1.本发明属于农药制剂领域，具体涉及一种基于海藻酸钠的吡唑醚菌酯微胶囊及其制备方法。
背景技术：2.微胶囊是农药缓释制剂中的一种，是指成膜材料充当载体将药物有效成分或者其他活性物质包封起来，形成一种可以降低或者控制内部物质释放速率的胶囊型包封物。制备微胶囊的过程即为微囊技术，又称为微胶囊化。微胶囊不仅可以包封固体物质，还可以包封液体、气体等状态的物质。在实际应用中常选用粒径大小在2-1000μm之间的微胶囊加工成各种农药剂型。常用的制备微胶囊的囊壁材料包括天然高分子材料、无机材料、人工合成及半人工合成材料。
3.海藻酸钠是一种是从褐藻类中提取的天然多糖碳水高分子化合物，属植物胶类。具有良好的稳定性、增稠性和生物相容性等特点。目前在食品和医药加工领域被广泛使用，具有较高的使用价值，早在 1938年美国已经将其收入到药典之中，常被用来制作成缓释剂、包埋剂以及生物粘附剂等药物载体。海藻酸钠来源广泛，在褐藻类生物的细胞壁和一些细菌中均可以提取出来。以海藻酸钠为壁材制备微胶囊的方法包括喷雾干燥法、挤压法、乳化凝胶法、层层组装法等。制备得到的海藻酸钠微胶囊具有以下特点：(1)微胶囊强度高、粒径分布均匀，能够很好地保护微胶囊内部的药物有效成分；(2)具有防突释和ph敏感性，微胶囊几乎不会在酸性环境中发生溶胀现象，内部有效成分释放率较低，而在碱性环境中，微胶囊溶胀度增加，内部药物释放速率相对较快。(3)海藻酸钠原料安全无毒，制备得到的微胶囊可以很好地将药物成分包封起来，增加了药物的生物安全性。
4.吡唑醚菌酯是一种线粒体呼吸抑制剂，其作用机理是在线粒体内部的电子转移过程中，阻断该电子转移过程，使得线粒体无法提供所满足细胞的正常代谢所需的能量，最终正常细胞因此衰竭死亡。该化合物具有杀菌谱广、相对抑菌活性强、传导活性强、使用后农药残留量低、保护寄主、调控作物生长、促进植物生长等特性，吡唑醚菌酯抑制植物病原菌孢子萌发能力强，其在植物体内的传导内吸活性较高，尤其是对植物叶片内部的病原菌丝抑制效果，但在植物叶片叶尖、叶基部分的传导内吸能力低。
5.吡唑醚菌酯虽然具有防治谱广、内吸性强等特点，但对水生生物的毒害作用很强，此前曾一度被限制用于水稻相关病害的防治。直至巴斯夫公司研发出了防治稻瘟病的吡唑醚菌酯微胶囊悬浮剂，才开始被推广应用于水稻病害防治中。并且自然条件下吡唑醚菌酯容易光解，致使其存在田间有效利用量低、施药后持效期短等缺陷。吡唑醚菌酯目前常用剂型包括乳油、水分散粒剂以及水乳剂等，但是在乳油剂型加工的过程中，大量有机溶剂的使用会造成环境污染和浪费资源的情况。依据吡唑醚菌酯本身的性质特点，其又可以被制作成粉剂、可湿性粉剂、悬浮剂和微胶囊等剂型，其中微胶囊以及微胶囊悬浮剂近年来不断成为了吡唑醚菌酯的剂型加工热点。
6.本研究以海藻酸钠为囊壁，吡唑醚菌酯为囊芯，采用内源乳化凝胶法制备吡唑醚
菌酯sa微胶囊，再通过对微胶囊制备过程中的影响因素和工艺条件进行优化，探讨不同工艺参数对微胶囊粒径大小及分布的影响；通过对制备得到的最优配比微胶囊进行一系列的性能表征测定，研究分析微胶囊的外观形态、粒径大小及分布、包埋率、释放性能、稳定性能；以吡唑醚菌酯原药为对照，对最优配比微胶囊进行室内生物活性测定，研究分析该微胶囊对病原菌菌丝的生长抑制效果。以期获得性能稳定、安全环保的固体吡唑醚菌酯微胶囊，为增加吡唑醚菌酯相关剂型种类提供可能，并为吡唑醚菌酯在农田使用中更好的达到减施增效的目的，以及为新型缓控释农药剂型的研发提供新思路和技术支持。
技术实现要素：7.本发明一种基于海藻酸钠的吡唑醚菌酯微胶囊的制备方法在 25℃下，将经乙酸乙酯溶解的吡唑醚菌酯原药、1％海藻酸钠水溶液以及5％碳酸钙水溶液混合，并将混合溶液与含10％乳化剂a-110的液体石蜡混匀，保持1000r/min的剪切速率乳化10min；再利用87.5 mmol/l的冰醋酸降低混合相ph，使得离子之间发生交联反应形成微胶囊；最后利用ph为4.5的醋酸盐缓冲液洗涤分离出微胶囊浆液，经离心、冷冻干燥从而制备出吡唑醚菌酯sa微胶囊。本发明制备的吡唑醚菌酯微胶囊具有优异的制剂性能，可用于小麦根腐病菌的防治。
8.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
9.本研究以海藻酸钠为囊壁，吡唑醚菌酯为囊芯，采用内源乳化凝胶法制备吡唑醚菌酯sa微胶囊。
10.比较研究了不同溶剂类型以及不同海藻酸钠添加量、乳化时间、剪切速率、乳化剂种类及添加量等载药条件对所制备的微胶囊粒径大小及分布情况的影响，结合不同溶剂对原药的溶解度，选定乙酸乙酯作为囊芯溶剂，采用1％海藻酸钠、10％乳化剂a-110，在25℃下，以 1000r/min的剪切速率乳化10min，制备得到的吡唑醚菌酯sa微胶囊粒径较小、大小均一，且粒径呈正态分布。
11.测定了吡唑醚菌酯sa微胶囊的形态表征和包封率，结果表明微胶囊的成囊状态良好，整体成圆球形，表面光滑圆整，分散性较好，无黏连现象。
