1为短波单胞菌st3cs3在lb培养基上的菌落形态；图2为短波单胞菌st3cs3在无机磷固体培养基上的生长情况；图3为磷标准溶液的标准工作曲线；图4为短波单胞菌st3cs3解磷能力测定结果；图5为短波单胞菌st3cs3固氮能力的测定结果；
图6为短波单胞菌st3cs3解钾能力的测定结果；图7为iaa标准溶液的标准工作曲线；图8为短波单胞菌st3cs3分泌iaa能力的测定结果；图9为短波单胞菌st3cs3对烟草幼苗生长的影响；图10为短波单胞菌st3cs3对烟草幼苗叶片叶绿素含量的影响。
具体实施方式
10.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
11.实施例1：短波单胞菌st3cs3的分离、筛选与鉴定（1）采集云南省香格里拉牧场优势植物瑞香狼毒的植物样品，于自来水下冲洗干净；（2）将植物样品分为地上部分和地下部分分别进行表面消毒，首先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡5min，无菌水冲洗5次，再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡2min，无菌水冲洗4次，冲洗完后将其置于无菌滤纸上吸干水分；采用混合稀释平板法进行细菌分离，将表面灭菌的1g植物样品在无菌砂浆中磨成粉末，与9ml无菌水充分混合，混合物梯度稀释制成10-3
、10-4
、10-5
的稀释液并分别转移到lb培养基（酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂14g、蒸馏水1l，ph 7.0-7.2）上，倒置于生化培养箱中37℃培养10天，隔天观察，见有菌落长出则挑取单菌落，分离纯化后获得多株内生细菌菌株，并将内生细菌菌株分别制成菌悬液；（3）将分离得到的内生菌株接种到无机磷培养基（葡萄糖10g、硫酸氨0.5g、氯化钠0.3g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁0.3g、七水硫酸亚铁0.03g、四水硫酸锰1g、磷酸三钙5g、琼脂14g，蒸馏水1l，ph 7.0-7.5）上，以水解圈判定菌株的溶磷能力； （4）选出溶磷能力最强的菌株保存于lb斜面上备用，并将该细菌菌株命名为st3cs3；（5）菌株st3cs3的鉴定st3cs3形态学特征：菌落直径2-3mm，菌落颜色为中间黄边缘白色，不透明，表面湿润、微凸起，边缘整齐；革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，无芽孢（图1）；分子鉴定：采用mobio powersoil
® dna试剂盒提取该菌株总dna，经检测后送测序公司进行序列测定，测序结果见seq id no:1所示，将测序结果与ncbi上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，其与短波单胞菌（brevundimonas olei）同源性达99%，最终将该菌株鉴定为短波单胞菌（brevundimonas olei）。
12.实施例2：短波单胞菌st3cs3解磷能力的测定溶磷圈：将分离得到的短波单胞菌st3cs3接种到无机磷固体培养基上，每皿4个接菌点，重复三次，30℃恒温培养5天，观察并记录菌株生长情况、溶磷圈（d）和菌落直径（d），d/d越大，表示溶磷能力越强，结果见图2，短波单胞菌st3cs在无机磷培养基上形成了较明显的溶磷圈，溶磷圈直径为0.75cm，菌落直径为0.3cm。
13.溶磷能力：将短波单胞菌st3cs在lb液体培养基中30℃、180rpm摇床培养15h后，以4%接种量接入无机磷液体培养基中，同时以接入同等量的lb液体培养基作为空白对照，每种处理设三个重复，30℃、180rpm在摇床上培养6d；采用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量（分光光度计波长700nm），具体步骤如下：
