1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法。
背景技术：2.实时荧光定量pcr 技术是在pcr反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个pcr 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光染料能特异性掺入dna双链而发出荧光信号，不能掺入dna双链中的荧光染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加同步。荧光探针法是将荧光共振能量传递（fret）技术应用于常规pcr中，在探针的5’端标记一个荧光报告基团（r），3’端标记一个荧光淬灭基团（q），两者可构成能量传递结构，即5’端发出的荧光被3’端吸收或抑制，当距离较远时，q的抑制作用消失，荧光信号增强，荧光检测系统可接收到荧光信号。双色荧光标记技术目前已广泛使用在等位基因产物分别标记的应用，通过荧光标记识别等位基因产物。
3.支原体（mycoplasma）属于一种微小的、没有细胞壁的原核生物，能通过细菌滤器，是介于病毒和细菌之间独立生存的微生物，革兰染色为阴性。支原体基因组为一环状双链dna，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。有多种支原体可以寄生于猫，根据是否感染红细胞，可以区分为嗜血和非嗜血型两类。感染呼吸道的属于非嗜血类，其中最重要的是猫支原体（mycoplasma felis）。猫支原体主要感染呼吸道感染或泌尿道感染，表现为打喷嚏、流鼻涕、眼部充血肿胀、眼睛分泌物增加、呼吸急促、肛门红肿等症状，典型的会导致猫支原体眼病，导致猫咪眼结膜极度充血和水肿。在健康猫的眼拭子中很少发现猫支原体，但是在猫患结膜炎后，则在眼拭子中普遍存在。
4.猫衣原体（chlamydia felis）是一种革兰氏阴性的杆状球菌，具有缺少肽聚糖的细胞壁，是一种绝对细胞内寄生菌，无法在细胞外自行增殖。通过猫呼吸道和结膜的呼吸系统感染，是一种长期的以结膜炎为特征的细菌性感染。因为猫衣原体无法在宿主体外生存，所以传染必须是猫与猫之间密切地接触，眼睛的分泌物是最重要的传染来源。猫衣原体最常见于多猫饲养环境，特别是猫繁殖场，大部分于一岁之前发病，猫衣原体是猫结膜炎最常见的传染病原。猫的衣原体眼睛感染通常是零星的，影响一两只猫。症状在初次接触后2-7天内出现。第一个症状通常是一只眼睛有轻微的水样分泌物。这可以传播到双眼。随着疾病的进展，可以看到结膜的严重肿胀和发红，并且排出物从水的颜色变为更浓的黄色。由于不适，受影响的猫可能会斜视甚至睁不开。如果不进行治疗，结膜炎可以持续六到八周（或更长）。
5.基于目前市面上缺少同时检测猫支原体和猫衣原体的实时荧光定量pcr试剂盒，以及检测特异性和灵敏度较差。本发明对猫呼吸道疾病的临床诊断及治疗有着重要的意义。
技术实现要素：6.本发明针对上述技术缺陷，提供用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法，并达到一下发明目的：同时检测猫支原体和猫衣原体，并提高检测特异性和灵敏度。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物，包括用于检测猫支原体的上游引物、用于检测猫支原体的下游引物、用于检测猫支原体的荧光探针、用于检测猫衣原体的上游引物、用于检测猫衣原体的下游引物、用于检测猫衣原体的荧光探针、外参的上游引物、外参的下游引物以及外参的荧光探针；所述用于检测猫支原体的上游引物：序列如seq id no.1所示；所述用于检测猫支原体的下游引物：序列如seq id no.2所示；用于检测猫支原体的荧光探针：序列如seq id no.3所示；用于检测猫衣原体的上游引物：序列如seq id no.4所示；用于检测猫衣原体的下游引物：序列如seq id no.5所示；用于检测猫衣原体的荧光探针：序列如seq id no.6所示；所述外参的上游引物：序列如seq id no.7所示；所述外参的下游引物：序列如seq id no.8所示；所述外参的荧光探针：序列如seq id no.9所示。
8.所述用于检测猫支原体的荧光探针：5’端标记为报告基团6-fam，3’端标记为猝灭基团bhq1；所述用于检测猫衣原体的荧光探针：5’端标记为报告基团rox，3’端标记为猝灭基团bhq2；所述外参荧光探针：5’端标记为报告基团vic，3’端标记为猝灭基团bhq1。
9.用于检测猫支原体和猫衣原体的试剂盒，包括阳性对照、阴性对照、用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物、酶和buffer；所述用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物：序列如seq id no.1
‑ꢀ
seq id no.9所示。
10.所述阴性对照为te buffer。
11.所述阳性对照：含猫支原体人工合成质粒与猫衣原体人工合成质粒的浓度均为1