12.研究对比了吡唑醚菌酯sa微胶囊和原药的冷、热储稳定性，发现二者在4℃和-20℃下储存时稳定性均较好；但在25℃和高温54℃下储存时，原药分解速率较快，其中54℃储存30d后，原药和微胶囊的分解率分别为40.25％和16.44％，说明将原药微胶囊化可以很好地延缓和降低高温对其有效成分造成的损害。
13.吡唑醚菌酯sa微胶囊和原药的光稳定性测定结果显示，原药和微胶囊的半衰期分别为21.04min、43.42min，说明微胶囊化可以很好地延长吡唑醚菌酯有效成分的半衰期。说明微胶囊化可以降低吡唑醚菌酯的光解速率和光解程度，提升药剂的稳定性，可以达到保护囊芯原药的作用；
14.吡唑醚菌酯sa微胶囊在不同ph释放介质中的释放试验表明，该微胶囊具有很好的控释效果；
15.毒力测定结果发现原药的ec50值为0.097μg/ml，微胶囊处理12d 时对菌丝生长达到最大的抑制效果，此时其ec50值为0.1109μg/ml，说明将吡唑醚菌酯微胶囊化很好地起到了缓释效果。
附图说明：
16.图1：制备流程图；
17.图2：不同有机溶剂对微胶囊粒径大小的影响(注：图中abcd分别代表乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯制备的微胶囊粒径分布曲线图)
18.图3：不同海藻酸钠浓度制备的微胶囊粒径分布曲线对比图；
19.图4：不同乳化时间的微胶囊粒径分布曲线对比图；
20.图5：不剪切速率下的微胶囊粒径分布曲线对比图；
21.图6：不同乳化剂浓度的微胶囊粒径分布曲线对比图；
22.图7：吡唑醚菌酯sa微胶囊在光学显微镜下的形态结构(注：图中 ab分别代表微胶囊在100、400倍镜下观测所得结果)；
23.图8：吡唑醚菌酯sa微胶囊扫描电镜图(
×
1000)；
24.图9：吡唑醚菌酯sa微胶囊扫描电镜图(
×
3000)；
25.图10：吡唑醚菌酯sa微胶囊的粒径分布曲线图；
26.图11：原药、海藻酸钠及微胶囊的红外吸收光谱图；
27.图12：吡唑醚菌酯紫外吸收光谱图；
28.图13：吡唑醚菌酯标准曲线；
29.图14：紫外光对原药和微胶囊的光降解效率对比；
30.图15：吡唑醚菌酯sa微胶囊在不同ph的pbs缓冲液中的释放曲线；
31.图16：不同释放天数的微胶囊处理对小麦根腐病菌菌丝的抑制效果；
32.图17：微胶囊12d和原药对小麦根腐病菌菌丝的抑制效果对比；
33.图18：海藻酸钠对小麦根腐病菌菌丝的抑制效果
具体实施方式
34.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明
35.实施例1：吡唑醚菌酯微胶囊的研制
36.1.1材料与方法
37.本试验中所用的化学试剂和仪器由安徽农业大学植物保护学院植物病害流行及综合治理实验室和安徽省农业科学院植保所提供。
38.1.2微胶囊制备方法：
39.内源乳化凝胶法制备吡唑醚菌酯sa微胶囊(室温25℃)
40.a.准确称取0.5g吡唑醚菌酯原药于烧杯中，向其中加入0.75ml 乙酸乙酯，置于磁力搅拌器上搅拌至原药完全溶解；
41.b.向烧杯中滴加入0.1ml乳化剂a-110和1ml纯水，保持400r/min 的搅拌速度，均匀乳化15min；
42.c.用烧杯量取100ml纯水，加热到60℃，另称取1.0g海藻酸钠加入其中，将烧杯放置于恒温水浴锅上，保持60℃恒温搅拌，直至海藻酸钠完全溶解，利用超声波清洗机超声脱气处理溶液中的气泡，之后将烧杯置于磁力搅拌器上，保持400r/min的搅拌速度均匀搅拌；
43.d.利用滴定管，将b中充分乳化后的含药溶液缓慢滴加入到海藻酸钠溶液中，在磁力搅拌器上匀速搅拌至充分混匀后，再次超声脱气处理；
44.e.取20毫升的d步骤的混合液于烧杯中，滴加入1ml 5％的碳酸钙
ꢀ‑
水混合溶液，混合搅拌10min(碳酸钙悬浮液在3min中内添加完毕)；
45.f.另取100ml液体石蜡于研磨杯中，向其中加入10ml乳化剂 a-110，利用多用分散研磨机保持1000r/min的搅拌速度，预搅拌5min；
46.g.待液体石蜡和乳化剂混合均匀后，保持1000r/min转速不变，利用滴定管将步骤e中混合液均匀缓慢的滴加到液体石蜡中，继续均匀搅拌10min；(乳化阶段)
47.h.保持1000r/min转速不变，再取含87.5mmol/l冰醋酸的石蜡油 20ml，滴加入到g步骤的混合液中(3min内添加完毕)，使混合溶液充分交联反应15min；(交联反应阶段)
48.i.反应结束后，利用ph为4.5的醋酸盐缓冲液充分洗涤油相，再利用分液漏斗分离出微胶囊浆液，分装于50ml离心管中；
49.j.将微胶囊浆液在-4℃、10000r/min下高速离心15min后，倒掉上清液，放置于4℃预冻1h后，放置在-20℃下预冻3h，最后将离心管放置在真空冷冻干燥机里，-50℃下冷冻干燥42h得到微胶囊干粉，密封保存备用。
50.1.3微胶囊制备条件的筛选
51.1.3.1囊芯溶剂的选取
