1.本发明属于荧光探针检测技术领域，具体涉及一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针及其制备方法，同时涉及该荧光探针在荧光成像中的应用应用。
背景技术：2.黑色素瘤是一种侵袭性很强的皮肤恶性肿瘤，具有快速生长和早期转移的特点。统计显示，黑色素瘤晚期时5年相对生存率为23%。目前黑素瘤的临床治疗仍以手术切除为主，而对黑素瘤精准诊断是临床黑素瘤治疗的关键。生物标志物激活的荧光探针，特别是近红外(nir)荧光探针为黑素瘤的诊断提供了强有力的手段。近年来，国内外研究者开发了多种黑素瘤特征因子激活的荧光探针用于黑素瘤特异性荧光成像检测（王晨羽等，中华皮肤科杂志，2021, 54, 60-63；li, z. et al., anal. chem.2018, 90, 3666
–
3669; park, s. y. et al., sensors and actuators b: chemical, 2020, 319, 128306）。然而，目前已开发的荧光探针通常仅对黑素瘤中单一的特征因子进行响应，易产生“假阳性”信号的干扰（wu, l. et al.,nat. rev. chem.2021, 5, 406-421）。因此，开发对黑素瘤中多种特征因子响应的近红外荧光探针对于黑素瘤的精准成像检测具有重大意义。
3.酪氨酸酶是一种多功能、糖基化的黑色素细胞特异性含铜氧化酶，主要存在于细胞器黑素体中，通过介导酪氨酸氧化成一些醌类的而引发黑色素的形成。研究表明，酪氨酸酶在与酪氨酸相关的生理过程中发挥着重要作用，黑色素瘤中酪氨酸酶含量远高于正常细胞和组织。由于酪氨酸酶在黑色素瘤细胞中过量表达，酪氨酸酶被作为黑色素瘤诊断和预后的独立生物标志物。此外，过氧化氢（h2o2）是生物体内最稳定的活性氧（ros）。作为信号分子和氧化还原稳态的维持者，低水平的h2o2调控细胞的生长、增殖、迁移等多种生理过程。然而，高浓度的h2o2会促进氧化应激导致癌症等各种疾病的发展。黑色素瘤中h2o2的含量是正常细胞的10倍。因此，构建黑色素瘤中的酪氨酸酶和h2o2共同激活的荧光探针，可有效地区分黑色素瘤和正常组织，对黑色素瘤的成像检测具有重要意义。
4.
技术实现要素：本发明的目的在于提供一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针；本发明的另一目的是提供该荧光探针的制备方法及其应用。
5.一、酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针及其制备本发明酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针，结构式为：
其中：取代基r1，r2，r3为h、甲基、乙基、丙基、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基；取代基r4为h、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、巯基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基；x-为碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子、碳酸根离子或亚硫酸根离子；n为1~20的整数；y为氧醚基、巯基或亚氨基。
6.本发明酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，是将半花菁类化合物、碱和三光气加入到有机溶剂中，0~25℃下反应0.01~1小时后，再加入硼酸酯类化合物，在0~80℃下反应0.1~20小时后减压浓缩，柱层析分离即得。
7.所述半花菁类化合物的结构式如下：其中，取代基r4为h、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、巯基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基；x-为碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子、碳酸根离子或亚硫酸根离子；n为1~20的整；y为羟基、巯基或氨基。半花菁类化合物的制备方法见文献（anal. chem.,2021, 93, 15080
−
15087）。
8.所述硼酸酯类化合物的结构式如下：
其中，取代基r1，r2，r3为h、甲基、乙基、丙基、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基。
9.所述半花菁类化合物和硼酸酯类化合物的摩尔比为1:0.2~1:5；所述半花菁类化合物与三光气的摩尔比为1:0.1~1:0.5；所述半花菁类化合物与碱的摩尔比为1:1~1:5。