×
106copies/ml。
12.所述试剂盒采用的荧光定量pcr反应体系如下：采用25μl的反应体系，其中有5μl taq酶 buffer、1μl taq dna聚合酶，靶标引物探针终浓度均为2μm，外参引物探针终浓度均为1μm， depc处理水10.25μl，模板量为5μl。
13.所述试剂盒采用的荧光定量pcr反应程序为：50℃，2min；95℃，预变性10min；94℃，变性15s，60℃，退火和延伸共40s，循环45次。
14.循环步骤中，采集6-fam、rox、vic通道荧光信号。
15.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种检测猫呼吸道疾病病原体的引物探针组合物，该引物探针组合物既可以实现其中一种的病原体的检测，也可以实现猫呼吸道疾病两种病原体的同时检测。该引物探针组合物具有检测特异性好，灵敏度高的优点。本发明还提供了一种检测试剂盒及检验方法，使用本发明提供的方法进行检测时，无需开盖，且无污染，检测方法方便快捷。本发明为猫呼吸道疾病的临床诊断提供了快速准确地检测方法。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附
图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
17.图1为实施例2中采用本发明试剂盒对猫衣原体检测的荧光定量标准曲线；图2是实施例2中采用本发明试剂盒对猫支原体检测的荧光定量标准曲线；图3为实施例3中本发明检测试剂盒对1
×
103copies/ml浓度猫衣原体人工合成质粒检测的扩增曲线图；图4为实施例3中本发明检测试剂盒对1
×
103copies/ml浓度猫支原体人工合成质粒检测的扩增曲线图；图5为实施例4中检测猫衣原体引物的特异性实验的检测结果图；图6为实施例4中检测猫支原体引物的特异性实验的检测结果图。
具体实施方式
18.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
19.实施例1用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物，具体序列如下：针对myco-2基因设计用于检测猫支原体的上游引物 seq id no.1：5
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gacgtcaaatcatcatgcc-3’（简称myc-f）；针对myco-2基因设计用于检测猫支原体的下游引物seq id no.2：5
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cagactacaatccgaactgaga-3’（简称myc-r）；针对myco-2基因设计用于检测猫支原体的荧光探针seq id no.3：5
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acacacgtgctacaa-3’（简称myc-p），该荧光探针的5’端标记为报告基团6-fam，3’端标记为猝灭基团bhq1；针对momp基因设计用于检测猫衣原体的上游引物seq id no.4：5
’‑
aacagcagcttctggaactg-3’（简称c.felis-f）；针对momp基因设计用于检测猫衣原体的下游引物seq id no.5：5
’‑
tcttgaagatgtttgccgtagg-3’（简称c.feli-r）；针对momp基因设计用于检测猫衣原体的荧光探针seq id no.6：5
’‑
aagcaacactgtcgctgccg-3’（简称c.feli-p），该荧光探针的5’端标记为报告基团rox，3’端标记为猝灭基团bhq2；针对拟南芥suc基因设计的外参上游引物 seq id no.7：5
’‑
ccatgtggatgcttcttatagtc-3’（简称suc-f）；针对拟南芥suc基因设计的外参下游引物 seq id no.8：5
’‑
ccatccaatcagtgtcgaagagaa-3’（简称suc-r）；针对拟南芥suc基因设计的外参荧光探针seq id no.9：5
’‑
ctgcactaaactggatcgcttggttcc-3’（简称suc-p），该荧光探针的5’端标记为报告基团vic，3’端标记为猝灭基团bhq1。
20.上述引物：无二聚体和发卡结构。
21.上述引物和探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。
22.实施例2 用于检测猫支原体和猫衣原体的实时荧光定量pcr试剂盒所述试剂盒包括：用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物、酶和buffe、阳性对照、阴性对照。所述酶和buffer：购自菲鹏生物股份有限公司，md009h。