52.吡唑醚菌酯难溶于水，通常溶解于有机溶剂之中，考虑到生产过程中的安全性，本研究分别选取丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等中等以下毒性的有机溶剂，作为囊芯溶剂溶解原药。并通过本试验采用的微胶囊制备方法，考量制备得到的微胶囊粒径大小及其分布的特点，综合考虑选取最适合的有机溶剂种类。
53.1.3.2海藻酸钠添加量的筛选
54.海藻酸钠浓度高低影响到最终微胶囊的外观形态、包封率和载药量、释放性能等。本试验设置0.75％、1％、2％和3％的海藻酸钠制备成水溶液作为壁材，向其中添加相同质量的其他药品试剂，分别制备成吡唑醚菌酯海藻酸钠微胶囊。通过测定不同海藻酸钠制备得到的微胶囊的粒径大小、粒径分布情况等筛选出最合适的芯壁材比例。
55.1.3.3剪切速率的筛选
56.通过高速剪切使得吡唑醚菌酯和海藻酸钠的混合液均匀的分散在油相中，从而得到均匀稳定的乳液，从而影响到最终微胶囊的粒径大小及其粒径分布。本试验利用控制单因素变量法，分别考察剪切速率在100、500、1000、1300r/min时制备得到的吡唑醚菌酯微胶囊的粒径大小及其粒径分布范围，研究剪切速率对微胶囊制粒的影响，从而筛选出制备出相对最小粒径微胶囊的剪切速率。
57.1.34乳化时间的筛选
58.乳化时间长短是影响微胶囊最终的成囊效果的重要因素，乳化时间将会对微胶囊的载药量、包封率、囊壁的薄厚和强度影响以及微胶囊外观形态产生较大影响。本研究设置了5min、10min、20min、30min 的乳化时间，研究了乳化时间长短对吡唑醚菌酯sa微胶囊粒径大小及其分布的影响，从而筛选出最为适宜的乳化时间。
59.1.3.5乳化剂种类及添加量的筛选
60.乳化剂的种类和添加量对微胶囊是否能够形成稳定的囊状物以及成囊之后的整
体效果影响很大。本研究对三种乳化剂span-80、 tween-80和a-100的乳化性能进行评价，乳化剂常用用量范围在 2％-10％，故每种乳化剂均设置4％的用量，加相等含量的有机溶剂、原药和水，固定相同的搅拌时间和搅拌速率，搅拌完成后静置，分别观察三者对吡唑醚菌酯的乳化效果，根据实验结果筛选出乳化性能最佳的乳化剂。
61.在乳化剂用量的筛选方面，本试验分别设置2％、4％、8％、10％和 15％配比的乳化剂a-110用量，将制备得到的吡唑醚菌酯sa微胶囊的粒径大小及其分布的均匀程度作为衡量标准，从而筛选出本试验方法下的乳化剂最佳添加量。
62.1.4微胶囊的性能表征测定
63.1.4.1微胶囊的外观形态表征
64.分别在光学显微镜和扫描电子显微镜上，对微胶囊的外观形态进行表征。
65.1.4.2微胶囊ft-ir分析验证
66.利用thermo scientific nicolet in10型傅里叶变换红外光谱仪对微胶囊、吡唑醚菌酯和海藻酸钠三者进行红外光谱分析。通过变化红外光谱对三者的特征官能团吸收峰进行表征，观察吸收峰的峰位和峰值变化。
67.1.4.3微胶囊的粒径大小及分布测定
68.利用bt-9300ht型激光粒度分布仪对制备得到的微胶囊颗粒进行粒径大小和分布的表征测定，微胶囊粒径单位为μm，每组待测样品重复测定3次，测定得到微胶囊的d10、d50、d90和span。四者关系可用公式(1)表示：
69.span＝(d90-d10)/d50
ꢀꢀ
(1)
70.公式中span(跨距)代表微胶囊粒径分布范围，d90代表颗粒累计分布为90％的粒径，d10代表颗粒累计分布为10％的粒径，d50代表颗粒累计分布为50％的粒径，也常用来表示微胶囊平均粒径。
71.1.4.4微胶囊包封率和载药量测定
72.衡量微胶囊包封效果和包封质量最重要的两个指标即为包封率和载药量，对待测微胶囊样品处理后，通过uv-1900i紫外分光光度计测定样品在固定紫外吸收峰下的吸光度，从而计算得到包封率和载药量。
[0073][0074][0075]
1.4.5微胶囊稳定性测定
[0076]
分别测试冷储稳定性、热储稳定性、光稳定性。
[0077]
1.4.6微胶囊释放性能测定
[0078]
试验设定ph6、7、8三个不同ph的缓冲介质，制造弱酸、中性、弱碱的释放环境。
[0079]
1.5结果与分析
[0080]
1.5.1囊芯溶剂的筛选
[0081]
本研究从有机溶剂的的毒性高低、对吡唑醚菌酯的溶解能力大小以及制备得到的微胶囊粒径大小和分布是否均匀等条件出发，通过对比各组试验结果，综合考察选取适合本研究的最佳囊芯溶剂。
[0082]
表1不同有机溶剂相关参数
[0083][0084]
表2不同有机溶剂筛选试验
[0085][0086][0087]
按照表2药剂配比，制备出吡唑醚菌酯sa微胶囊。通过激光粒度分布仪测定各组配比下制备得到的微胶囊粒径大小及其粒径分布，结果如图2、表3所示。
[0088]
表3不同有机溶剂对微胶囊平均粒径和跨度的影响
[0089]
序号平均粒径d50(μm)跨度span1191.41.5522190.41.7173156.71.9414143.41.573
[0090]