①
取发酵液10000rpm离心10min，取上清液2.5ml置于50ml容量瓶中，加入2，6-二硝基苯酚指示剂2滴，用10%氢氧化钠或者5%稀硫酸调节ph至溶液刚呈微黄色，加入钼锑抗显色剂5ml后加入去离子水定容至50ml；
②
静置30min后在分光光度计700nm下比色，同时测定空白对照组；
③
实验同时绘制磷标准曲线，分别吸取5μg/ml磷标准溶液0、2、4、6、8、10ml于50ml容量瓶中，加入2，6-二硝基苯酚指示剂2滴，用10%氢氧化钠或者5%稀硫酸调节ph至溶液刚呈微黄色，加入钼锑抗显色剂5ml后加入去离子水定容，获得0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/ml磷标准系列溶液，静置30min后在分光光度计700nm下比色，绘制标准工作曲线（图3），然后将步骤
②
测得的吸光度值代入标准工作曲线，获得短波单胞菌st3cs在无机磷培养液中的溶磷量为51mg/l（图4），说明短波单胞菌st3cs具有将无机磷转化成有机磷的能力，使植物更易吸收磷，进而促进植物生长。
14.实施例3：短波单胞菌st3cs3固氮能力的测定将短波单胞菌st3cs3接种到阿须贝固体培养基（磷酸氢二钠0.2g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、碳酸钙5g、甘露醇10g、硫酸钙0.1g、琼脂14g，蒸馏水1l，ph 7.0）上三区划线，重复三次，30℃恒温培养5天；如果菌株可在培养基上生长，则证明菌株具有固氮能力，反之，则无固氮能力.结果见图5，从图中可以看出短波单胞菌st3cs3可在阿须贝培养基上生长，说明其具有固氮能力，短波单胞菌st3cs3可将空气中的n2转化成有效氮，有助于植物对氮的吸收，进而促进植物生长。
15.实施例4：短波单胞菌st3cs3解钾能力的测定将短波单胞菌st3cs3接种到硅酸盐固体培养基（磷酸氢二钠2g、蔗糖5g、七水硫酸镁0.5g、氯化铁0.005g、碳酸钙0.1g、钾长石粉1g、琼脂14g、蒸馏水1l，ph 7.0-7.5）上，每皿4个接菌点，重复三次，30℃恒温培养5天；若菌株在其上形成解钾圈，则证明其具有解钾能力，反之，则无解钾能力。
16.结果见图6，短波单胞菌st3cs在硅酸盐固体培养基上形成了解钾圈，解钾圈直径为0.45cm，菌落直径为0.35cm，说明短波单胞菌st3cs3可将不溶性钾转化成有效钾，有助于植物对钾的吸收，进而促进植物生长。
17.实施例4：短波单胞菌st3cs3分泌iaa能力的测定短波单胞菌st3cs3在lb液体培养基（含有l-色氨酸0.1mg/ml）中30℃、120rpm的摇床上黑暗培养24h，取1.5ml菌液12000rpm离心10min，去沉淀，取0.5ml上清液添加等量的salkowski's 反应液（1ml 0.5mol/l氯化铁，49ml 35%高氯酸），在黑暗处反应30min，在530nm下测定吸光值，每组重复三次，以不接菌培养基同上处理作为对照调零；浓度0、5.5、11、22、44、88μg/ml的 iaa标准溶液采用上述方法测定吸光度值并绘制标准曲线（图7），然后将接种短波单胞菌的实验组的吸光度值代入标准曲线，获得短波单胞菌st3cs3分泌iaa量为145.6mg/l（图8），短波单胞菌st3cs3以l-色氨酸为前体合成植物激素iaa，刺激植物细
胞生长和增殖，有效吸收水分和养分，同时调节植物体的生命活动。
18.实施例5：短波单胞菌st3cs3对烟草苗的促生实验本实施例旨在证明短波单胞菌st3cs3对植物生长的促进作用；以烟草（nicotiana tabacum l.）为供试植物，实验过程如下：a、烟草无菌苗的准备：随机选择烟草种子（msk326），首先在体积浓度75%的乙醇溶液中浸泡2min、无菌水冲洗4次；然后在有效氯浓度为5%的naclo溶液浸泡1min、用无菌水冲5次，将其置于无菌滤纸上吸干水分，备用；然后将装有加拿大泥炭和珍珠岩（体积比7:3）的托盘进行高压灭菌（121℃，15psi，15min ；3次），再将烟草种子放入托盘中在25℃、相对湿度为60%下萌发，为了保持水分，植物每3天浇蒸馏水一次；b、内生细菌接种剂和灭活剂的制备：将短波单胞菌st3cs3接种于250ml锥形瓶中，于28℃、180rpm 的恒温摇床中培养15h；将菌液分为a、b部分，a部分作为内生细菌接种剂，b部分在121℃、15psi下消毒15min，以杀死内生菌，作为灭活剂；c、盆栽实验：烟草种子栽种30天后，选择20株长势一致的幼苗移植至花盆（10.5