23.所述试剂盒的制备方法：所述用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物采用实施例1设计的引物和探针，即myc-f、myc-r、myc-p、c.felis-f、c.feli-r、c.feli-p、suc-f、suc-r、suc-p。
24.试剂盒采用te buffer为阴性对照。
25.将猫支原体目标基因(myco-2基因)序列、猫衣原体目标基因(momp基因)序列分别插入puc 57载体质粒，经由扩大培养、鉴定并质粒提取，得到猫支原体人工合成质粒、猫衣原体人工合成质粒。将猫支原体人工合成质粒、猫衣原体人工合成质粒分别定量至2
×
106拷贝/ml，采用2
×
106copies/ml的猫支原体人工合成质粒与2
×
106copies/ml猫衣原体人工合成质粒按照1:1的体积比混合作为阳性对照，即阳性对照中猫支原体人工合成质粒与猫衣原体人工合成质粒的浓度均为1
×
106copies/ml。
26.所述一种用于猫支原体和猫衣原体的实时荧光定量pcr试剂盒，采用的荧光定量pcr反应体系如下：采用25μl的反应体系，其中有5μl taq酶 buffer、1μl taq dna聚合酶，靶标引物探针终浓度均为2μm，即反应体系中myc-f、myc-r、myc-p各加入0.5μl，外参引物探针终浓度均为1μm，即suc-f、suc-r、suc-p各加入0.25μl，c.felis-f、c.felis-r、c.felis-p各加入0.5μl，depc处理水10.25μl，模板量为5μl。
27.所述模板量为加入的待测核酸样本的量。
28.所述一种用于猫支原体和猫衣原体的实时荧光定量pcr试剂盒，采用的荧光定量pcr反应程序为：以待测核酸样本为模板序列，进行荧光定量pcr反应；荧光定量pcr反应程序具体为：50℃，2min；95℃，预变性10min；94℃，变性15s，60℃，退火和延伸共40s，循环45次。
29.循环步骤中，采集6-fam、rox、cy5、vic通道荧光信号。
30.采用本发明试剂盒对猫衣原体检测的荧光定量标准曲线如附图1所示；采用本发明试剂盒对猫支原体检测的荧光定量标准曲线如附图2所示。
31.将待检样品采用试剂盒进行扩增后，若产生s型扩增曲线则说明含有猫支原体或猫衣原体。
32.实施例3用于猫支原体和猫衣原体的实时荧光定量pcr试剂盒的灵敏度验证实验将猫衣原体人工合成质粒配至浓度1
×
103copies/ml，作为待检测目标a。将猫支原体人工合成质粒配至浓度1
×
103copies/ml，作为待检测目标b。
33.采用实施例2的检测试剂盒及其使用方法，对待检测目标a，即1
×
103copies/ml浓度的猫衣原体人工合成质粒，进行检测，设置8个重复，获得扩增曲线；扩增曲线图如附图3所示。通过附图3可以看出，设置的8个重复，8个扩增曲线全部起峰，说明采用本发明检测试剂盒检测1
×
103copies/ml的猫衣原体，检出率为100％，即能全部检出，因此，采用本发明检测试剂盒检测猫衣原体的最低检测限度可以达到1
×
103copies/ml，且检出准确，重复性好。
34.采用实施例2的检测试剂盒及其使用方法，对待检测目标b，即1
×
103copies/ml浓度的猫支原体人工合成质粒，进行检测，设置8个重复，获得扩增曲线，扩增曲线图如附图4
所示。通过附图4可以看出，设置的8个重复，8个扩增曲线全部起峰，说明采用本发明检测试剂盒检测1
×
103copies/ml的猫支原体，检出率为100％，即能全部检出，因此，采用本发明检测试剂盒检测猫支原体的最低检测限度可以达到1
×
103copies/ml，且检出准确，重复性好。
35.实施例4 一种用于猫支原体和猫衣原体的实时荧光定量pcr试剂盒的特异性验证实验试剂盒采用25μl的反应体系，反应体系如下：采用25μl的反应体系，其中有5 μl taq酶 buffer（包括dntp、mgcl2）、1μl taq dna聚合酶，靶标引物探针终浓度均为2μm，即反应体系中myc-f、myc-r、myc-p各加入0.5μl，外参引物探针终浓度均为1μm，即suc-f、suc-r、suc-p各加入0.25μl，c.felis-f、c.felis-r、c.felis-p各加入0.5μl，depc处理水10.25μl，模板量为5μl。
36.设置检测猫衣原体（简称c.felis）引物的特异性实验组，实验组设置8个pcr小管，均设置2个重复。分别向8个pcr小管中加入目标病原体c.felis和其它干扰病原体（猫腺病毒2型、猫疱疹病毒ⅰ型、猫冠状病毒、猫艾滋、猫白血、猫肥厚型心肌病、猫杯状病毒），所有病原体的浓度均为1
×
103copies/ml；进行荧光定量pcr，然后按照反应体系加入其他组分，进行扩增。上述检测猫衣原体引物的特异性实验的检测结果图如附图5所示。
37.设置检测猫支原体（简称myc）引物的特异性实验组，实验组设置8个pcr小管，均设置2个重复。分别向8个pcr小管中加入目标病原体myc和其它干扰病原体（猫腺病毒2型、猫疱疹病毒ⅰ型、猫冠状病毒、猫艾滋、猫白血、猫肥厚型心肌病、猫杯状病毒），所有病原体的浓度均为1
×