从微胶囊粒径分布图中可以看到，四种有机溶剂制备得到的微胶囊粒径大小为：乙醇＞甲醇＞丙酮＞乙酸乙酯，而粒径分布跨度则是：丙酮＞甲醇＞乙酸乙酯＞乙醇。农药剂型加工时常选择难溶于水，且有较大溶解度的有机溶剂。常温下丙酮和乙酸乙酯对吡唑醚菌酯的溶解度远大于甲醇和乙醇，而丙酮在常温下挥发性极强，且丙酮制备得到的微胶囊粒径大小分布不均匀，粒径曲线不符合正态分布，结合本试验制备得到的微胶囊粒径大小及其分布结果，乙酸乙酯对吡唑醚菌酯的溶解度较高，且制备得到的微胶囊分布较为集中，微胶囊颗粒粒径和跨度均比较小。综合以上因素考虑，选取乙酸乙酯作为本试验的最佳
溶剂进行后续试验。
[0091]
1.5.2海藻酸钠添加量的筛选
[0092]
海藻酸钠作为本研究的微胶囊壁材，其水溶液胶黏性较高，会影响微胶囊的成品性质和药物的分散均匀程度等，因此需要对其添加量进行筛选。如表4所示，通过控制变量法制备吡唑醚菌酯sa微胶囊。并通过激光粒度分析仪对所制备的微胶囊粒径大小及其分布进行测定，结果如图3和表4所示。
[0093]
表4海藻酸钠添加量筛选试验
[0094][0095]
通过激光粒度分析仪测定四种浓度海藻酸钠所制备的微胶囊的粒径大小及其分布，结果如图7、表7所示。图3为不同海藻酸钠浓度所制备的微胶囊粒径分布曲线对比图，从图中可以看出，浓度为3％时，微胶囊粒径主要集中在40-500μm之间，对比其他两组可以发现3％时粒径分布较为分散；浓度为0.75％时，微胶囊粒径主要集中在 40-500μm之间，总体粒径适中；而浓度为1％时，微胶囊粒径主要集中在40-300μm之间，粒径总体比其余两组小，且通过分析四者的粒径分布跨距，发现1％时跨距最小，跨距为1.35。
[0096]
表5不同海藻酸钠浓度制备的微胶囊粒径特征值
[0097][0098]
由表5中可以看到，随着海藻酸钠添加量的提高，微胶囊粒径增加，当浓度增至3％时，微胶囊粒径最大，平均粒径达到160.1μm。这是因为随着海藻酸钠添加量的增加，溶液的
粘稠度随之变大，而低粘稠度的溶液才便于分散形成较小的液滴，从而最终形成较小的微胶囊颗粒，高粘稠度的溶液会导致分散困难，从而形成较大尺寸的液滴；同时如果溶液的粘稠度过高，还会导致吡唑醚菌酯原药在其中难以分散均匀，导致工艺上操作不便，从而导致最终成型的微胶囊的包埋率参差不一，对试验结果造成误差影响。而浓度为0.75％时，制备得到的微胶囊粒径较1％时稍大，这是因为海藻酸钠浓度低时会导致微胶囊强度不足易破裂，导致微胶囊粒径增大。
[0099]
综合以上内容考虑，浓度为1％时的海藻酸钠所制备成的吡唑醚菌酯sa微胶囊效果最好，粒径大小最小，且粒径分布较为集中，所以选用1％的海藻酸钠为后续试验固定参数。
[0100]
1.5.3乳化时间的筛选
[0101]
表6乳化时间筛选试验
[0102][0103]
乳化时间长短将会影响微胶囊最终的成囊效果，决定着乳化过程是否充分，从而会对微胶囊的载药量、包封率、囊壁的薄厚和强度等造成较大影响。通过控制变量法制备吡唑醚菌酯sa微胶囊，试验参数设定如上表6所示。
[0104]
表7不同乳化时间制备的微胶囊粒径特征值
[0105][0106]
[0107]
上图4、表7分别为不同乳化时间的微胶囊粒径大小及分布情况。从表中可以看到，乳化时间为5min时，微胶囊粒径稍大，平均粒径为123.5μm，随着乳化时间的增加，微胶囊的粒径随之变大，当乳化时间为30min时微胶囊的粒径最大，平均粒径为160.0μm，微胶囊粒径主要集中在40-500μm之间，跨距为1.751，此时微胶囊分布的较为集中；乳化时间为10min时的粒径最小，微胶囊平均粒径在109.6μm，分布范围集中在20-400μm之间，跨距稍大，但总体粒径大小与其他几组相比最小，且乳化时间过长不仅会导致破乳现象而且还会造成能源浪费，不符合实际生产要求。
[0108]
综合以上内容考虑，乳化时间为10min时所制备成的微胶囊粒径最小，且分布较为集中，所以选用10min的乳化时间作为后续试验固定参数。
[0109]
1.5.4剪切速率的确定
[0110]
剪切是将大油滴通过剪切力作用形成次级油滴的过程，主要影响微胶囊的粒径及其分布，通过控制变量法制备吡唑醚菌酯sa微胶囊，试验参数设定如表8所示。
[0111]
表8剪切速率筛选试验
[0112][0113][0114]
通过激光粒度分析仪分别测定不同剪切速率下的制备的微胶囊粒径大小及分布情况，结果如图5、表8所示。从中可以看到，随着剪切速率的提高，微胶囊的粒径变小，但当剪切速率达到1300r/min 时，微胶囊粒径反而略微变大，平均粒径为74.51μm。
[0115]
表9不同剪切速率制备的微胶囊粒径特征值
[0116][0117]
结合图5表和9可以发现，微胶囊的平均粒径及跨距均随着剪切速率的增加而减小，但剪切速率较小时，溶液不能充分搅拌，使得部分大油滴不能通过剪切过程转化为小油滴，导致制备得到的微胶囊粒径较大；当剪切速率过高时，剪切速率带来的剪切力对平均粒径的影响作用减弱，且搅拌速率过大还会导致破乳现象的产生，从而导致微胶囊粒径变大。