10.所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜、n, n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、苯、甲苯、二甲苯、氯苯、甲醇、乙醇、三氯甲烷中至少一种，优选二氯甲烷。
11.所述碱为有机碱或无机碱；其中有机碱为三乙胺、吡啶或4-二甲胺基吡啶；无机碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、碳酸铯、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸钡；优选4-二甲胺基吡啶。
12.二、荧光探针在荧光成像中的应用本发明中的近红外荧光探针，可同时响应酪氨酸酶和h2o2两种黑色素瘤特征因子，利用近红外荧光信号穿透性强、背景干扰小等优势有利于细胞或体内黑色素瘤的成像分析。下面以制备的荧光探针7为例说明本发明荧光探针在荧光成像中的应用。
13.1、荧光探针的肿瘤细胞成像分析中的应用首先将a549细胞在37℃，21 %氧气，5％二氧化碳环境的细胞培养箱中培养24小时后，用胰酶消化细胞转移到细胞成像皿中，分为实验组和对照组。实验组加入本发明实施例1制备的近红外荧光探针7溶液、酪氨酸酶和h2o2；对照组a仅加入本发明实施例1制备的近红外荧光探针7溶液；对照组b加入本发明实施例1制备的近红外荧光探针7溶液和h2o2；对照组c加入本发明实施例1制备的近红外荧光探针7溶液和酪氨酸酶。将上述四组细胞继续在37℃，5%二氧化碳环境的细胞培养箱中培养4小时后，用pbs缓冲液洗去成像皿里的培养基，用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光成像。从图5中可以看出，实验组细胞表现出较强荧光，表明探针能进入细胞并被酪氨酸酶和h2o2激活产生显著荧光信号。与之相比，对照组细胞中未见明显的荧光信号，说明机制干扰较小。
14.2、近红外荧光探针的肿瘤活体荧光成像分析中的应用通过给两只荷瘤小鼠瘤内注射0.1ml浓度为100 μm的近红外荧光探针7后，对照组小鼠注射0.1 ml 生理盐水，给药组小鼠注射0.1 ml酪氨酸酶和h2o2的混合溶液，将上述小鼠给药后8 h后，使用小动物活体荧光成像仪进行荧光成像，结果如图6所示。图6中1号小鼠为对照组小鼠，2号小鼠为给药组小鼠。由图可以看出，给药组小鼠肿瘤部位荧光信号较为显著，与之相比，对照组小鼠肿瘤部位未见荧光信号。这是由于给药组小鼠中探针和酪氨酸酶和h2o2相互作用导致近红外荧光信号点亮，实现动物体内肿瘤的成像分析。
15.半花菁类化合物具有近红外荧光发射性能，本发明将荧光基团半花菁类化合物与猝灭基团硼酸酯类化合物连接，由于硼酸酯类化合物猝灭了荧光基团半花菁类化合物的荧光，使得半花菁类化合物无荧光发射性能。在硼酸酯基团被肿瘤中高浓度的h2o2激活后，中间产物进一步被酪氨酸酶活化，释放荧光基团半花菁类化合物。通过这种级联激活，荧光基团半花菁类化合物点亮近红外荧光信号，实现对酪氨酸酶和h2o2两种黑色素瘤特征因子的同时检测。相较与目前已开发的仅对肿瘤中单一的特征因子（酪氨酸酶、h2o2、微酸和缺氧等）激活型的荧光探针，本发明所提供的双响应型近红外荧光探针，可同时响应肿瘤中的酪氨酸酶和h2o2这两种特征因子，对肿瘤的选择性高、灵敏性强，对于黑素瘤的精准检测方面具有重要意义。
16.本发明的有益效果为：
1、本发明所提供的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针，具有结构新颖、靶向性高、灵敏性强和成像性能好等优点，可同时响应黑色素瘤中的酪氨酸酶和h2o2这两种特征因子，避免产生“假阳性”信号的干扰，可实现黑色素瘤的高选择性荧光成像分析。
17.2、本发明所提供的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，合成工艺简单有效，可以高产率、高纯度的得到荧光探针。
18.3、鉴于良好的成像性能，本技术所提供的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针，对于推动黑色素瘤的成像检测具有重要意义，在可视化检测领域有潜在的应用价值。
附图说明
19.图1是本发明制备的化合物5的核磁共振氢谱图；图2是本发明制备的化合物5的核磁共振碳谱图；图3是本发明制备的荧光探针7的核磁共振氢谱图；图4是本发明制备的荧光探针7的核磁共振碳谱图；图5是本发明近红外荧光探针7在a549细胞的成像图；图6是本发明近红外荧光探针7在荷瘤小鼠体内成像图。
具体实施方式
20.下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
21.下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例