103copies/ml；分别进行荧光定量pcr，然后按照反应体系加入其他组分，进行扩增。每个实验组设置8个pcr小管，设置2个重复。上述检测猫支原体引物的特异性实验的检测结果图如附图6所示。
38.从附图5可见，采用目标病原体（猫衣原体）与其他干扰病原体进行荧光定量pcr，除猫衣原体扩增曲线起峰外，干扰病原体曲线并未起峰，说明该试剂盒检测猫衣原体具有显著的特异性。
39.从附图6可见，采用目标病原体（猫支原体）与其他干扰病原体进行荧光定量pcr，除猫支原体扩增曲线起峰外，干扰病原体曲线并未起峰，说明该试剂盒检测猫支原体具有显著的特异性。
40.需要说明的是，以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。凡采用同等替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均应包含在本发明的保护范围内。
技术特征：1.用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物，其特征在于：包括用于检测猫支原体的上游引物、用于检测猫支原体的下游引物、用于检测猫支原体的荧光探针、用于检测猫衣原体的上游引物、用于检测猫衣原体的下游引物、用于检测猫衣原体的荧光探针、外参的上游引物、外参的下游引物以及外参的荧光探针；所述用于检测猫支原体的上游引物：序列如seq id no.1所示；所述用于检测猫支原体的下游引物：序列如seq id no.2所示；用于检测猫支原体的荧光探针：序列如seq id no.3所示；用于检测猫衣原体的上游引物：序列如seq id no.4所示；用于检测猫衣原体的下游引物：序列如seq id no.5所示；用于检测猫衣原体的荧光探针：序列如seq id no.6所示；所述外参的上游引物：序列如seq id no.7所示；所述外参的下游引物：序列如seq id no.8所示；所述外参的荧光探针：序列如seq id no.9所示。2.根据权利要求1所述的用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物，其特征在于：所述用于检测猫支原体的荧光探针：5’端标记为报告基团6-fam，3’端标记为猝灭基团bhq1；所述用于检测猫衣原体的荧光探针：5’端标记为报告基团rox，3’端标记为猝灭基团bhq2；所述外参荧光探针：5’端标记为报告基团vic，3’端标记为猝灭基团bhq1。3.用于检测猫支原体和猫衣原体的试剂盒，其特征在于：包括阳性对照、阴性对照、用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物、酶和buffer；所述用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物：序列如seq id no.1
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seq id no.9所示。4.根据权利要求3所述的用于检测猫支原体和猫衣原体的试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为te buffer。5.根据权利要求3所述的用于检测猫支原体和猫衣原体的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照：含猫支原体人工合成质粒与猫衣原体人工合成质粒的浓度均为1
×
106copies/ml。6.根据权利要求3所述的用于检测猫支原体和猫衣原体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒采用的荧光定量pcr反应体系如下：采用25μl的反应体系，其中有5μl taq酶 buffer、1μl taq dna聚合酶，靶标引物探针终浓度均为2μm，外参引物探针终浓度均为1μm， depc处理水10.25μl，模板量为5μl。7.根据权利要求3所述的用于检测猫支原体和猫衣原体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒采用的荧光定量pcr反应程序为：50℃，2min；95℃，预变性10min；94℃，变性15s，60℃，退火和延伸共40s，循环45次。
技术总结本发明提供用于检测猫支原体和猫衣原体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法，所述引物探针组合物包括用于检测猫支原体的上游引物、用于检测猫支原体的下游引物、用于检测猫支原体的荧光探针、用于检测猫衣原体的上游引物、用于检测猫衣原体的下游引物、用于检测猫衣原体的荧光探针、外参的上游引物、外参的下游引物以及外参的荧光探针。本发明可同时检测猫支原体和猫衣原体，且具有检测特异性好，灵敏度高的优点。灵敏度高的优点。灵敏度高的优点。
技术研发人员：田永帅 杨帆 于明明 刘嘉男 宋金铃 左雪梅 刘万建
受保护的技术使用者：青岛汉唐生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