[0118]
综合以上内容考虑，剪切速率为1000r/min时所制备成的吡唑醚菌酯sa微胶囊效果最好，粒径大小最小，且粒径分布相对集中，所以选用1000r/min的剪切速率作为后续试验固定参数。
[0119]
1.5.5乳化剂种类及添加量的筛选
[0120]
1.5.5.1乳化剂种类的筛选
[0121]
合适的乳化剂是制备出均匀稳定的乳液的重要因素，也将影响微胶囊的成囊状态。本研究将添加了不同乳化剂的混合乳液充分静置后，分别观察所制备的乳液稳定性能，通过稳定性对比三者对吡唑醚菌酯的乳化效果，乳化性能见表10。
[0122]
表10不同类型乳化剂对吡唑醚菌酯的乳化效果评价
[0123][0124]
通过上表可知，添加了乳化剂span-80和tween-80后制备得到的乳液在静置后均出现了沉淀现象，这是因为形成的乳液状态不稳定导致的，而添加了乳化剂a-100制备得到的乳液，状态均匀且静置后无沉淀现象产生，说明所制备的乳液稳定性较好，所以确定选取了 a-100作为本研究的乳化剂进行后续试验。
[0125]
1.5.5.2乳化剂添加量的确定
[0126]
乳化剂添加量对微胶囊是否能够形成稳定的囊状物以及成囊之后的整体效果影响很大，因此乳化剂的选择对微胶囊能够成功制备至关重要。如表11所示，通过控制变量法
制备吡唑醚菌酯sa微胶囊。
[0127]
表11乳化剂添加量筛选试验
[0128][0129]
通过激光粒度分析仪对所制备的微胶囊粒径大小及其分布进行测定，结果如表14和图6所示。
[0130]
表12不同乳化剂添加量制备的微胶囊粒径特征值
[0131][0132][0133]
从图7和表12中可知，乳化剂a-110用量为2％时所制备的微胶囊粒径最大，平均粒径为260.7μ m，微胶囊粒径主要集中在 50-700μ m之间，这是因为混合液在低浓度的乳化剂状态下乳化不充分，导致乳液中乳滴粒径较大，从而使得交联反应后制备得到的微胶囊粒径较大；总体来看，粒径随乳化剂浓度增加而变小，这是因为加入乳化剂减少了乳液的界面张力，乳化效果随之变好，促进乳液中乳滴变形，有助于形成小尺寸；但当乳化剂添加量为15％时，微胶囊粒径反而变大，平均粒径为156.9μm，微胶囊粒径主要集中在10-30μm 之间，跨距为1.940，微胶囊粒径主要集中在20-500μm之间，这是因为乳化剂浓度过高，导致乳液本身的泡沫增多，粘度增大，小乳滴发生聚合现象而凝聚形成大液滴，反而使得乳化效果变差。而添加了 10％乳化剂的微胶囊效果最好，平均粒径为18.64μm，跨距为1.355，微胶囊
粒径主要集中在10-30μm之间，粒径分布最为集中。
[0134]
综合以上内容考虑，乳化剂添加量为10％时所制备成的微胶囊粒径最小，且分布最为集中，所以选用乳化剂添加量为10％作为后续试验固定参数。
[0135]
吡唑醚菌酯sa微胶囊的最终配方见下表15。
[0136]
表13吡唑醚菌酯sa微胶囊的最终配方
[0137]
参数比例/含量m(吡唑醚菌酯)∶m(海藻酸钠)1∶2m(海藻酸钠)∶m(碳酸钙)3.9∶1n(冰醋酸)∶n(碳酸钙)3.5∶1m(吡唑醚菌酯)∶m(乙酸乙酯)1∶1.5v(油相)∶v(水相)6∶1乳化剂a-11010％乳化时间10min温度25℃剪切速率1000r/min醋酸盐缓冲液ph 4.5
[0138]
备注：1ml按照1g计算；乳化剂a-110的添加量、乳化时间均为步骤f指标。
[0139]
1.5.6吡唑醚菌酯sa微胶囊的外观形态表征
[0140]
从图7可以看到，在光学显微镜下吡唑醚菌酯sa微胶囊成圆球形，通过100倍、400倍显微镜可以初步观察到微胶囊的外观形态，微胶囊整体形态呈圆球形，球体圆整边缘光滑，并且用水分散降低浓度后，可以在水中分布的较为均匀，说明微胶囊可以在水中较好的分散。
[0141]
图8和图9为吡唑醚菌酯sa微胶囊在扫描电子显微镜下的外观形态表征，通过高倍镜对微胶囊的外观形态进行表征，可以更清晰的观察到，试验制备的微胶囊整体结构圆润，表面光滑，之间无黏连现象发生，可以均匀分散，成囊状态良好。
[0142]
1.5.7微胶囊粒径及分布
[0143]
通过bt-9300ht型激光粒度分布仪对制备得到的微胶囊颗粒进行粒径大小和分布的表征测定，由图10的粒径分布曲线图可以看到，微胶囊粒径主要分布在10-30μm之间，微胶囊粒径总体呈正态分布，且粒径分布较为均匀集中，说明乳化剂的添加量和试验选取的剪切速率等条件均较为适宜，能够很好地制备出粒径大小分布均匀的微胶囊。
[0144]
表14最优配比吡唑醚菌酯sa微胶囊的粒径特征值
[0145][0146]
上表14是最优配比吡唑醚菌酯sa微胶囊的粒径特征值，结果所示，最优配比制备得到的吡唑醚菌酯sa微胶囊，平均粒径为 17.78μm，跨距为0.596，微胶囊粒径越小，微胶囊
整体的结构就会越致密，从而反映出内源乳化法的制备工艺形成的微胶囊具有良好的结构性。
[0147]
1.5.8微胶囊的ft-ir分析验证