×
8.5cm；1株幼苗/盆）中，每盆含600g田间土与珍珠岩（7:3，v/v）和3g磷酸钙。将花盆随机分为两组（ⅰ组和ⅱ组），每组10盆，然后，将步骤b的内生细菌接种剂和灭活剂分别喷洒在ⅰ组和ⅱ组幼苗的叶表面和根上，每株接种3ml，直至湿润（ⅰ组：e+、st3cs3接种；ⅱ组：e-、st3cs3未接种）。移植后第1天和第9天接种菌液，共接种2次，将苗放在室温下（18-25℃）自然光照培养，培养期间每3天浇一次无菌水，每盆浇灌100ml（以水浇透土壤而又不溢出盆底部为宜），实验过程中密切观察各组烟草苗的生长状况。为了确定细菌在接种植株中的定殖情况，分别在最后一次接种5天后的e+和e-组随机采集3个植株，在自来水下清洗和表面消毒；然后，通过研磨使幼苗均质，稀释后的悬浮液在lb培养基中培养，以检测接种的菌株。从e+植株中重新分离出该菌株，但未能从e-植株中分离出来，证实了短波单胞菌的定殖性。培养25天后，收获植株，测定植株的高度、干重、根长、叶宽、叶长和叶绿素含量，植物和土壤中的氮磷钾含量。
19.结果见表1、表2、图9和10，结果显示短波单胞菌st3cs3对烟草幼苗有明显的促进作用，实验组和对照组中均产生了显著性差异（p《0.01，t检验）。在25天时，与对照相比，株高、叶长、叶宽、地上干重、地下干重、植物氮含量和叶绿素含量分别增加了43.36%，27.63%，25.17%，56.90%，74.84%，20.20%，15.06%；表1 短波单胞菌st3cs3对烟草生物量的影响注：以a为标准，b表示与a产生显著性差异（p《0.01，t检验）；表2短波单胞菌st3cs3对烟草及其土壤中氮、磷、钾含量的影响
注：以a为标准，b表示与a产生显著性差异（p《0.01，t检验）；上述实施例的结果说明本发明中分离获取的短波单胞菌st3cs3具有固氮、溶磷和解钾能力，从而促进植物对氮、磷、钾元素的吸收，其还具有产iaa能力，提供植物激素促进植物生长。盆栽实验验证了接种短波单胞菌st3cs3后可以提高宿主植物生长，可广泛应用于制作微生物肥料中，减少化肥的使用与污染。
技术特征：1.一株短波单胞菌（brevundimonasolei）st3cs3，其是一株分离自瑞香狼毒的植物内生细菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的cgmcc no.24140。2.权利要求1所述的短波单胞菌st3cs3在促进植物生长中的应用，其特征在于：短波单胞菌st3cs3具有解磷、解钾、固氮、产吲哚乙酸的能力。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：短波单胞菌st3cs3用于制备促进植物生长的生物菌剂或肥料。
技术总结本发明公开了一株短波单胞菌（Brevundimonasolei）ST3CS3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24140；该菌株具有固氮和解钾能力，较高的解磷和产吲哚乙酸能力；将菌株定殖于植物体内，能明显促进植物生长，增加其叶绿素和氮含量，进而减少化肥的使用，提高作物产量，在农业生产上具有重要意义。在农业生产上具有重要意义。在农业生产上具有重要意义。
技术研发人员：李海燕 江悦娟 汤雯婷 毛文沁 韩雪 龚伟军
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2022.01.03
技术公布日：2022/7/5