22.（1）化合物5的制备：在圆底烧瓶中，加入化合物3（1.0 mmol）和化合物4（1.1 mmol），加入干燥的乙腈（10 ml）后，再加入碳酸钾（3 mmol）。在氮气保护下室温搅拌30分钟后，在60℃下继续反应5小时后，过滤、干燥、柱层析分离得到化合物5；反应式如下：
120.7, 117.0, 114.9, 114.7, 114.2, 104.3, 84.1, 69.4, 50.8, 33.1, 30.1, 27.6, 25.1。荧光成像结果如图5、图6。
技术特征：1.一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针，结构式为：其中：取代基r1，r2，r3为h、甲基、乙基、丙基、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基；取代基r4为h、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、巯基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基；x-为碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子、碳酸根离子或亚硫酸根离子；n为1~20的整数；y为氧醚基、巯基或亚氨基。2.如权利要求1所述的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，是将半花菁类化合物、碱和三光气加入到有机溶剂中，0~25℃下反应0.01~1小时后，再加入硼酸酯类化合物，在0~80℃下反应0.1~20小时后减压浓缩，柱层析分离即得；所述半花菁类化合物的结构式如下：其中，取代基r4为h、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、巯基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基；x-为碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子、碳酸根离子或亚硫酸根离子；n为1~20的整；y为羟基、巯基或氨基；所述硼酸酯类化合物的结构式如下：
其中，取代基r1，r2，r3为h、甲基、乙基、丙基、甲氧基、羟基、硝基、氨基、卤素、醛基、羧基、磺酸基、巯基、酯基、氰基、酰胺基或炔基。3.如权利要求2所述的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述半花菁类化合物和硼酸酯类化合物的摩尔比为1:0.2~1:5。4.如权利要求2所述的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜、n, n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、苯、甲苯、二甲苯、氯苯、甲醇、乙醇、三氯甲烷中至少一种。5.如权利要求2所述的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述碱为有机碱或无机碱；其中有机碱为三乙胺、吡啶或4-二甲胺基吡啶；无机碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、碳酸铯、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸钡。6.如权利要求2所述的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述半花菁类化合物与三光气的摩尔比为1:0.1~1:0.5。7.如权利要求2所述的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述半花菁类化合物与碱的摩尔比为1:1~1:5。8.如权利要求1所述的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针在制备荧光成像试剂中的应用。
技术总结本发明公开了一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针，是将半花菁类化合物与硼酸酯类化合物连接制备而得，该探针在酪氨酸酶和过氧化氢共同作用下，高灵敏、高选择性地点亮近红外荧光信号，同时响应黑色素瘤中的酪氨酸酶和H2O2这两种特征因子，避免产生“假阳性”信号的干扰，可实现黑色素瘤的高选择性荧光成像分析。本发明的一种酪氨酸酶和过氧化氢双响应型的近红外荧光探针具有结构新颖、合成工艺简单快捷、靶向性高和成像性能好等优点，对于推动肿瘤的精准诊断具有重要意义。对于推动肿瘤的精准诊断具有重要意义。
技术研发人员：乌丹 蔡天山 朱腾飞 何超 李玉娟
受保护的技术使用者：兰州大学第一医院
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