[0148]
本试验利用傅里叶变换红外光谱仪对吡唑醚菌酯sa微胶囊、吡唑醚菌酯和海藻酸钠三者进行红外光谱分析，通过观察微胶囊、原药和海藻酸钠的特征官能团吸收峰位置及其变化，来判定吡唑醚菌酯是否成功被海藻酸钠包封。
[0149]
利用thermo scientific nicolet in10型傅里叶变换红外光谱仪测定了三者的特征吸收峰，结果如上图11所示：对比曲线a和c 可以明显的观察到，吡唑醚菌酯原药在多处均有较强的特征官能团的吸收峰，在2940cm-1处的强吸收峰是甲基的c-h的伸缩振动， 1150cm-1处的强吸收峰是氯苯环上c-cl的伸缩振动，942cm-1处是吡唑环骨架上的-ch振动，818cm-1处的吸收谱带是c-n的伸缩振动，通过对比可以发现吡唑醚菌酯sa微胶囊的红外吸收光谱中也对应出现了这几处的特征峰，说明测定的微胶囊样品里含有吡唑醚菌酯成分。
[0150]
对比曲线b和c，海藻酸钠红外吸收光谱在3427cm-1处呈现出由羟基(0-h)拉伸的峰；1614cm-1和1429cm-1
处分别对应因于羧基 (-c00-)对称/不对称拉伸振动的峰，微胶囊红外吸收光谱里对应出现了这几处特征峰，说明测定的微胶囊样品里含有海藻酸钠成分。
[0151]
图中还可以观察到微胶囊对应于吡唑醚菌酯和海藻酸钠的部分特征峰，受有机溶剂的添加，以及海藻酸钠和吡唑醚菌酯之间发生相互吸收发生的交错现象的影响，而出现了红移和蓝移现象，这种现象也说明了吡唑醚菌酯和海藻酸钠二者有效成分已经相互融合，形成了一个整体。通过以上对三者红外吸收光谱的分析可知，利用乳化凝胶法可以使海藻酸钠很好地将吡唑醚菌酯包封。
[0152]
1.5.9包封率和载药量测定
[0153]
通过uv-1900i紫外分光光度计扫描测定吡唑醚菌酯的紫外可见吸收光谱，确定其最大吸收峰在205nm处，即最大吸收波长为205nm，其紫外吸收光谱见图12。
[0154]
上图17是建立的吡唑醚菌酯标准曲线y＝0.1735x+0.0343，结果显示吡唑醚菌酯在2-10μg.ml-1
的浓度范围内相关系数为0.9983，线性关系良好，可以用来测定分析吡唑醚菌酯含量。利用该标准曲线测定得到最优配比的吡唑醚菌酯sa微胶囊的包封率为95.74％、载药量为31.64％，包封效果较好。
[0155]
1.5.10微胶囊的稳定性能测定
[0156]
微胶囊的冷、热储稳定性能测定
[0157]
4℃和-20℃下，吡唑醚菌酯原药和吡唑醚菌酯sa微胶囊分解率极低，稳定性较好；在25℃储藏30d后，原药的分解率为2.2％，微胶囊的分解率为1.87％，相比于原药的分解率低；二者在高温54℃下储存30d后，原药的药效成分分解速率比微胶囊快，此时原药分解率为40.25％，微胶囊分解率为16.44％，原药的分解率高达微胶囊的一半以上。这是因为低温状态有效成分不活泼，不会造成原药和微胶囊产生较大的分解现象，说明原药和微胶囊均适合低温储藏，且高温条件下微胶囊比原药的分解率低，说明吡唑醚菌酯sa微胶囊可以在一定程度上延缓和降低高温对有效成分造成的损失伤害，即提升了药剂的稳定性。
[0158]
微胶囊的光稳定性能测定
[0159]
测定原药和微胶囊在同一紫外光照条件下有效成分的残存浓度，结果如表15所
示。从表15中可以看出，原药的半衰期为21.04min，而微胶囊半衰期为43.42min，说明微胶囊化可以很好地延长有效成分的半衰期。
[0160]
表15吡唑醚菌酯原药和微胶囊的光解动态方程
[0161][0162]
图14为微胶囊和原药在紫外光下的光降解效率图，从图中可以看出，原药在紫外光下的降解速率曲线斜率较大，降解速率较快，微胶囊的降解速率曲线较为平缓，有效成分降解速率较慢，通过对比两者的分解速率和同一时刻的有效成分残存浓度可以发现，在最终时刻 60min时，吡唑醚菌酯原药中有效成分的残存浓度仅为 1.384μg.ml-1
，而此时吡唑醚菌酯sa微胶囊中药剂有效成分的残存浓度为3.778μg.ml-1
，此结果表明吡唑醚菌酯sa微胶囊可以在一定程度上降低紫外光对原药有效成分的光解速率和光解程度，以提高药剂的稳定性，即微胶囊将会增加原药在田间使用时的持效期。
[0163]
1.5.11微胶囊的释放性能测定
[0164]
图15是吡唑醚菌酯sa微胶囊在不同ph释放介质中的有效成分吡唑醚菌酯的累积释放曲线。微胶囊内部的药剂有效成分通过囊壁的孔径向外扩散释放，此释放过程的快慢与孔径大小密切相关。已有试验研究表明sa微胶囊具有ph敏感性，海藻酸钠微球在碱性环境中
ꢀ‑
cooh基团发生解离现象，造成该环境下的微胶囊溶胀度高于在水中的溶胀度，这就使得sa微胶囊的表面孔径变大，对药物的释放量相应增大；而sa微胶囊在弱酸性的环境中-c00-转化成-cooh，电离程度和亲水性降低，溶胀度低，微胶囊表面孔径较小，使得其在酸性环境中对药物的释放量显著降低。
[0165]
由图15可知，在各ph的释放介质中，囊芯药效成分的累积释放率均随着时间的增加而不断增大，开始时微胶囊不断的吸收水分，粒径变大。随着时间不断延续，微胶囊膨胀，表面孔径变大，内部有效成分随之不断释放。12-60h之间微胶囊内外吡唑醚菌酯的浓度差异累积变大，导致此时囊芯内部的有效成分向外部的释放速率加快。60h 后囊芯内的吡唑醚菌酯含量不断减少，从而使得微胶囊释放速率变慢，直至132h后累积释放量趋于平衡状态。结果表明，该微胶囊具有ph敏感性，在弱酸性的环境中，微胶囊溶胀度降低，表面孔径缩小，使得其对药物的释放量降低。
[0166]
实施例2室内毒力测定
[0167]
供试菌株
[0168]
本试验中所用的病原菌小麦根腐病菌(fusariumpseudograminearum)菌株，由安徽农业大学植物保护学院植物病害流行及综合治理实验室提供。
[0169]
室内毒力测定
[0170]
试验采用菌丝生长速率法，测定吡唑醚菌酯原药和制备的吡唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病菌的杀菌活性，以及微胶囊在培养基中的释放规律。
[0171]
小麦根腐病菌的保存和使用
[0172]
斜面试管保存法：将小麦根腐病菌(fusariumpseudograminearum)菌株接种于pda平板上活化处理，待平板密封后放置在25℃恒温培养箱中，培养3d。挑取边缘菌块，转接于pda 斜面试管里，于25℃下恒温培养至菌落长满斜面表面，即可将试管放入4℃冰箱内储存待用。
[0173]
马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基的制备
[0174]
称取新鲜的去皮土豆200g，洗净后切成小块，锅内放1l蒸馏水，将土豆块放入其中，煮至土豆刚好可以被玻璃棒戳碎即可关火，利用8层纱布过滤溶液至大量筒内，向滤液中加入20g琼脂粉、20g葡萄糖，趁热搅拌至琼脂粉和葡萄糖融化，利用小量筒精确称取200ml分装至三角瓶内，用两层纱布、八层报纸包紧瓶口，将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，设定模式121℃，灭菌20min，之后取出放在室内室温保存待用。
[0175]
含药pda培养基的制备
[0176]
利用无菌水将微胶囊干粉制备成母液，再吸取不同量的母液加入到马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基中，利用磁力搅拌器搅拌混匀，制备成原药药剂的质量浓度梯度为0μg.ml-1、0.05μg.ml-1、 1μg.ml-1、5μg.ml-1、10μg.ml-1的含药培养基，每个处理3个重复，将所有含药培养基一次性倒好，待药板凝固后，密封保存在 25℃恒温培养箱中待用。
[0177]
接菌处理
[0178]
预先在无药pda板上活化小麦根腐病菌，25℃培养3d后，沿菌落边缘打菌饼，每隔0、4、8、12、16d用接种针挑取菌饼反向转接到含药培养基中央，将培养皿密封保存，放置于25℃恒温培养箱培养，每次培养3d后利用十字交叉法测量菌落直径，取平均值计算抑菌率。计算公式如下：
[0179][0180]
毒力测定
[0181]
将浓度和抑制率带入spss软件，计算不同释放条件下吡唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病病原菌菌丝生长的抑制效果，建立吡唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病病原菌的毒力回归方程(y＝ax+b)，得到不同释放时间下的微胶囊ec50值，并拍照记录每次的菌落状态。
[0182]
结果与分析：
[0183]
本研究采用菌丝生长速率法进行原药和微胶囊的室内生物活性测定，图16为不同释放天数的微胶囊处理对小麦根腐病菌菌丝的抑制效果，表18为不同释放天数的吡唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病菌的抑制率。由图16和表18可知，吡唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病菌菌丝的抑制速率明显低于吡唑醚菌酯原药，处理0天时接菌，吡唑醚菌酯sa微胶囊的ec50为26.83μg/ml，原药则为0.097μg/ml。随着时间的延长，微胶囊中的药效成分缓慢释放，微胶囊逐渐呈现其缓释性能，主要表现在对菌丝生长的抑制效果逐渐加强，16d时的ec50略微变大，是前期释放的有效成分药效减弱导致。
[0184]
表16吡唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病菌的抑制率
[0185][0186]
图17为吡唑醚菌酯原药和吡释放12天时的唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病菌的抑制效果对比，表17为原药及不同释放天数的吡唑醚菌酯sa微胶囊对小麦根腐病菌的ec50测定结果。图17和表17 结果显示，微胶囊释放天数为12d时对菌丝生长的抑制效果达到最大，抑制效果接近原药。根据抑制率利用spss软件计算得到毒力回归方程、ec50、95％置信区间及相关系数等值。12d时微胶囊ec50为 0.1109μg/ml，接近原药的ec50值，所以综合考虑，吡唑醚菌酯sa 微胶囊处理12d时效果最好，能够对菌丝生长达到最大的抑制效果。
[0187]
表17微胶囊与原药对小麦根腐病菌的ec50测定结果
[0188][0189][0190]
为排除海藻酸钠对小麦根腐病菌的抑制作用，试验设置了海藻酸钠处理组和蒸馏水空白对照组，图18是处理组和对照组的菌丝生长情况，均为菌落接种3天后的菌丝生长情况，由图中可以看到，相同时间内海藻酸钠处理组的小麦根腐病菌菌丝与蒸馏水空白对照组的菌丝生长情况接近一致，菌落形态无明显差别，由此可以排除海藻酸钠对小麦根腐病菌的影响作用。
[0191]
上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原料的前提下，可以做适当的改进，这些改进也在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种基于海藻酸钠的吡唑醚菌酯微胶囊的制备方法，其特征在于，包含如下制备步骤：a、准确称取吡唑醚菌酯原药于烧杯中，向其中加入乙酸乙酯，置于磁力搅拌器上搅拌至原药完全溶解；b、向烧杯中滴加入乳化剂a-110和纯水，保持400 r/min的搅拌速度，均匀乳化10-20min；其中乳化剂a-110与纯水的质量比为1:9-11；c、称取海藻酸钠至于烧杯中，加入纯水，将烧杯置于60℃水浴中，保持恒温搅拌至海藻酸钠全部溶解后用纯水定容，利用超声波清洗机超声脱气处理溶液中的气泡后，再次置于磁力搅拌器上，保持400 r/min的速度继续搅拌；其中海藻酸钠溶液质量浓度1%；d、利用滴定管，将b中充分乳化后的含药溶液缓慢滴加入到海藻酸钠溶液中，在磁力搅拌器上匀速搅拌至充分混匀后，再次超声脱气处理；e、取d步骤的混合液于烧杯中，滴加入质量浓度为5%的碳酸钙-水混合溶液，混合搅拌；其中滴加在3 min中内添加完毕；f、另取液体石蜡于研磨杯中，向其中加入乳化剂a-110，利用多用分散研磨机保持1000 r/min的搅拌速度，预搅拌5 min；g、乳化阶段：待液体石蜡和乳化剂混合均匀后，保持1000 r/min转速不变，利用滴定管将步骤e中混合液均匀缓慢的滴加到液体石蜡中，继续均匀搅拌10 min；h、交联反应阶段：保持1000 r/min转速不变，再取含87.5 mmol/l冰醋酸的石蜡油，滴加入到步骤g的混合液中，使混合溶液充分交联反应；i、反应结束后，利用ph为4.5的醋酸盐缓冲液充分洗涤油相，再利用分液漏斗分离出微胶囊浆液，分装于离心管中；j、将微胶囊浆液在-4℃、10000 r/min下高速离心后，倒掉上清液，放置于4℃预冻1 h后，放置在-20℃下预冻3 h，最后将离心管放置在真空冷冻干燥机里，-50℃下冷冻干燥42 h得到微胶囊干粉，密封保存待用；其中：吡唑醚菌酯与乙酸乙酯的质量比为1:1-2；吡唑醚菌酯与海藻酸钠的质量比为1:1-4；海藻酸钠与碳酸钙的质量比为3-5:1；冰醋酸和碳酸钙的摩尔比为3-4:1；步骤f中，液体石蜡与乳化剂a-110的质量比为9:1；油相与水相的体积比为5-7:1。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，吡唑醚菌酯与乙酸乙酯的质量比为1:1.5；吡唑醚菌酯与海藻酸钠的质量比为1:2；海藻酸钠与碳酸钙的质量比为3.9:1；冰醋酸和碳酸钙的摩尔比为3.5:1；步骤f中，液体石蜡与乳化剂a-110的质量比为9:1；油相与水相的体积比为6:1。3.一种基于海藻酸钠的吡唑醚菌酯微胶囊，其特征在于，采用权利要求1或2所述的制
备方法制备获得。4.根据权利要求3所述的吡唑醚菌酯微胶囊用于作物病害防治的用途，其特征在于所述的病害为小麦根腐病菌。
技术总结本发明提供一种基于海藻酸钠的吡唑醚菌酯微胶囊的制备方法在25℃下，将经乙酸乙酯溶解的吡唑醚菌酯原药、1%海藻酸钠水溶液以及5%碳酸钙水溶液混合，并将混合溶液与含10%乳化剂A-110的液体石蜡混匀，保持1000 r/min的剪切速率乳化10 min；再利用87.5 mmol/L的冰醋酸降低混合相pH，使得离子之间发生交联反应形成微胶囊；最后利用pH为4.5的醋酸盐缓冲液洗涤分离出微胶囊浆液，经离心、冷冻干燥从而制备出吡唑醚菌酯SA微胶囊。本发明制备的吡唑醚菌酯微胶囊具有优异的制剂性能，可用于小麦根腐病菌的防治。腐病菌的防治。腐病菌的防治。
技术研发人员：张承启 王梦秋 迟雨 陈莉 苏贤岩 任学祥 叶正和
受保护的技术使用者：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
技术研发日：2022.04.19
技术公布日：2022/7/5
